Introduction
Un obiettivo fondamentale della medicina rigenerativa è la generazione di nuove cellule funzionali che possono essere utilizzati per riparare o sostituire danneggiato, degenerata tessuti. Rifare cellule adulte facilmente disponibili in nuovi, convertendoli da un tipo di cellula all'altra, è un approccio particolarmente interessante, soprattutto quando la popolazione di cellule richiesta non è abbondante o di difficile accesso. Tuttavia, le cellule adulte sono molto stabili. Acquisiscono il loro stato differenziato attraverso una restrizione graduale nelle loro opzioni e, una volta raggiunta la specializzazione terminale maturo, hanno stabilmente conservarlo 1.
Negli ultimi anni sono state sviluppate una serie di protocolli, che consentono la riprogrammazione di pluripotenza di una cellula somatica (IPS) ottenuta attraverso l'espressione forzata di una serie di fattori di trascrizione 2,3. In alternativa, la conversione cella può essere ottenuto transdifferenziazione discendenza diretta, introducendo un unico 4 5-7. Questa strategia non comporta il passaggio attraverso uno stato de-differenziati ma richiede elevata espressione della trascrizione specifici fattori 8.
Abbiamo recentemente sviluppato un protocollo di conversione basato sulla breve esposizione di cellule adulte alle proprietà demetilanti della citidina analogico 5-azacitidina (5-aza-CR), un inibitore della DNA metiltransferasi ben caratterizzato. Il passo demetilazione è immediatamente seguito da uno specifico protocollo di differenziazione 9-11 che permette di ottenere il fenotipo morsetto desiderato. Questo metodo è in grado di convertire maturi, cellule differenziate in cellule di diversa stirpe e presenta il notevole vantaggio di evitare sia l'uso di vettori virali e la trasfezione di eventuali fattori di trascrizione esogeni. L'acquisizione di uno stato pluripotente stabile, e il relativo aumento della suscettibilità alle cella instabilità è anche evitato.
9-13 e nel cane (manoscritto presentato) suggerendo un'ampia efficacia e la robustezza del metodo.
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Protocol
Nota: Tutte le procedure descritte di seguito devono essere eseguite sotto cappa a flusso laminare in condizioni sterili. Assicurarsi che tutte le procedure di coltura vengono effettuate sui palchi termostatiche e le cellule vengono mantenute a 37 ° C in tutta la movimentazione.
Isolamento dei fibroblasti della pelle 1.
- Preparare cultura piatto Coating Soluzione
- Sciogliere 0.1 g di gelatina porcina in 100 ml di acqua (concentrazione finale 0,1%). Sterilizzare soluzione con autoclave.
- Aggiungere 1,5 ml di sterile 0,1% di gelatina suina a 35 mm piastre di Petri. Attendere 2 ore a cappotto, mantenendoli a temperatura ambiente.
Nota: biopsie di cute umana sono raccolti da escissione in anestesia locale da una zona avascolare della faccia anteriore dell'avambraccio e memorizzati in Dulbecco Phosphate Buffered Saline (PBS) addizionato con 2% di soluzione antimicotico antibiotico a + 4 ° C prima dell'uso.
- biopsie essere lavata con nuovo PBS integrato con il 2% antibisoluzione antimicotico otic.
- Luogo biopsie in un piatto 100 millimetri di Petri e tagliate a circa 2 mm 3 frammenti con bisturi sterili.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento in eccesso immediatamente prima placcatura frammenti.
- Mettere 5-6 frammenti di pelle nel piatto pre-rivestito 35 millimetri Petri.
- Preparare terreno di coltura di fibroblasti: 77% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) alta di glucosio, il 20% siero fetale bovino (FBS), 1% soluzione di L-glutammina e il 2% soluzione antimicotico antibiotico.
- Aggiungere una goccia di mezzo di fibroblasti su ciascun frammento (di solito 100 pl per frammento) e coltura a 37 ° C in 5% CO 2.
- Dopo 24 ore, aggiungere 500 ml di mezzo di coltura di fibroblasti nei frammenti per tenerli umido a 37 ° C in 5% CO 2.
- Cambiare il mezzo con una pipetta, almeno una volta ogni 48 ore.
- Dopo 6 giorni di incubazione, rimuovere frammenti di tessuto con attenzione e gettarli.
