Introduction
पुनर्योजी दवा के एक मौलिक उद्देश्य नया, कार्यात्मक कोशिकाओं है कि मरम्मत या क्षतिग्रस्त की जगह इस्तेमाल किया जा सकता है की पीढ़ी है, ऊतकों गयी। नए लोगों में आसानी से उपलब्ध वयस्क कोशिकाओं Remaking, उन्हें एक सेल प्रकार से दूसरे में परिवर्तित करके, एक विशेष रूप से आकर्षक दृष्टिकोण है, खासकर जब आवश्यक सेल की आबादी प्रचुर मात्रा में या उपयोग करने के लिए मुश्किल नहीं है। हालांकि, वयस्क कोशिकाओं उल्लेखनीय स्थिर रहे हैं। वे अपने विकल्पों में एक क्रमिक प्रतिबंध के माध्यम से उनके अलग-अलग राज्य हासिल करने और, एक बार वे परिपक्व टर्मिनल विशेषज्ञता तक पहुँचने, वे स्थिरतापूर्वक यह 1 बरकरार रहती है।
पिछले साल प्रोटोकॉल की एक संख्या विकसित किया गया है, कि एक दैहिक कोशिका (आईपीएस) के pluripotency को reprogramming सक्षम में प्रतिलेखन कारक का एक सेट 2,3 के लिए मजबूर अभिव्यक्ति के माध्यम से हासिल की। वैकल्पिक रूप से, सेल रूपांतरण प्रत्यक्ष वंश transdifferentiation द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, एक एकल 4 शुरू 5-7 कारकों। इस रणनीति के एक डे भेदभाव राज्य के माध्यम से संक्रमण को शामिल नहीं करता है, लेकिन विशिष्ट प्रतिलेखन कारक 8 उच्च अभिव्यक्ति की आवश्यकता है।
हमने हाल ही में एक रूपांतरण cytidine अनुरूप 5-azacytidine (5-Aza-सीआर), एक अच्छी तरह से विशेषता डीएनए मिथाइल अवरोध के demethylating संपत्तियों को वयस्क कोशिकाओं का संक्षिप्त प्रदर्शन के आधार पर प्रोटोकॉल विकसित किया है। Demethylation कदम तुरंत एक विशिष्ट भेदभाव प्रोटोकॉल 9-11 आवश्यक है कि टर्मिनल phenotype प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है द्वारा पीछा किया जाता है। इस विधि को एक अलग वंश की कोशिकाओं में परिपक्व, विभेदित कोशिकाओं में परिवर्तित करने में सक्षम है और पर्याप्त लाभ दोनों वायरल वैक्टर का उपयोग करें और किसी भी बहिर्जात प्रतिलेखन कारक के अभिकर्मक से बचने के लिए किया है। एक स्थिर pluripotent राज्य के अधिग्रहण, और संबंधित वृद्धि हुई अस्थिरता सेल के लिए संवेदनशीलता भी बचा है।
9-13 में और साथ ही कुत्ते में इस्तेमाल किया गया है।
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Protocol
नोट: सभी नीचे वर्णित प्रक्रियाओं बाँझ परिस्थितियों में लामिना का प्रवाह हुड के तहत किया जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि सभी प्रक्रियाओं संस्कृति अपने को संभालने के दौरान thermostatically नियंत्रित चरणों पर बाहर किया जाता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखा जाता है सुनिश्चित करें।
1. त्वचा तंतुकोशिका अलगाव
- संस्कृति डिश कोटिंग समाधान तैयार
- पानी (अंतिम एकाग्रता 0.1%) की 100 मिलीलीटर में सुअर का जिलेटिन की 0.1 ग्राम भंग। आटोक्लेव के साथ समाधान जीवाणुरहित।
- 35 मिमी पेट्री डिश के लिए बाँझ 0.1% सुअर जिलेटिन की 1.5 मिलीलीटर जोड़ें। कोट करने के लिए 2 घंटा रुको, उन्हें कमरे के तापमान पर बनाए रखने।
नोट: मानव त्वचा बायोप्सी प्रकोष्ठ के पूर्वकाल पहलू का एक avascular क्षेत्र से स्थानीय संज्ञाहरण के तहत छांटना द्वारा एकत्र की है और Dulbecco फास्फेट बफर खारा (पीबीएस) 4 डिग्री सेल्सियस पर 2% एंटीबायोटिक कवकनाशी समाधान के साथ पूरक का उपयोग करने से पहले में जमा हो जाती है।
