Introduction
Et grundlæggende mål for regenerativ medicin er dannelsen af nye, funktionelle celler, der kan bruges til at reparere eller udskifte beskadigede, degenereret væv. Genskabe let tilgængelige voksne celler til nye, ved at konvertere dem fra en celle til en anden, er en særlig tiltalende tilgang, især når den krævede cellepopulation er ikke rigelige eller svært tilgængelige. Men voksne celler er bemærkelsesværdigt stabil. De får deres differentierede tilstand gennem en gradvis begrænsning i deres muligheder, og når de når den modne terminal specialisering de stabilt beholde det en.
I de seneste år er der udviklet en række protokoller, der gør det muligt for omprogrammering til pluripotens af en somatisk celle (IPS) opnås gennem den tvungne udtryk for et sæt af transskription faktorer 2,3. Alternativt kan celle konvertering opnås ved direkte afstamning transdifferentiering, at indføre en enkelt 4 5-7. Denne strategi indebærer ikke overgangen gennem en de-differentieret tilstand, men kræver høj ekspression af specifikke transkriptionsfaktorer 8.
Vi har for nylig udviklet en konvertering protokol baseret på den korte eksponering af voksne celler til demethylering egenskaber af cytidinanalog 5-azacytidin (5-aza-CR), en velkarakteriseret DNA methyltransferase inhibitor. Demethyleringen trin efterfølges umiddelbart af en specifik differentiering protokol 9-11 gør det muligt at opnå den ønskede terminal fænotype. Denne metode kan konvertere modne, differentierede celler til celler af en anden slægt og har den væsentlige fordel at undgå både anvendelsen af virale vektorer og transfektion af eventuelle exogene transkriptionsfaktorer. Købet af en stabil pluripotent tilstand, og den relaterede øget modtagelighed til celle ustabilitet er også undgået.
9-13 samt i hunden (manuskript indsendt) antyder en bred effekt og robusthed tilgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Alle de nedenfor beskrevne procedurer skal udføres under laminar flow hætte i sterile forhold. Sørg for at alle kultur procedurer gennemføres på termostatstyret etaper og celler holdes ved 37 ° C overalt i håndtering.
1. hudfibroblast- Isolation
- Forbered dyrkningsskål Coating Solution
- Opløs 0,1 g porcin gelatine i 100 ml vand (slutkoncentration 0,1%). Sterilisere opløsningen med autoklaven.
- Tilsættes 1,5 ml steril 0,1% porcin gelatine til 35 mm petriskåle. Vente 2 timer til pels, vedligeholde dem ved stuetemperatur.
Bemærk: Menneske hudbiopsier opsamles ved excision under lokalbedøvelse fra et avaskulært område i den forreste del af underarmen og opbevaret i Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (PBS) suppleret med 2% antibiotikum antimykotisk opløsning ved 4 ° C før brug.
- Vask biopsier med ny PBS suppleret med 2% antibiotisk antimykotisk opløsning.
- Placer biopsier i en 100 mm petriskål og skæres i ca. 2 mm 3 fragmenter med sterile skalpeller.
- Fjern overtræksopløsningen overskydende umiddelbart før udpladning fragmenter.
- Placer 5-6 hud fragmenter i den præ-coatede 35 mm petriskål.
- Forbered fibroblast dyrkningsmedium: 77% Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) høj glucose, 20% føtalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin-opløsning og 2% antibiotikum antimykotisk opløsning.
- Tilføj en dråbe fibroblast medium over hver fragment (sædvanligvis 100 pi pr fragment) og kultur dem ved 37 ° C i 5% CO2.
- Efter 24 timer tilsættes 500 pi fibroblast dyrkningsmedium løbet fragmenterne for at holde dem våd ved 37 ° C i 5% CO2.
- Skift mediet med en pipette mindst en gang hver 48 timer.
- Efter 6 dages inkubation fjernes vævsfragmenter omhyggeligt og kassere dem.
Bemærk: Efter 6 dage, fibroblasts begynder at vokse ud af vævsfragmenter og begynder at danne en celle monolag. - Genopfriske medium, tilsættes 2 ml fibroblast dyrkningsmedium og fortsætte cellemonolaget dyrkning ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator.