Nota: Dopo 6 giorni, dei fibroblastis iniziano a crescere fuori dai frammenti di tessuto e cominciare a formare un monostrato di cellule. - Aggiornare media, aggiungere 2 ml di terreno di coltura di fibroblasti e continuare la cultura monostrato di cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.
2. Cultura fibroblasti
- Fibroblasti Culture a 37 ° C in 5% di CO 2 fino all'80% di confluenza
- Per passaging, terreno di coltura di fibroblasti aspirato dai piatti di coltura di tessuti. Lavare le cellule tre volte con 4 ml di PBS completato con 1% di soluzione antimicotico antibiotico.
- Aggiungere uno strato sottile (10% del volume di coltura) di soluzione di tripsina-EDTA (0,5 g / L porcine tripsina e 0,2 g / L EDTA) e incubare a 37 ° C fino monostrato cellulare comincia a staccarsi dal fondo del tessuto cultura piatto e le cellule si dissociano.
- Diluire sospensione cellulare con 9 parti di terreno di coltura di fibroblasti di neutralizzare l'azione tripsina. Centrifugazione non è necessaria.
- cellule piastra in nuove piastre di coltura (conout gelatina) e cultura a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. Mantenere il rapporto passaggio tra 1: 2 e 1: 4, a seconda del tasso di crescita.
- Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, loro passaggio (di solito due volte a settimana).
3. fibroblasti placcatura per Epigenetic conversione
- Aggiungere 0,26 ml / cm 2 di 0,1% di gelatina porcina (preparare come descritto in 1.1) ai piatti di coltura cellulare. Attendere 2 ore a cappotto.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento in eccesso 10-30 minuti prima placcatura fibroblasti.
- Togliere terreno di coltura di fibroblasti da piatti della cultura. Lavare le cellule tre volte con PBS completato con 1% di soluzione antimicotico antibiotico.
- Aggiungere uno strato sottile (10% del volume di coltura) di soluzione di tripsina-EDTA (0,5 g / L porcine tripsina e 0,2 g / L EDTA) e incubare a 37 ° C fino monostrato cellulare comincia a staccarsi dal fondo del tessuto cultura piatto e le cellule si dissociano.
- Diluire sospensione cellulare con 9 parti di fibroblast terreno di coltura per neutralizzare l'azione tripsina.
- Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio al microscopio a temperatura ambiente. Calcolare il volume richiesto di terreno di coltura fibroblasti per risospendere le cellule, per ottenere una concentrazione cellulare di 7,8 x 10 4 fibroblasti / cm 2. Questo dipende dal tipo specifico di camera utilizzata.
Le cellule / ml = Numero medio di cellule per piccola griglia x 90 (fattore di moltiplicazione) x diluizione - sospensione cellulare Centrifugare a 150 g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere con il volume precedentemente calcolato di terreno di coltura di fibroblasti.
- Cellule piastra su 0,1% di gelatina piatti e li coltura per 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore pre-rivestito.
4. Aumentare cellulare plasticità Utilizzando il De-metilazione Agente 5-aza-CR
- giorno 0
- Preparare 5-aza-CR soluzione madre sciogliendo 2,44 mg di 5-aza-CR in 10 ml di DMEM alta medi di glucosioum. Sterilizzare per filtrazione. Preparare 5-aza-CR magazzino immediatamente prima dell'uso.
- Diluire 1 ml di 5-aza-CR soluzione madre in 1 ml di terreno di coltura di fibroblasti (concentrazione finale 1 micron).
- Per aumentare la plasticità delle cellule, 24 ore dopo la placcatura cella (sottovoce 3.8), togliere terreno di coltura da fibroblasti semi e aggiungere 1 micron 5-aza-CR soluzione di riserva e la cultura per 18 ore a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.
- Giorno 1
- Preparare mezzo fresco umane pluripotenti (HP) come descritto nella Tabella 1.
- Dopo l'incubazione con 1 pM 5-aza-CR, rimuovere medie e lavare le cellule tre volte con PBS per garantire che 5-aza-CR viene sciacquato via.
- Incubare 5-aza-CR fibroblasti trattati con HP medio per 3 ore (periodo di recupero) a 37 ° C in 5% CO 2.