- नई पीबीएस के साथ धो बायोप्सी 2% antibi के साथ पूरककान का कवकनाशी समाधान।
- एक 100 मिमी पेट्री डिश में रखें बायोप्सी और बाँझ नलियां के साथ लगभग 2 मिमी 3 टुकड़ों में काट दिया।
- कोटिंग समाधान अतिरिक्त तुरंत टुकड़े चढ़ाना करने से पहले निकालें।
- 5-6 त्वचा टुकड़े पूर्व लेपित 35 मिमी पेट्री डिश में रखें।
- fibroblast संस्कृति के माध्यम से तैयार: 77% Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) उच्च ग्लूकोज, 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% एल Glutamine समाधान और 2% एंटीबायोटिक कवकनाशी समाधान।
- 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक टुकड़ा (आमतौर पर टुकड़ा प्रति 100 μl) और उन्हें संस्कृति पर fibroblast माध्यम की एक छोटी बूंद जोड़ें।
- 24 घंटे के बाद, 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें गीला रखने के लिए के टुकड़े के ऊपर fibroblast संस्कृति के माध्यम से 500 μl जोड़ें।
- एक पिपेट कम से कम एक बार हर 48 घंटा के साथ मध्यम बदलें।
- ऊष्मायन के 6 दिन बाद, ध्यान से ऊतक टुकड़े को हटाने और उन्हें त्यागें।
नोट: 6 दिनों के बाद, fibroblastएस ऊतक टुकड़े से बाहर हो जाना और एक सेल monolayer फार्म करने के लिए शुरू करने के लिए शुरू करते हैं। - ताज़ा करे मध्यम, fibroblast संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ने और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल monolayer संस्कृति जारी है।
2. तंतुकोशिका संस्कृति
- 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति fibroblasts जब तक 80% संगम
- passaging, टिशू कल्चर व्यंजन से महाप्राण fibroblast संस्कृति के माध्यम लिए। कोशिकाओं पीबीएस के 4 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं 1% एंटीबायोटिक कवकनाशी समाधान के साथ पूरक।
- trypsin-EDTA समाधान (0.5 ग्राम / एल सुअर का trypsin और 0.2 ग्राम / एल EDTA) की एक पतली परत (संस्कृति के माध्यम मात्रा का 10%) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक सेल monolayer ऊतक के नीचे से अलग करने के लिए शुरू होता है संस्कृति पकवान और कोशिकाओं को अलग कर देना।
- fibroblast संस्कृति के माध्यम से 9 भागों के साथ सेल निलंबन पतला trypsin कार्रवाई बेअसर। Centrifugation आवश्यक नहीं है।
- नई संस्कृति बर्तन में प्लेट कोशिकाओं (के साथबाहर जिलेटिन) और संस्कृति 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर। विकास दर पर निर्भर करता है, 4: 2 और 1: 1 के बीच पारित होने के अनुपात रखें।
- कोशिकाओं (प्रति सप्ताह आम तौर पर दो बार) लगभग 80% संगम, उन्हें पारित होने तक पहुँचते हैं।
3. Epigenetic रूपांतरण के लिए तंतुकोशिका चढ़ाना
- सेल संस्कृति व्यंजन को 0.26 मिलीग्राम / 0.1% सुअर जिलेटिन की 2 सेमी (1.1 में वर्णित के रूप में तैयार) जोड़ें। कोट करने के लिए 2 घंटा तक प्रतीक्षा करें।
- कोटिंग समाधान अतिरिक्त 10-30 मिनट fibroblasts चढ़ाना करने से पहले निकालें।
- संस्कृति व्यंजन से fibroblast संस्कृति के माध्यम से निकालें। कोशिकाओं पीबीएस के साथ तीन बार धोएं 1% एंटीबायोटिक कवकनाशी समाधान के साथ पूरक।
- trypsin-EDTA समाधान (0.5 ग्राम / एल सुअर का trypsin और 0.2 ग्राम / एल EDTA) की एक पतली परत (संस्कृति के माध्यम मात्रा का 10%) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक सेल monolayer ऊतक के नीचे से अलग करने के लिए शुरू होता है संस्कृति पकवान और कोशिकाओं को अलग कर देना।