2. fibroblast Kultur
- Kultur fibroblaster ved 37 ° C i 5% CO2, indtil 80% konfluens
- For passage, aspireres fibroblast dyrkningsmedium fra vævskulturskåle. Vask cellerne tre gange med 4 ml PBS suppleret med 1% antibiotisk antimykotisk opløsning.
- Tilføj et tyndt lag (10% af dyrkningsmediet volumen) trypsin-EDTA-opløsning (0,5 g / L porcin trypsin og 0,2 g / l EDTA) og inkuberes ved 37 ° C, indtil cellemonolaget begynder at løsne sig fra bunden af vævet dyrkningsskål og cellerne dissocieres.
- Fortynd cellesuspensionen med 9 dele fibroblast dyrkningsmedium for at neutralisere trypsin handling. Centrifugering er ikke nødvendig.
- Plate celler i nye kultur retter (medud gelatine) og dyrkning ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator. Hold passagen forholdet mellem 1: 2 og 1: 4, afhængigt af væksthastighed.
- Når cellerne når omkring 80% konfluens, passage dem (normalt to gange om ugen).
3. fibroblast Plating for Epigenetisk Conversion
- Tilføj 0,26 ml / cm2 af 0,1% porcint gelatine (forberede som beskrevet i 1.1) til celle dyrkningsskåle. Vente 2 timer til pels.
- Fjern overtræksopløsningen overskydende 10-30 min før udpladning fibroblaster.
- Fjern fibroblast dyrkningsmedium fra dyrkningsskåle. Vask cellerne tre gange med PBS suppleret med 1% antibiotisk antimykotisk opløsning.
- Tilføj et tyndt lag (10% af dyrkningsmediet volumen) trypsin-EDTA-opløsning (0,5 g / L porcin trypsin og 0,2 g / l EDTA) og inkuberes ved 37 ° C, indtil cellemonolaget begynder at løsne sig fra bunden af vævet dyrkningsskål og cellerne dissocieres.
- Fortynd cellesuspensionen med 9 dele fibroblast dyrkningsmedium at neutralisere trypsin handling.
- Tæl celler under anvendelse af et tællekammer under mikroskop ved stuetemperatur. Beregn den nødvendige mængde af fibroblast dyrkningsmedium at resuspendere celler, til opnåelse af en cellekoncentration på 7,8 x 10 4 fibroblaster / cm2. Dette vil afhænge af den specifikke type kammer anvendes.
Celler / pl = Gennemsnitligt antal celle pr lille gitter x 90 (multiplikationsfaktor) x fortynding - Centrifuger cellesuspensionen ved 150 g i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og resuspender cellerne med den tidligere beregnede volumen af fibroblast dyrkningsmedium.
- Plate celler på 0,1% gelatine præcoatede retter og kultur dem i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator.
4. Forhøjelse Cell Plasticitet Brug af De-methylering Agent 5-aza-CR
- dag 0
- Forbered 5-aza-CR-stamopløsning ved at opløse 2,44 mg 5-aza-CR i 10 ml DMEM høj glucose medium. Der steriliseres ved filtrering. Forbered 5-aza-CR lager umiddelbart før anvendelse.
- Fortynd 1 pi af 5-aza-CR stamopløsning i 1 ml fibroblast dyrkningsmedium (slutkoncentration 1 uM).
- At øge celle plasticitet, 24 timer efter celleudpladning (pos 3.8), fjernes dyrkningsmediet fra podet fibroblaster og der tilsættes 1 pM 5-aza-CR-stamopløsning og kultur i 18 timer ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator.
- dag 1
- Forbered frisk humant Pluripotente (HP) medium som beskrevet i tabel 1.
- Efter inkubering med 1 pM 5-aza-CR, fjern medium og vask cellerne tre gange med PBS for at sikre, at 5-aza-CR skylles væk.
- Inkuber 5-aza-CR behandlede fibroblaster med HP-medium i 3 timer (restitutionsperioden) ved 37 ° C i 5% CO2.
- Efter tilbagebetalingsperioden, fjerne medium, vaskes tre gange med PBS.
