Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

تنظيم وفرة البروتين ضروري لكل عملية الخلوية تقريبا. تعكس البروتين وفرة التكامل بين معدلات تخليق البروتين وتدهور البروتين. العديد من فحوصات الإبلاغ عن وفرة البروتين (على سبيل المثال، لمرة واحدة نقطة النشاف الغربي، وتدفق الخلوي، المجهري مضان، أو المقايسات مراسل القائم على النمو) لا تسمح التمييز من آثار النسبية للترجمة والتحلل البروتيني على مستويات البروتين. توضح هذه المقالة استخدام مطاردة سيكلوهيكسيميد تليها الغربية النشاف لتحليل تحديدا تدهور البروتين في حقيقي النواة وحيدة الخلية النموذجية، خميرة الخباز (مهدها الخميرة). في هذا الإجراء، يتم تحضين الخلايا الخميرة في وجود سيكلوهيكسيميد متعدية المانع. يتم جمع أجزاء مأخوذة من خلايا مباشرة بعد وعند نقاط زمنية محددة بعد إضافة سيكلوهيكسيميد. وهي lysed الخلايا، ويتم فصل لست] من قبل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد FOص تحليل لطخة الغربي من وفرة البروتين في كل نقطة زمنية. يسمح الإجراء سيكلوهيكسيميد مطاردة تصور حركية تدهور سكان الولاية ثابت من مجموعة متنوعة من البروتينات الخلوية. ويمكن استخدام هذا الإجراء لتحقيق متطلبات الوراثية للوالتأثيرات البيئية على تدهور البروتين.

Introduction

البروتينات تؤدي وظائف مهمة في كل عملية الخلوية تقريبا. تتطلب العديد من العمليات الفسيولوجية وجود بروتين معين (أو البروتينات) لفترة محددة من الزمن أو في ظل ظروف معينة. لذا الكائنات مراقبة وتنظيم وفرة البروتين لتلبية احتياجات الخلوية 1. على سبيل المثال، الحلقيات (البروتينات التي تتحكم في انقسام الخلايا) موجودة في مراحل محددة من دورة الخلية، وارتبط فقدان مستويات السيكلين المنظمة مع تشكيل الورم الخبيث 2. بالإضافة إلى تنظيم مستويات البروتين لتلبية احتياجات الخلوية، وخلايا توظف آليات الهادمة لمراقبة الجودة للقضاء تتجمع، غير المجمعين، أو الشاذة إلا جزيئات البروتين 3. السيطرة على وفرة البروتين ينطوي على تنظيم كل من تخليق الجزيئات (النسخ والترجمة) وتدهور (RNA الانحلال والتحلل البروتيني). ضعف أو الإفراط في تدهور البروتين يساهم في أمراض متعددة، بما في ذلك السرطان، والتليف الكيسي، والظروف العصبية، واضطرابات القلب والأوعية الدموية 4-8. وبالتالي تمثل آليات بروتين الأهداف العلاجية واعدة لمجموعة من الأمراض 9-12.

تحليل البروتينات عند نقطة زمنية واحدة (على سبيل المثال، لطخة الغربية 13، وتدفق الخلوي 14، أو المجهري مضان 15) على لقطة من مطردة البروتين وفرة الدولة دون الكشف عن الإسهامات النسبية للتركيب أو تدهورها. وبالمثل، تعكس المقايسات مراسل القائم على نمو مستويات البروتين حالة مستقرة على مدى فترة زمنية طويلة دون التمييز بين تأثيرات التوليف وتدهور 15-20. فمن الممكن أن نستنتج مساهمة العمليات الهادمة لمستويات البروتين حالة مستقرة من خلال مقارنة وفرة قبل وبعد تثبيط مكونات محددة لآلية الهادمة (على سبيل المثال، عن طريق تعطيل دواء والمتواجدكتبها asome 21 أو ضرب الجينات افترض أن تكون هناك حاجة لتدهور 13). أي تغيير في مستويات البروتين حالة مستقرة بعد تثبيط مسارات الهادمة دليلا قويا للمساهمة التحلل البروتيني إلى السيطرة على البروتين وفرة 13. ومع ذلك، فإن مثل هذا التحليل لا يزال لا يوفر معلومات حول حركية دوران البروتين. مطاردة سيكلوهيكسيميد تليها الغربية النشاف تتغلب على نقاط الضعف هذه من خلال السماح للباحثين لتصور تدهور البروتين مع مرور الوقت 22-24. وعلاوة على ذلك، لأنه كشف عن البروتين بعد مطاردة سيكلوهيكسيميد تتم عادة من قبل النشاف الغربي، النظائر المشعة والخطوات مناعي طويلة ليست مطلوبة لمطاردة سيكلوهيكسيميد، على عكس العديد من التقنيات مطاردة نبض شيوعا، والتي تتم أيضا إلى تصور تدهور البروتين 25.