- fibrobl के 9 भागों के साथ सेल निलंबन पतलाएएसटी संस्कृति के माध्यम trypsin कार्रवाई बेअसर।
- कमरे के तापमान पर एक खुर्दबीन के नीचे एक गिनती कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना। कोशिकाओं resuspend, 7.8 x 10 4 fibroblasts / 2 सेमी की एक सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए fibroblast संस्कृति के माध्यम से आवश्यक मात्रा की गणना। यह प्रयोग किया जाता चैम्बर के विशिष्ट प्रकार पर निर्भर करेगा।
कोशिकाओं / μl = प्रति छोटे ग्रिड x 90 (गुणा कारक) एक्स कमजोर पड़ने सेल की औसत संख्या - कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 150 ग्राम पर अपकेंद्रित्र सेल निलंबन। fibroblast संस्कृति के माध्यम से पहले से गणना की मात्रा के साथ सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें।
- 0.1% जिलेटिन पूर्व लेपित व्यंजन और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए उन्हें संस्कृति पर प्लेट कोशिकाओं।
4. बढ़ाएँ सेल Plasticity डी-methylating एजेंट 5-Aza-सीआर का प्रयोग
- 0 दिवस
- DMEM उच्च ग्लूकोज दवा की 10 मिलीलीटर में 5-Aza-CR के 2.44 मिलीग्राम भंग द्वारा 5-Aza-CR शेयर समाधान तैयारउम। निस्पंदन द्वारा जीवाणुरहित। तुरंत उपयोग करने से पहले 5-Aza-CR शेयर तैयार करें।
- fibroblast संस्कृति के माध्यम से (अंतिम एकाग्रता 1 माइक्रोन) के 1 मिलीलीटर में 5-Aza-CR शेयर समाधान के 1 μl पतला।
- सेल प्लास्टिसिटी, सेल चढ़ाना (दूसरा नाम 3.8) के बाद 24 घंटे बढ़ाने के लिए, वरीयता प्राप्त fibroblasts से संस्कृति के माध्यम से हटाने के लिए और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए 1 माइक्रोन 5-Aza-CR शेयर समाधान और संस्कृति जोड़ें।
- पहला दिन
- तालिका 1 में वर्णित के रूप में नए सिरे से मानव pluripotent (हिमाचल प्रदेश) के माध्यम से तैयार।
- 1 माइक्रोन 5-Aza-CR के साथ ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के साथ मध्यम हटाने और यह सुनिश्चित करना है कि 5-Aza-CR दूर rinsed है तीन बार कोशिकाओं को धो लें।
- सेते 5-Aza-CR 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा (वसूली की अवधि) के लिए हिमाचल प्रदेश के मध्यम के साथ इलाज किया fibroblasts।
- वसूली की अवधि के बाद, मध्यम हटाने पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
- 5-Aza-CR उपचार की दक्षता पर नजर रखने के लिए, इस कदम च में जाँचया morphological परिवर्तन की उपस्थिति (परिणाम अनुभाग में विस्तृत)। प्रकोष्ठों fibroblasts की ठेठ लम्बी आकृति विज्ञान खोने के लिए और एक गोल या अंडाकार आकार के अधिग्रहण, आकार में छोटे, बढ़े हुए नाभिक के साथ हो रहा है।
- अग्नाशय भेदभाव के साथ आगे बढ़ें।
5. अग्नाशय भेदभाव प्रोटोकॉल
- दिन 1-6
- तालिका 2 में वर्णित के रूप में अग्नाशय बेसल मध्यम तैयार करें।
- activin एक शेयर समाधान तैयार: बाँझ पानी के 166.6 μl में एक पुनः संयोजक मानव प्रोटीन activin के 5 माइक्रोग्राम भंग।
- संस्कृति 5-Aza-CR 0.26 मिलीग्राम / सेमी अग्नाशय बेसल मध्यम 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में इलाज fibroblasts, 1 μl / एमएल activin एक शेयर के समाधान के साथ पूरक (5.1.2 देखें) 6 दिनों के लिए। मध्यम दैनिक परिवर्तन।