- Dopo il periodo di recupero, rimuovere media, lavare tre volte con PBS.
- Per monitorare l'efficienza delle 5-aza-CR trattamento, il check-in questa fase fo la presenza di alterazioni morfologiche (indicato nella sezione Risultati). Le cellule perdono la morfologia tipica forma allungata dei fibroblasti e acquisiscono una forma rotonda o ovale, diventando di dimensioni più piccole, con i nuclei allargati.
- Procedere con la differenziazione del pancreas.
5. pancreas Differenziazione protocollo
- giorni 1-6
- Preparare al pancreas basale medio, come descritto nella tabella 2.
- Preparare activina Una soluzione madre: sciogliere 5 mg di activina una proteina umana ricombinante a 166,6 ml di acqua sterile.
- Cultura 5-aza-CR fibroblasti trattati in 0,26 ml / cm 2 di pancreas basale medio, integrato con 1 ml / ml activin una soluzione di riserva (vedi 5.1.2) per 6 giorni a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. Cambiare media giornaliera.
- giorni 7-8
- Preparare l'acido retinoico soluzione madre con l'aggiunta di 16,6 ml di dimetilsolfossido (DMSO) a 50 mg di aci retinoicod.
- Cellule di coltura a 0,26 ml / cm 2 di pancreas basale medio integrato con 1 ml / ml activina una soluzione di riserva (vedi 5.1.2) e ml di soluzione 1 ml / acido retinoico magazzino (vedi 5.2.1) per 2 giorni a 37 ° C nel 5% di CO 2. Cambiare media giornaliera.
- giorni 9-36
- Cellule di coltura a 0,26 ml / cm 2 di pancreas basale medio integrato con 1% (v / v) di insulina-transferrina-selenio (ITS), 2% (v / v) B27 e 0,1% (v / v) ricombinante FGF umani fondamentali soluzione madre (bFGF) (vedi tabella 1) a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. Cambiare la media giornaliera per i primi 15 giorni.
- Dal giorno 16 in poi, aggiornare medio ogni altro giorno, al microscopio, poiché formare celle aggregati possono staccarsi dal fondo del piatto di coltura.
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Representative Results
Istituzione di colture primarie da biopsie cutanee
biopsie cutanee sono stati tagliati in piccoli frammenti e messi in gelatina piatti pre-rivestiti. Dopo 6 giorni, fibroblasti cominciato a crescere fuori dei frammenti di tessuto e ha formato un monostrato di cellule (Figura 1A). Le cellule hanno mostrato una tipica forma allungata e, come previsto, visualizzati un'uniforme immuno-positività per fibroblasto specifico vimentina marcatore (Vim, Figura 1B).
cambiamenti morfologici e metilazione modello di fibroblasti cutanei dopo l'esposizione 18 ore a 5-aza-CR
Per ottenere una conversione epigenetica successo dei fibroblasti in cellule che secernono insulina, abbiamo aumentato la loro plasticità utilizzando l'agente de-metilazione, 5-aza-CR. Fibroblasti umani sono stati piastrati su 0,1% di gelatina piatti pre-rivestite ad una concentrazione di 7,8 x 10 4 fibroblasti / cm 2. Ventiquattro ore dopo la semina, le cellule were incubate con 1 micron 5-aza-CR per 18 ore.
Al termine di questo trattamento, un ampio cambiamento di fenotipo cellulare era visibile (Post 5-aza-CR, Figura 2A). La morfologia tipica allungata di fibroblasti non trattati (T0, Figura 2A), è stato sostituito da una forma rotonda o ovale e dimensioni delle cellule è notevolmente più piccolo. Il citoplasma è granulare, appiattito, e le cellule erano aderente alla superficie cultura. Nuclei appariva più grande e vacuolato, come conseguenza della struttura della cromatina rilassata. Nella nostra esperienza, la presenza di questi cambiamenti morfologici è essenziale e deve essere attentamente monitorata come marcatore per l'efficienza del trattamento 5-aza-CR.