- For at overvåge effektiviteten af 5-aza-CR behandling, check i dette trin feller tilstedeværelsen af morfologiske ændringer (beskrevet i afsnittet Resultater). Celler mister den typiske langstrakte morfologi af fibroblaster og erhverve en rund eller oval form, bliver mindre i størrelse, med forstørrede kerner.
- Fortsæt med bugspytkirtlen differentiering.
5. bugspytkirtlen Differentiering Protocol
- Dage 1-6
- Forbered Pankreatisk Basal Medium som beskrevet i tabel 2.
- Forbered activin En stamopløsning: Opløs 5 ug activin Rekombinant humant protein i 166,6 pi sterilt vand.
- Kultur 5-aza-CR behandlede fibroblaster i 0,26 ml / cm2 af pancreas Basal Medium suppleret med 1 pl / ml aktivin En stamopløsning (se 5.1.2) i 6 dage ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator. Skift medium dagligt.
- Dage 7-8
- Forbered retinsyre stamopløsning ved tilsætning 16,6 ml dimethylsulfoxid (DMSO) til 50 mg af retinoid acid.
- Dyrke celler i 0,26 ml / cm2 af pancreas basalt medium suppleret med 1 pl / ml activin En stamopløsning (se 5.1.2) og 1 pl / ml retinsyre stamopløsning (se 5.2.1) i 2 dage ved 37 ° C i 5% CO2. Skift medium dagligt.
- Dage 9-36
- Dyrke celler i 0,26 ml / cm2 af pancreas basalt medium suppleret med 1% (v / v) Insulin-Transferrin-Selenium (ITS), 2% (vol / vol) B27 og 0,1% (v / v) Rekombinant human FGF basic (bFGF) stamopløsning (se tabel 1) ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator. Skift mediet dagligt i de første 15 dage.
- Fra dag 16 og fremefter, opdatere medium hver anden dag, under et mikroskop, idet dannelse aggregerede celler kan løsne sig fra bunden af dyrkningsskålen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering af primær kultur fra hudbiopsier
Hudbiopsier blev skåret i små stykker og anbringes i gelatine præcoatede skåle. Efter 6 dage fibroblaster begyndte at vokse ud af vævsfragmenter og dannede en cellemonolag (figur 1A). Celler viste en typisk langstrakt form og, som forventet, viste en ensartet immun-positivitet for fibroblast markør vimentin (Vim, figur 1 B).
Morfologiske ændringer og methylering mønster af hudfibroblaster efter 18 timers udsættelse for 5-aza-CR
At opnå en succesfuld epigenetisk omdannelse af fibroblaster til insulinproducerende celler, vi øget deres plasticitet ved anvendelse af de-methyleringsmiddel, 5-aza-CR. Humane fibroblaster blev udpladet på 0,1% gelatine pre-coatede skåle i en koncentration på 7,8 x 10 4 fibroblaster / cm2. Fireogtyve timer efter podning celler wførend inkuberet med 1 um 5-aza-CR i 18 timer.
Ved afslutningen af denne behandling, en omfattende ændring af cellefænotype var synlig (Post 5-aza-CR, figur 2A). Den typiske aflange morfologi ubehandlede fibroblaster (T0, figur 2A), blev erstattet af en rund eller oval form og cellestørrelse blev betydeligt mindre. Cytoplasma var granulært, fladtrykt, og celler blev adhærerende til kulturen overflade. Nuclei optrådte større og vakuoliserede, som en konsekvens af den afslappede chromatinstruktur. Det er vores erfaring, at tilstedeværelsen af disse morfologiske ændringer er væsentligt og skal overvåges nøje som en markør for effektiviteten af 5-aza-CR-behandling.