- दिन में 7-8
- रेटिनोइक एसीआई के 50 मिलीग्राम डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) की 16.6 मिलीलीटर जोड़कर retinoic एसिड शेयर समाधान तैयारघ।
- 0.26 मिलीग्राम / अग्नाशय बेसल मध्यम से 2 सेमी में संस्कृति कोशिकाओं 1 μl / एमएल 37 डिग्री पर activin एक शेयर समाधान (5.1.2 देखें) और 1 μl / एमएल retinoic एसिड शेयर समाधान (5.2.1 देखें) 2 दिनों के लिए सी के साथ पूरक 5% सीओ 2। मध्यम दैनिक परिवर्तन।
- दिन 9-36
- 0.26 मिलीग्राम / 2 सेमी अग्नाशय बेसल मध्यम में संस्कृति कोशिकाओं 1% के साथ पूरक (वी / वी) इंसुलिन Transferrin-सेलेनियम (आईटीएस), 2% (वी / वी) B27 और 0.1% (वी / वी) संयोजक मानव FGF बुनियादी (bFGF) में 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर शेयर समाधान (1 टेबल देखें) 37 डिग्री सेल्सियस पर। पहले 15 दिनों के लिए दैनिक मध्यम बदलें।
- आगे दिन 16 से, हर दूसरे दिन मध्यम ताज़ा, एक खुर्दबीन के नीचे, कुल कोशिकाओं के गठन संस्कृति डिश के नीचे से अलग हो सकती है के बाद से।
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Representative Results
त्वचा बायोप्सी से प्राथमिक संस्कृति की स्थापना
त्वचा बायोप्सी छोटे टुकड़ों में काटा जाता है और जिलेटिन पूर्व लेपित बर्तन में रखा गया था। 6 दिन बाद, fibroblasts ऊतक टुकड़े से बाहर हो जाना शुरू कर दिया है और एक सेल monolayer (चित्रा 1 ए) का गठन किया। प्रकोष्ठों एक ठेठ लम्बी आकार से पता चला है और उम्मीद के रूप में, fibroblast विशिष्ट मार्कर vimentin (विम, चित्रा 1 बी) के लिए एक समान प्रतिरक्षा सकारात्मकता का प्रदर्शन किया।
रूपात्मक परिवर्तन और मेथिलिकरण 5-Aza-CR को 18 घंटा प्रदर्शन के बाद त्वचा fibroblasts के पैटर्न
इंसुलिन स्रावित कोशिकाओं में fibroblasts की एक सफल epigenetic रूपांतरण प्राप्त करने के लिए, हम de-methylating एजेंट, 5-Aza-सीआर का उपयोग कर अपने प्लास्टिसिटी वृद्धि हुई है। मानव fibroblasts 7.8 x 10 4 fibroblasts / 2 सेमी की एकाग्रता में 0.1% जिलेटिन पूर्व लेपित व्यंजन पर चढ़ाया गया। बोने के बाद चौबीस घंटा, कोशिकाओं wअरे 18 घंटे के लिए 1 माइक्रोन 5-Aza-CR के साथ incubated।
इस उपचार के अंत में, सेल phenotype की एक व्यापक परिवर्तन दिखाई दे रहा था (पोस्ट 5-Aza-सीआर, 2A चित्रा)। इलाज fibroblasts (T0, 2A चित्रा) के विशिष्ट लम्बी आकृति विज्ञान, एक गोल या अंडाकार आकार द्वारा बदल दिया गया था और सेल आकार काफी छोटा हो गया। कोशिका द्रव्य, बारीक था चपटा, और कोशिकाओं संस्कृति की सतह के अनुयायी थे। नाभिक बड़ा दिखाई दिया और आराम से क्रोमेटिन संरचना का एक परिणाम के रूप में, vacuolated। हमारे अनुभव में, इन morphological परिवर्तन की उपस्थिति आवश्यक है और ध्यान से 5 Aza-CR उपचार की दक्षता के लिए एक मार्कर के रूप में निगरानी की जानी चाहिए।