Dopo 18 ore di esposizione a 5-aza-CR, una netta diminuzione della metilazione del DNA globale era anche evidente ed è stato chiaramente dimostrato dall'intensità diminuita di 5-methylcytidine immunostaining ( cambiamenti morfologici e funzionali durante la conversione epigenetica della pelle fibroblasti in cellule che secernono insulina Durante la prima fase, le cellule sono state coltivate per 7 giorni al pancreas basale medio integrato con activin A per promuovere l'impegno endoderma. In questo intervallo, le cellule ulteriormente appiattite e gradualmente ha cominciato a organizzarsi in cluster (7 ° giorno, Figura 3a). Successivamente, pancreas differenziazione lineage stato promosso con l'aggiunta di acido retinoico per 2 giorni. In risposta a questo trattamento, le cellule modificate in un modello reticolare e cresciuti in aggregati chiaramente distinguibili cellulari (Giorno 10, Figura 3A). La formazione di clustering process aumentato con il tempo ed è stata ulteriormente stimolata dalla terza e ultima fase, che consisteva di esposizione delle cellule a B27, bFGF e ITS. Ciò ha portato al reclutamento di un numero crescente di cellule che aggregato in grandi colonie 3D (Giorno 20, figura 3A). Intorno al giorno 36, queste colonie è apparso come strutture circolari distinte che ricordano delle isole pancreatiche tipici in vitro (Giorno 36, Figura 3a). L'acquisizione della nuova fenotipo EPICC è stato accompagnato da un graduale aumento dei livelli di metilazione del DNA a livello mondiale che hanno restituito a quelli osservati nei fibroblasti non trattati (5 mC Giorno 36 figura 3b). Dopo 36 giorni di induzione del pancreas, l'efficienza della conversione epigenetica è stata dimostrata anche dall'espressione di tipici markers pancreatici maturi, che erano originariamente non rilevabile nei fibroblasti non trattati (T0, Tabella 1: soluzioni di materiali. Tabella 2: soluzioni di materiali.
Per indurre il differenziamento pancreatico, fibroblasti trattati 5-aza-CR sono stati esposti a un protocollo in tre fasi per l'induzione del pancreas, subito dopo il periodo di recupero 3 ore. 
Figura 1: Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cutanei umani (A) immagine Rappresentante dei fibroblasti che crescono fuori dai frammenti di tessuto.. (B) I fibroblasti mostrano una divisa immuno-positività per il loro svimentina marcatore pecifici (Vim). I nuclei sono colorati con DAPI. (Bar Scala, 100 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 2: cambiamenti morfologici e metilazione di fibroblasti cutanei umani dopo 5-aza-CR trattamento (A) Immagini rappresentative della fibroblasti non trattati mostrano forma allungata (T0), e 5-aza-CR fibroblasti trattati visualizzazione di una rotonda o morfologia ovale, granulati. citoplasma, e dilatati e vacuolate nuclei (post 5-aza-CR). (bar Scala, 100 micron). (B) Una diminuzione della metilazione del DNA globale è rilevabile dopo 5-aza-CR trattamento (Post 5-aza-CR). (Barre di scala, 50 micron). Si prega di click qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 3:. Cambiamenti morfologici e funzionali durante la conversione epigenetico (A) le immagini rappresentativi dei cambiamenti morfologici che si svolgono durante la differenziazione del pancreas endocrino. Dopo 7 giorni di induzione, le cellule umane gradualmente organizzare in cluster (7 ° giorno). In risposta alla aggiunta di acido retinoico, che riorganizzare in un modello reticolare e cluster aggregati distinguibili (giorno 10). Queste formazioni progredire con il tempo, reclutare cellule e aggregando in grandi colonie 3D (Giorno 20). Infine, colonie sono strutture sferiche che tendono a staccarsi e galleggiare liberamente nel terreno di coltura, che ricorda isole pancreatiche tipici in vitro (giorno 36). (bar Scala, 100 micron). (B) Dopo 36 giorni di pancreas inproduzione, i livelli di metilazione del DNA globali di ritorno EPICC umana a quelli osservati nei fibroblasti non trattati (5 mC Giorno 36). (Bar Scala, 50 micron). Co-localizzazione PDX1 con C-PEP è