Efter 18 h udsættelse for 5-aza-CR, et kraftigt fald af global DNA-methylering var også tydelig og blev klart demonstreret af den formindskede intensitet af 5-methylcytidin immunfarvning ( Morfologiske og funktionelle ændringer under epigenetisk omdannelse af hudfibroblaster i insulinproducerende celler Under det første trin blev celler dyrket i 7 dage i pancreas Basal Medium suppleret med activin A for at fremme endoderm engagement. I dette interval, celler yderligere flade og gradvist begyndte at organisere sig i klynger (dag 7, figur 3A). Efterfølgende blev pancreas afstamning differentiering fremmes ved tilsætning af retinsyre i 2 dage. Som reaktion på denne behandling, celler omarrangeret i en retikulære mønster og voksede i klart forskellige celle aggregater (Dag 10, figur 3A). Den clustering dannelse pprocesmodeller steg med tiden og blev yderligere stimuleret af den tredje og sidste trin, som bestod af celle udsættelse for B27, bFGF og ITS. Dette førte til ansættelse af et stigende antal celler, der sammenlægges i store 3D-kolonier (dag 20, figur 3A). Omkring dag 36, disse kolonier viste sig som distinkte runde strukturer minder om typiske pancreasøer in vitro (dag 36, figur 3A). Købet af den nye EpiCC fænotype blev ledsaget af en gradvis forøgelse af de globale DNA methylering niveauer, der vendte tilbage til dem, der observeres i ubehandlede fibroblaster (5 mC Dag 36 Figur 3B). Efter 36 dage med bugspytkirtlen induktion, blev effektiviteten af epigenetisk konvertering også påvist ved ekspression af typiske modne pancreas markører, som oprindeligt var målbart i ubehandlede fibroblaster (T0, Tabel 1: Materiale løsninger. Tabel 2: Materiale løsninger.
For at fremkalde bugspytkirtlen differentiering, blev 5-aza-CR behandlede fibroblaster udsat for en tre-trins protokol for bugspytkirtlen induktion, umiddelbart efter tilbagebetalingsperioden 3 timer. 
Figur 1: Isolering og karakterisering af humane hudfibroblaster (A) repræsentativt billede af fibroblaster vokser ud af vævsfragmenterne.. (B) Fibroblaster vise en ensartet immun-positivitet for deres sPECIFIKKE markør vimentin (Vim). Kerner farves med DAPI. (Scale barer, 100 um). Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 2: Morfologiske og methylering ændringer af humane hudfibroblaster efter 5-aza-CR-behandling (A) Repræsentative billeder af ubehandlede fibroblaster viser aflange (T0) og 5-aza-CR behandlede fibroblaster, der udviser en rund eller oval morfologi, granuleret. cytoplasma, og forstørrede og vakuoliserede kerner (post 5-aza-CR). (Scale barer, 100 um). (B) Et fald af global DNA-methylering kan spores efter 5-aza-CR-behandling (post 5-aza-CR). (Scale barer, 50 um). Venligst click her for at se en større version af dette tal. 
Figur 3:. Morfologiske og funktionelle ændringer i løbet epigenetisk konvertering (A) Repræsentative billeder af morfologiske ændringer, der finder sted i løbet af endokrine pancreas differentiering. Efter 7 dages induktion, humane celler gradvist organisere sig i klynger (dag 7). Som reaktion på tilsætningen af retinsyre, de omarrangere i en retikulære mønster og klynge i skelnelige aggregater (dag 10). Disse formationer fremskridt med tiden, rekruttere celler og aggregering i store 3D kolonier (dag 20). Endelig kolonier bliver sfæriske strukturer, der har tendens til at frigøre og flyde frit i dyrkningsmediet, der minder om typiske pancreasøer in vitro (dag 36). (Scale barer, 100 um). (B) Efter 36 dages pancreas iduktion, globale DNA methylering niveauer af humant EpiCC tilbagevenden til dem, der observeres i ubehandlede fibroblaster (5 mC Dag 36). (Scale bar, 50 um). Co-lokalisering af PDX1 med C-PEP er detekterbar ved slutningen af omstillingsperioden (dag 36), mens disse endokrine