बाद 18 घंटा प्रदर्शन करने के लिए 5-Aza-सीआर, वैश्विक डीएनए मेथिलिकरण की तेजी से कमी भी स्पष्ट हो गया था और स्पष्ट रूप से 5 methylcytidine immunostaining के कम तीव्रता के द्वारा प्रदर्शन किया गया था ( त्वचा की epigenetic रूपांतरण के दौरान रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन इंसुलिन स्रावित कोशिकाओं में fibroblasts पहले कदम के दौरान कोशिकाओं अग्नाशय बेसल मध्यम में 7 दिन एण्डोडर्म प्रतिबद्धता को बढ़ावा देने के activin एक साथ पूरक के लिए सुसंस्कृत थे। इस अंतराल में, कोशिकाओं को आगे चपटा और धीरे-धीरे समूहों (7 दिवस, चित्रा 3 ए) में व्यवस्थित करने के लिए शुरू किया। बाद में, अग्नाशय वंश भेदभाव 2 दिनों के लिए retinoic एसिड के अलावा के साथ पदोन्नत किया गया था। इस उपचार के जवाब में, कोशिकाओं को एक जालीदार पैटर्न में पुन: व्यवस्थित और स्पष्ट रूप से पहचाने सेल समुच्चय (दिन 10, चित्रा 3 ए) में वृद्धि हुई है। क्लस्टरिंग गठन पीrocess समय के साथ वृद्धि हुई है और आगे तीसरे और अंतिम कदम है, जो B27, bFGF और इसके लिए सेल जोखिम के शामिल द्वारा प्रेरित किया गया था। यह है कि बड़े 3 डी कालोनियों में एकत्रित कोशिकाओं की संख्या बढ़ रही है (दिन 20, चित्रा 3 ए) की भर्ती के लिए नेतृत्व किया। 36 दिन के आसपास, इन कालोनियों के रूप में इन विट्रो में ठेठ अग्नाशय टापू दिवस (36, चित्रा 3 ए) की याद ताजा अलग दौर संरचनाओं दिखाई दिया। नई EpiCC phenotype के अधिग्रहण वैश्विक डीएनए मेथिलिकरण का स्तर है कि इलाज fibroblasts (5 एम सी डे 36 चित्रा 3 बी) में मनाया उन लोगों के लिए लौट आए की एक क्रमिक वृद्धि के साथ गया था। अग्नाशय प्रेरण के 36 दिनों के बाद, epigenetic रूपांतरण की क्षमता भी ठेठ परिपक्व अग्नाशय मार्कर की अभिव्यक्ति है, जो मूल रूप से इलाज fibroblasts में undetectable थे (T0 द्वारा प्रदर्शन किया गया था, तालिका 1: सामग्री समाधान। तालिका 2: सामग्री समाधान।
अग्नाशय भेदभाव प्रेरित करने के लिए, 5-Aza-CR इलाज किया fibroblasts अग्नाशय शामिल करने के लिए एक तीन कदम प्रोटोकॉल से अवगत कराया गया, तुरंत 3 घंटा वसूली अवधि के बाद। 
चित्रा 1: अलगाव और मानव त्वचा fibroblasts के लक्षण वर्णन (ए) ऊतक टुकड़े से बाहर बढ़ती fibroblasts की प्रतिनिधि छवि।। (बी) Fibroblasts उनकी एस के लिए एक समान प्रतिरक्षा सकारात्मकता प्रदर्शितpecific मार्कर vimentin (विम)। नाभिक DAPI के साथ दाग रहे हैं। (स्केल सलाखों, 100 माइक्रोन)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 
चित्रा 2: मानव त्वचा fibroblasts की रूपात्मक और मेथिलिकरण परिवर्तन 5-Aza-CR उपचार के बाद (ए) लम्बी आकार (T0) दिखा इलाज fibroblasts की छवियों प्रतिनिधि, और 5 Aza-CR इलाज किया fibroblasts एक गोल या अंडाकार आकृति विज्ञान प्रदर्शित, दानेदार। कोशिका द्रव्य, और बढ़े और vacuolated नाभिक (पोस्ट 5-Aza-सीआर)। (स्केल सलाखों, 100 माइक्रोन)। (बी) वैश्विक डीएनए मेथिलिकरण की कमी का पता लगता है 5-Aza-CR उपचार के बाद (पोस्ट 5-Aza-सीआर)। (स्केल सलाखों, 50 माइक्रोन)। सीएल कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ Ick। 
चित्रा 3:। Epigenetic रूपांतरण के दौरान रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन (ए) अंत: स्रावी अग्नाशय भेदभाव के दौरान जगह ले जा morphological परिवर्तन के प्रतिनिधि चित्रों। प्रेरण के 7 दिनों के बाद, मानव कोशिकाओं को धीरे-धीरे समूहों (7 दिन) में आयोजन। retinoic एसिड के अलावा के जवाब में, वे एक जालीदार पैटर्न और अलग पहचाना समुच्चय (10 दिन) में क्लस्टर में पुनर्व्यवस्थित। इन संरचनाओं समय के साथ प्रगति, (दिवस 20) कोशिकाओं की भर्ती और बड़े 3 डी कालोनियों में कुल। अंत में, कालोनियों गोलाकार संरचना है कि अलग और संस्कृति के माध्यम से, इन विट्रो में ठेठ अग्नाशय टापू दिवस (36) की याद ताजा में