rilevabile alla fine del periodo di conversione (giorno 36), mentre questi marcatori neuroendocrini sono completamente assenti in fibroblasti non trattati (T0). (bar Scala, 100 micron). Rilascio di insulina (C) EPICC in risposta a 20 mM D-glucosio e 20 mM esposizione L-glucosio. Barre rappresentano la media ± SD di tre repliche indipendenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Nome del materiale / attrezzature Quantità (v / v) Commenti / Descrizione di Ham F-10 Nutrient Mix 40% DMEM glucosio basso 40% Sostituzione KnockOut Serum 10% FBS 5% soluzione antimicotico antibiotico 1% soluzione L-glutammina 1% MEM non essenziali soluzione Aminoacidi 1% 2-Mercaptoethanol magazzino 1% 2-Mercaptoethanol magazzino Preparazione: diluite 3,5 ml di 2-mercaptoetanolo in 5 ml di PBS sterile. Conservare al buio a + 4 ° C. Nota: utilizzare entro 2 settimane Nucleosidici mix magazzino 1% nucleosidici della miscela Stock Preparazione: sciogliere 0,042 g guanosina, 0,040 g adenosina, 0,036 g citidina, 0,036 g Uridine e 0,012 g timidina in 50 ml di acqua sterile. Sciogliere a 50 ° C per sciogliere. Sterilizzare in filtratione e conservare a + 4 ° C ESGRO (LIF) 0,1% Ricombinante FGF umani fondamentali (bFGF) stock 0,1% bFGF magazzino Preparazione: aggiungere 5 ml di 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA) in PBS a 25 mg di bFGF Nome del materiale / attrezzature Quantità (v / v) Commenti / Descrizione DMEM / F-12 93% B-27 supplemento Minus vitamina A 2% N-2 Supplemento 1% MEM non essenziali soluzione Aminoacidi 1% Antibioticosoluzione antimicotico 1% 2-Mercaptoethanol magazzino 1% 2-Mercaptoethanol magazzino Preparazione: diluite 3,5 ml di 2-mercaptoetanolo in 5 ml di PBS sterile. Conservare al buio a + 4 ° C. Nota: utilizzare entro 2 settimane soluzione L-glutammina 1% BSA magazzino 1% Preparazione di BSA magazzino: sciogliere 250 mg in 50 ml di acqua. Sterilizzare per filtrazione e conservare a + 4 ° C.
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Discussion
La presente manoscritto descrive un metodo che permette la conversione dei fibroblasti della pelle umana in cellule che producono insulina, attraverso una esposizione transitoria e breve a 5-aza-CR, seguito da uno specifico protocollo di induzione tessuto. Questo approccio consente il passaggio da mesoderma alle cellule legate endoderma, senza l'espressione forzata di fattori di trascrizione o microRNAs né l'acquisizione di uno stato stabile pluripotenti, che rende le cellule più instabile e soggetto a errori 14.
Nella prima fase, la plasticità cellulare viene aumentata grazie a un modificatore epigenetica sintetico che induce uno stato permissivo reversibili transiente in cellule terminalmente differenziate. In particolare, 5-aza-CR è stato utilizzato per provocare una diminuzione della metilazione globale di cellule di fibroblasti della pelle. 5-aza-CR è noto per inibire direttamente l'attività metil-transferasi e per prevenire de novo metilazione del DNA di nuova sintesi. A causa del suo effetto, questa molecolaè stato precedentemente utilizzato per riattivare geni silenti, nonché di modificare gli stati di differenziazione delle cellule eucariotiche 15,16. Coerentemente, inviare 5-aza-CR fibroblasti cutanei hanno mostrato un DNA demetilazione globale (Figura 2A), indicando 5-aza-CR capacità di aumentare la plasticità nelle cellule usate in esperimenti. Questo è anche in accordo con l'osservazione che 5-aza-CR facilita l'espressione del marcatore ad alta plasticità legati Oct-4 nelle cellule neurosfere (NSC) 17. Tuttavia, è interessante notare che il post 5-aza-CR fibroblasti cutanei ritornano al loro fenotipo originale dopo la rimozione di 5-aza-CR. In effetti, abbiamo precedentemente dimostrato che i fibroblasti ritorno al loro terreno di coltura originale, giù espressione regolata dei fattori pluripotenza legati 9,10, indicando che lo stato di plasticità più elevata acquisita, in risposta al modificatore di epigenetica, è transitoria, reversibile e non comporta modifiche permanenti di tegli cellule.