pancreas markører er helt fraværende i ubehandlede fibroblaster (t0). (Scale barer, 100 um). (C) EpiCC insulinfrigivelse som respons på 20 mM D-glucose og 20 mM L-glucose eksponering. Barer repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige gentagelser. Klik her for at se en større version af dette tal. Navn på Material / Udstyr Mængde (volumen / volumen) Kommentarer / Beskrivelse Hams F-10 Nutrient Mix 40% DMEM low glucose 40% KnockOut Serum Udskiftning 10% FBS 5% Antibiotika antimykotisk løsning 1% L-Glutamin opløsning 1% MEM ikke-essentielle aminosyrer Solution 1% 2-mercaptoethanol lager 1% 2-mercaptoethanol stamopløsningen: diluite 3,5 pi 2-mercaptoethanol i 5 ml sterilt PBS. Opbevares i mørke ved 4 ° C. Bemærk: Brug inden for 2 uger Nukleosid mix lager 1% nukleosid mix stamopløsningen: opløs 0,042 g Guanosin, 0,040 g Adenosin, 0,036 g cytidin 0,036 g Uridin og 0,012 g Timidine i 50 ml sterilt vand. Smelte ved 50 ° C til opløsning. Der steriliseres i Filtration og opbevares ved 4 ° C ESGRO (LIF) 0,1% Rekombinant human FGF basic (bFGF) lager 0,1% bFGF stamopløsningen: tilsættes 5 ml 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS ved 25 ug bFGF Navn på Material / Udstyr Mængde (volumen / volumen) Kommentarer / Beskrivelse DMEM / F-12 93% B-27 Supplement Minus Vitamin A 2% N-2 Supplement 1% MEM ikke-essentielle aminosyrer Solution 1% Antibiotikumantimykotisk løsning 1% 2-mercaptoethanol lager 1% 2-mercaptoethanol stamopløsningen: diluite 3,5 pi 2-mercaptoethanol i 5 ml sterilt PBS. Opbevares i mørke ved 4 ° C. Bemærk: Brug inden for 2 uger L-Glutamin opløsning 1% BSA lager 1% Udarbejdelse af BSA lager: opløses 250 mg i 50 ml vand. Der steriliseres ved filtrering og opbevares ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreliggende manuskript beskriver en fremgangsmåde, som tillader omdannelsen af humane hudfibroblaster i insulinproducerende celler, gennem en forbigående og kortvarig udsættelse for 5-aza-CR, efterfulgt af en vævsspecifik induktionsprotokol. Denne fremgangsmåde giver mulighed for et skift fra mesoderm til endoderm relaterede celler, uden tvungen udtryk for transkriptionsfaktorer eller microRNA eller erhvervelsen af en stabil pluripotent tilstand, der gør cellerne mere ustabil og udsat for fejl 14.
I det første trin, er celle plasticitet forøget takket være en syntetisk epigenetisk modifier, der inducerer en forbigående, reversibel eftergivende stat i terminalt differentierede celler. Især blev 5-aza-CR anvendes til at forårsage et fald i den globale methylering af hudfibroblastceller. 5-aza-CR er kendt for at direkte inhibere methyl-transferaseaktivitet og forhindre de novo methylering i nyligt syntetiseret DNA. På grund af sin effekt, dette molekyletidligere har været anvendt til at reaktivere tavse gener, såvel som at modificere differentieringsfaktorer tilstande af eukaryote celler 15,16. I overensstemmelse hermed sende 5-aza-CR hudfibroblaster viste en global DNA demethylering (figur 2A), hvilket indikerer 5-aza-CR evne til at øge plasticitet i de celler, der anvendes til de foreliggende eksperimenter. Dette er også i overensstemmelse med den observation, at 5-aza-CR letter udtryk for den høje plasticitet-relateret markør Oct-4 i neurosfære celler (NSC) 17. Det er imidlertid interessant at bemærke, at post-5-aza-CR hudfibroblaster vende tilbage til deres oprindelige fænotype efter fjernelse af 5-aza-CR. Faktisk vi tidligere vist, at fibroblaster tilbage til deres oprindelige dyrkningsmedium, ned reguleret ekspression af pluripotens-relaterede faktorer 9,10, hvilket indikerer, at den højere plasticitet tilstand erhvervet, som svar på den epigenetiske modifier, er forbigående, reversible og ikke indebærer permanente modifikationer af than celler.