स्वतंत्र रूप से नाव के लिए जाते हैं बन जाते हैं। (स्केल सलाखों, 100 माइक्रोन)। (बी) में अग्नाशय के 36 दिनों के बादduction, इलाज fibroblasts (5 एम सी डे 36) में मनाया उन लोगों के लिए मानव EpiCC वापसी की वैश्विक डीएनए मेथिलिकरण स्तरों। (स्केल बार, 50 माइक्रोन)। सी-पीईपी साथ Pdx1 के सह स्थानीयकरण, रूपांतरण अवधि (दिन 36) के अंत में detectable है, जबकि इन अंत: स्रावी अग्नाशय मार्करों इलाज fibroblasts (T0) में पूरी तरह से अनुपस्थित रहे हैं। (स्केल सलाखों, 100 माइक्रोन)। 20 मिमी डी ग्लूकोज और 20 मिमी एल ग्लूकोज जोखिम के जवाब में (सी) EpiCC इंसुलिन रिलीज। बार्स ± तीन स्वतंत्र प्रतिकृति के एसडी मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। सामग्री / उपकरण का नाम मात्रा (वी / वी) टिप्पणियाँ / विवरण हाम F-10 पोषक तत्व मिश्रण 40% DMEM कम ग्लूकोज 40% पीटा सीरम रिप्लेसमेंट 10% FBS 5% एंटीबायोटिक कवकनाशी समाधान 1% एल Glutamine समाधान 1% सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड समाधान 1% 2-Mercaptoethanol शेयर 1% 2-Mercaptoethanol शेयर तैयारी: बाँझ पीबीएस के 5 मिलीलीटर में 2-Mercaptoethanol की diluite 3.5 μl। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर। नोट: 2 सप्ताह के भीतर का प्रयोग करें Nucleoside मिश्रण शेयर 1% nucleoside मिश्रण शेयर तैयारी: भंग 0.042 जी guanosine, 0.040 जी Adenosine, 0.036 जी Cytidine, 0.036 जी uridine और बाँझ पानी की 50 मिलीलीटर में 0.012 जी Timidine। 50 डिग्री सेल्सियस पर पिघल भंग करने के लिए। Filtrat द्वारा जीवाणुरहितआयन और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ESGRO (LIF) 0.1% संयोजक मानव FGF बुनियादी (bFGF) शेयर 0.1% bFGF शेयर तैयारी: के 5 मिलीलीटर जोड़ने 0.1% 25 माइक्रोग्राम bFGF के कम से पीबीएस में गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) सामग्री / उपकरण का नाम मात्रा (वी / वी) टिप्पणियाँ / विवरण DMEM / F-12 93% B-27 अनुपूरक विटामिन ए माइनस 2% एन 2 अनुपूरक 1% सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड समाधान 1% एंटीबायोटिक दवाओंकवकनाशी समाधान 1% 2-Mercaptoethanol शेयर 1% 2-Mercaptoethanol शेयर तैयारी: बाँझ पीबीएस के 5 मिलीलीटर में 2-Mercaptoethanol की diluite 3.5 μl। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर। नोट: 2 सप्ताह के भीतर का प्रयोग करें एल Glutamine समाधान 1% बीएसए शेयर 1% बीएसए शेयर की तैयारी: पानी की 50 मिलीलीटर में 250 मिलीग्राम भंग। 4 डिग्री सेल्सियस पर निस्पंदन और दुकान से जीवाणुरहित।
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Discussion
वर्तमान पांडुलिपि एक तरीका है कि 5-Aza-CR के लिए एक क्षणिक और संक्षिप्त जोखिम के माध्यम से, इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं में मानव त्वचा fibroblasts के रूपांतरण की अनुमति देता है, एक ऊतक विशिष्ट प्रेरण प्रोटोकॉल के द्वारा पीछा वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण, mesoderm से एण्डोडर्म संबंधित कोशिकाओं को एक स्विच की अनुमति देता है प्रतिलेखन कारक या microRNAs के लिए मजबूर अभिव्यक्ति है और न ही एक स्थिर pluripotent राज्य के अधिग्रहण, कि कोशिकाओं को और अधिक अस्थिर और गलतियों को 14 की संभावना है बिना।