Notevoli cambiamenti nella morfologia cellulare accompagnato l'induzione di un più alto stato di plasticità (Figura 2A). I corpi cellulari allungata tipici delle cellule di fibroblasti non trattate è stata sostituita dalla rotonda o cellule ovali che presenta dimensioni ridotte ed un volume maggiore nuclei, apparso superiore a quella di cellule differenziate. Niwa correlato questo allargamento nucleare per una struttura della cromatina rilassato descritta come una caratteristica pluripotenza correlati 18. La presenza di nuclei vacuolate e citoplasma granulare, nonché un aumento morfologia appiattire, erano evidenti. Tutte le modifiche morfologiche descritte possono essere praticamente usato come marcatore completamento della prima parte del protocollo di conversione; nella nostra esperienza, quando i cambiamenti sono presenti, 5-aza-CR ha infatti aiutato le cellule per acquisire uno stato più permissivo.
E 'possibile usufruire di questo transitori "alti permisfinestra temporale sività "per guidare le cellule verso un fenotipo completamente diverso. La presente protocollo dimostra che i fibroblasti messaggio 5-aza-CR possono essere reindirizzate cellule simili alle cellule pancreatiche beta, in risposta ad un mezzo di differenziazione specifica. Il protocollo usato consentono alle cellule di passare da un mesoderma derivato tipo di cellula di una popolazione di cellule appartenenti alla stirpe endoderma.
Insulina, che in origine era rilevabile in fibroblasti cutanei non trattati, era positivo alla fine del protocollo di differenziazione (Figura 3B). Questo è stato accompagnato dall'espressione contemporanea di altri fattori, come PDX1, coinvolti nella differenziazione di tutta del pancreas esocrino - suo, endocrino e popolazioni cellulari duttale, accanto alla specifica lineage cellule beta. Ciò è coerente con precedenti lavori sulle cellule staminali embrionali di topo (ESC) che indica che una differenziazione corretta in beta-cellule è stata raggiunta solo quando le cellule immature sono stati stratificati con Othecellule endocrine R 19, suggerendo che il locale micro-ambiente fornito dalla isole pancreatiche di Langerhans architettura ha un forte ruolo funzionale.
Infatti, EPICC raggiunto un fenotipo differenziato maturo e ha mostrato la capacità di rispondere a 20 mM esposizione glucosio (Figura 3). L'insulina è stata attivamente secreta nel terreno di coltura dopo 1 ora di stimolazione D-glucosio, confermando la natura in buona fede di EPICC come quelle che producono insulina (Figura 3C).
Un requisito distinta per una procedura di successo è rigoroso mantenimento delle cellule a 37 ° C, in tutte le fasi, tra loro manipolazione sotto flusso laminare sterile e il microscopio. Nella nostra esperienza, è anche altamente raccomandato per preparare i reagenti di fresco, prima del loro utilizzo nella cultura e per aggiornare medio rigorosamente secondo il protocollo. Questa operazione deve essere eseguita al microscopio poiché le formanti celle di aggregazionepossono staccarsi dal fondo del piatto cultura e perso durante cambiamenti medi.
Il protocollo di conversione epigenetica è stato anche applicato con successo alla specie suina, nonché al cane (manoscritto presentato), utilizzando lo stesso numero di cellulare / cm 2 e la concentrazione dell'agente de-metilazione descritto per gli esseri umani.
In conclusione, un protocollo che permette la conversione dei fibroblasti cutanei in un altro tipo di cellula è presentato qui. La strategia descritta presenta i vantaggi di una conversione cellule epigeneticamente basata: vale a dire la possibilità di evitare uno stato pluripotente che potrebbe lasciare dietro cellule capaci di provocare il cancro; l'eliminazione di fattori genetici esogeni che potrebbero causare cambiamenti persistenti nelle cellule. Questi vantaggi rendono l'attuale approccio molto promettente per le applicazioni di medicina traslazionale e consente per la terapia delle cellule specifiche del paziente.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Carraresi e Fondazione Europea per lo Studio del Diabete (EFSD). GP è supportato da una borsa di studio post-dottorato dell'Università degli Studi di Milano. Gli autori sono membri del COST FA1201 Epiconcept: ambiente epigenetica e Periconception e l'azione COST BM1308 condivisione avanza su grandi modelli animali (SALAAM). TALB è membro del COST CM1406 epigenetica Chemical Biology (EPICHEM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
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