Markante ændringer i cellemorfologi ledsaget induktion af en højere plasticitet tilstand (figur 2A). De typiske langstrakt cellelegemer af de ubehandlede fibroblastceller blev erstattet af runde eller ovale celler, der præsenterede mindre dimensioner og en øget kerner volumen, som optrådte større end differentierede celler. Niwa korreleret denne nukleare udvidelse til en afslappet kromatinstruktur beskrevet som en pluripotens-relaterede funktion 18. Tilstedeværelsen af vakuoliserede kerner og granulært cytoplasma, samt en forøget flatten morfologi, var evidente. Alle de morfologiske ændringer, der er beskrevet, kan i praksis anvendes som markør for en vellykket gennemførelse af den første del af konverteringen protokollen; i vores erfaring, når ændringerne er til stede, har 5-aza-CR faktisk hjulpet celler at erhverve en mere tolerant stat.
Det er muligt at drage fordel af denne forbigående "høje permissivity tid-vindue "til at køre celler mod en helt anden fænotype. Den nuværende protokol viser, at efter 5-aza-CR fibroblaster kan genbruges rettet til pancreas beta celle-lignende celler, som reaktion på en specifik differentiering medium. Den anvendte protokol tillade celler at skifte fra en mesoderm afledt celletype til en cellepopulation, der tilhører endoderm afstamning.
Insulin, som oprindeligt var upåviselig i ubehandlede hudfibroblaster, var positiv ved afslutningen af differentiering protokol (figur 3B). Dette var ledsaget af en samtidig udtryk for andre faktorer, såsom PDX1, der er involveret i differentieringen af hele bugspytkirtlen - dens eksokrine, endokrine og duktalt cellepopulationer, ved siden af den specifikke beta-celle afstamning. Dette er i overensstemmelse med tidligere arbejde på mus embryonale stamceller (ESC), der angiver, at en ordentlig differentiering i beta-celler blev opnået, når umodne celler blev lagdelt med other endokrine celler 19, hvilket tyder på, at det lokale mikro-miljø, som den pancreas-ø af Langerhans arkitektur har en stærk funktionel rolle.
Faktisk EpiCC opnåede en moden differentieret fænotype og viste evnen til at reagere på 20 mM glucose eksponering (figur 3). Insulin var aktivt secerneres i dyrkningsmediet efter 1 time af D-glucose stimulation, bekræfter bona fide karakter EpiCC som insulinproducerende dem (figur 3C).
En særskilt krav for en vellykket procedure er den streng opretholdelse af celler ved 37 ° C, ved alle trin, herunder deres håndtering under sterile laminar strømning og mikroskopet. Det er vores erfaring, er det også stærkt anbefales at forberede reagenser frisk, forud for deres anvendelse i kultur og at opdatere medium i nøje overensstemmelse med protokollen. Denne operation skal udføres under et mikroskop, da danner samlede cellerkan løsne sig fra bunden af dyrkningsskålen og tabt under udskiftning af medium.
Den epigenetiske omdannelse protokollen er også blevet anvendt med succes til svin samt til hunden (manuskript indsendt) under anvendelse af samme celleantal / cm2 og de-methyleringsmiddel koncentration beskrevet for mennesker.
Afslutningsvis er en protokol, der tillader omdannelsen af huden fibroblaster til en anden celletype præsenteres her. Den beskrevne strategi har fordelene ved en epigenetisk-baserede celle konvertering: nemlig muligheden for at undgå en pluripotent tilstand, der kan efterlade celler, som kan fremkalde kræft; fjernelse af eksogene genetiske faktorer, der kan forårsage dvælende forandringer i cellerne. Disse fordele gør den nuværende fremgangsmåde særdeles lovende for translationelle medicin applikationer og giver mulighed for patient specifik celleterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Carraresi Foundation og Det Europæiske Institut for Studiet af Diabetes (EFSD). GP er understøttet af en post-doc stipendium af universitetet i Milano. Forfatterne er medlemmer af COST Action FA1201 Epiconcept: Epigenetik og Periconception miljø og COST Action BM1308 Deling forskud på store dyremodeller (SALAAM). TALB er medlem af COST Action CM1406 Epigenetisk Chemical Biology (EPICHEM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
- Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
- Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
- Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
- Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
- Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).