पहले चरण में, सेल प्लास्टिसिटी एक कृत्रिम epigenetic आपरिवर्तक कि टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं में एक क्षणिक, प्रतिवर्ती अनुमोदक राज्य लाती करने के लिए धन्यवाद बढ़ जाती है। विशेष रूप से, 5-Aza-CR आदेश त्वचा fibroblast कोशिकाओं के वैश्विक मेथिलिकरण में कमी का कारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। 5-Aza-CR सीधे मिथाइल-ट्रांसफेरेज़ गतिविधि को बाधित करने के लिए और नए संश्लेषित डीएनए में नए सिरे से मेथिलिकरण को रोकने के लिए जाना जाता है। उसके प्रभाव के कारण, इस अणुपहले से चुप जीन को पुन: सक्रिय करने के लिए, साथ ही कोशिकाओं 15,16 के भेदभाव राज्यों को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। 5-Aza-CR इस के अनुरूप, पोस्ट त्वचा fibroblasts एक वैश्विक डीएनए demethylation (2A चित्रा) से पता चला है, यह दर्शाता 5-Aza-CR वर्तमान प्रयोगों के लिए इस्तेमाल की कोशिकाओं में प्लास्टिसिटी वृद्धि करने की क्षमता। इस अवलोकन है कि 5-Aza-CR की सुविधा उच्च plasticity से संबंधित मार्कर Oct, 4 neurosphere कोशिकाओं (एनएससी) 17 में की अभिव्यक्ति के साथ समझौते में भी है। हालांकि, यह ध्यान दें कि पोस्ट 5-Aza-CR त्वचा fibroblasts 5-Aza-CR को हटाने के बाद उनके मूल phenotype पर वापस लौटने के लिए दिलचस्प है। दरअसल, हम पहले से दिखा दिया है कि fibroblasts, उनके मूल संस्कृति के माध्यम से लौटे pluripotency से संबंधित कारकों 9,10 के नीचे विनियमित अभिव्यक्ति है, यह दर्शाता है कि उच्च प्लास्टिसिटी राज्य प्राप्त कर लिया, epigenetic आपरिवर्तक के जवाब में, क्षणिक प्रतिवर्ती है और शामिल नहीं है टी के स्थायी संशोधनोंवह कोशिकाओं।
सेल आकृति विज्ञान में उल्लेखनीय परिवर्तन एक उच्च प्लास्टिसिटी राज्य (2A चित्रा) के शामिल होने के साथ थे। इलाज fibroblast कोशिकाओं की खासियत लम्बी सेल निकायों गोल या अंडाकार आकार की कोशिकाओं है कि छोटे आयाम और एक वृद्धि की मात्रा नाभिक प्रस्तुत किया, जो विभेदित कोशिकाओं की तुलना में बड़ा दिखाई द्वारा बदल दिया गया था। Niwa एक pluripotency से संबंधित सुविधा 18 के रूप में वर्णित एक सुकून क्रोमेटिन संरचना करने के लिए इस परमाणु इज़ाफ़ा सहसंबद्ध। vacuolated नाभिक और बारीक कोशिका द्रव्य, साथ ही एक वृद्धि की समतल आकृति विज्ञान की उपस्थिति, स्पष्ट थे। सभी रूपात्मक वर्णित व्यावहारिक रूप से रूपांतरण प्रोटोकॉल के पहले भाग के सफल समापन के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता परिवर्तन; हमारे अनुभव जब परिवर्तन मौजूद हैं, 5-Aza-CR वास्तव में एक और अनुमोदक राज्य प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की मदद की है।
यह इस क्षणिक "उच्च permis का लाभ लेने के लिए संभव हैsivity समय-खिड़की "एक पूरी तरह से अलग phenotype की ओर कोशिकाओं ड्राइव करने के लिए। वर्तमान प्रोटोकॉल दर्शाता है कि पोस्ट 5-Aza-CR fibroblasts अग्नाशय बीटा सेल कोशिकाओं की तरह करने के लिए फिर से संबोधित किया जा सकता है कि एक विशिष्ट भेदभाव माध्यम के जवाब में। प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया कोशिकाओं एण्डोडर्म वंश से संबंधित एक सेल आबादी के लिए एक mesoderm ली गई कोशिका प्रकार से स्विच करने की अनुमति देते हैं।
इंसुलिन, जो मूल रूप से इलाज त्वचा fibroblasts में undetectable था, भेदभाव प्रोटोकॉल (चित्रा 3 बी) के अंत में सकारात्मक था। , इसके बहि, अंत: स्रावी, और नलीपरक सेल आबादी विशिष्ट बीटा सेल वंश के बगल में - इस तरह के Pdx1 के रूप में अन्य कारकों, अग्न्याशय के पूरे के भेदभाव में शामिल की एक साथ अभिव्यक्ति के साथ गया था। इस माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं पर पिछले काम (ईएससी) का संकेत है कि बीटा कोशिकाओं में एक उचित भेदभाव हासिल की थी तभी होता है जब अपरिपक्व कोशिकाओं othe के साथ स्तरित थे के साथ संगत हैआर अंत: स्रावी कोशिकाओं 19, सुझाव स्थानीय सूक्ष्म वातावरण आइलेट्स वास्तुकला का अग्नाशय आइलेट द्वारा प्रदान की एक मजबूत कार्यात्मक भूमिका है।
दरअसल, EpiCC एक परिपक्व विभेदित phenotype हासिल की और 20 मिमी ग्लूकोज जोखिम (चित्रा 3) के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता दिखाई। इंसुलिन को सक्रिय रूप से डी ग्लूकोज उत्तेजना के 1 घंटे के बाद संस्कृति के माध्यम में स्रावित था इंसुलिन के उत्पादन वाले (चित्रा 3 सी) के रूप में EpiCC के सदाशयी प्रकृति की पुष्टि।
एक सफल प्रक्रिया के लिए एक अलग आवश्यकता 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं के कठोर रखरखाव, बाँझ लामिना का प्रवाह और माइक्रोस्कोप के तहत अपने को संभालने सहित सभी कदम है, पर है। हमारे अनुभव में, यह भी अत्यधिक हौसले अभिकर्मकों तैयार करने के लिए, संस्कृति में उनके उपयोग करने से पहले और मध्यम सख्ती से ताज़ा करने के लिए प्रोटोकॉल के अनुसार सिफारिश की है। इस आपरेशन के गठन के बाद से कुल कोशिकाओं एक खुर्दबीन के तहत बाहर किया जाना चाहिएसंस्कृति डिश के नीचे से अलग और मध्यम परिवर्तन के दौरान खो सकता है।
Epigenetic रूपांतरण प्रोटोकॉल भी सफलतापूर्वक, सुअर का प्रजातियों के रूप में अच्छी तरह के रूप में कुत्ते (पांडुलिपि प्रस्तुत) को लागू किया गया है एक ही सेल नंबर / 2 मनुष्य के लिए वर्णित सेमी और डी-methylating एजेंट एकाग्रता का उपयोग।
अंत में, एक प्रोटोकॉल है कि एक और सेल प्रकार में त्वचा fibroblasts की रूपांतरण की अनुमति देता यहां प्रस्तुत किया है। रणनीति वर्णित एक epigenetically आधारित सेल रूपांतरण के फायदे हैं: अर्थात् संभावना एक pluripotent राज्य है कि कैंसर कोशिकाओं को पैदा करने में सक्षम पीछे छोड़ सकता है से बचने के लिए; बहिर्जात आनुवांशिक कारक है कि कोशिकाओं में सुस्त परिवर्तन का कारण बन सकता का उन्मूलन। ये लाभ वर्तमान दृष्टिकोण अत्यधिक ट्रांसलेशनल मेडिसिन अनुप्रयोगों के लिए होनहार बनाने के लिए और रोगी विशेष सेल थेरेपी के लिए अनुमति देता है।
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Disclosures
लेखक घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।
Acknowledgments
इस काम Carraresi फाउंडेशन और मधुमेह के अध्ययन के लिए यूरोपीय फाउंडेशन (EFSD) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जीपी मिलान विश्वविद्यालय के एक के बाद डॉक्टर फैलोशिप द्वारा समर्थित है। Epigenetics और Periconception पर्यावरण और लागत कार्रवाई (सलाम) BM1308 शेयरिंग बड़े पशु मॉडल पर अग्रिम: लेखक लागत कार्रवाई FA1201 Epiconcept के सदस्य हैं। TALB लागत कार्रवाई CM1406 Epigenetic रासायनिक जीवविज्ञान (EPICHEM) का सदस्य है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
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