وقد تم تحديد سيكلوهيكسيميد أولا كمركب مع المضادة للفطريات السليمالعلاقات التي تنتجها السبحية البكتيريا إيجابية الجرام سنجابي 26،27. وهو جزيء خلايا قابلة للاختراق الذي يمنع على وجه التحديد عصاري خلوي حقيقيات النوى (ولكن ليس organellar) الترجمة عن طريق إضعاف الريباسي النبات 28-31. في تجربة سيكلوهيكسيميد مطاردة، يضاف سيكلوهيكسيميد إلى الخلايا، ويتم جمع aliquots من الخلايا فورا وعند نقاط زمنية محددة بعد إضافة مركب 22. وهي lysed الخلايا، ويتم تحليل وفرة البروتين في كل نقطة زمنية، وعادة من قبل لطخة غربية. انخفاض في وفرة البروتين بعد إضافة سيكلوهيكسيميد يمكن أن يعزى بثقة إلى تدهور البروتين. سوف بروتين غير مستقر نقصان في وفرة مع مرور الوقت، في حين أن البروتين مستقر نسبيا سوف يحمل تغيرا طفيفا في وفرة.

وقد آليات تدهور البروتين انتقائية الحفظ جدا في جميع أنحاء حقيقيات النوى. وعلم لأول مرة بكثير من ما هو معروف عن تدهور البروتين فيوحقيقي النواة وحيدة الخلية نموذج، خميرة الخباز (مهدها الخميرة) 25،32-36. ومن المرجح أن يواصل تقديم رؤى جديدة وهامة في تدهور البروتين الدراسات مع الخميرة. تم توضيح طريقة لمطاردة سيكلوهيكسيميد في خلايا الخميرة يليه تحليل لطخة الغربي من وفرة البروتين هنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. النمو والحصاد من خلايا الخميرة

  1. إن لم يكن تحليل حركية تدهور بروتين الخميرة الذاتية، وتحويل الخميرة المطلوب سلالة (s) مع ترميز البلازميد بروتين من الفائدة. وقد وصفت وسائل موثوق بها للتحول الخميرة سابقا 37.
  2. تطعيم الخميرة في 5 مل من المتوسط ​​المناسب (على سبيل المثال، انتقائية الاصطناعية تعريف (SD) المتوسطة للصيانة بلازميد من الخلايا تحولت أو (YPD) متوسطة غير انتقائي خلاصة الخميرة، ببتون-الدكستروز للخلايا غير حولت). احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، بالتناوب.
    ملاحظة: 30 درجة مئوية هي درجة الحرارة نمو الأمثل لنموذجي من النوع البري سلالات الخميرة مختبر 38. ومع ذلك، لأن بعض سلالات الخميرة متحولة لا تنمو بالشكل الأمثل عند 30 درجة مئوية وبعض البروتينات الخسف التي تعتمد على درجة الحرارة، ودرجات الحرارة المستخدمة لنمو الخلايا الخميرة ومطاردة سيكلوهيكسيميد يجب أن تحدد تجريبيا 39.
  3. قياس عشرالبريد الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) من كل ثقافة بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: قد تكون الخلايا في مرحلة النمو لوغاريتمي أو ثابتة ولكن ينبغي أن يكون وصلت الحد الأدنى كثافة من شأنها أن تسمح التخفيف إلى OD 600 = 0.2 في 15 مل من المتوسط ​​الطازجة.
  4. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها إلى OD 600 قيمة 0.2 في 15 مل من المتوسط ​​الطازجة.
  5. احتضان الخميرة في 30 درجة مئوية، والهز حتى الخلايا تصل إلى مرحلة النمو منتصف لوغاريتمي (اي ان يكون OD 600 بين 0.8 و 1.2).
  6. خلال نمو الخلايا الخميرة، نفذ ما يلي في التحضير لإجراء سيكلوهيكسيميد مطاردة:
    1. تعيين كتلة الحرارة التي يمكن أن تستوعب 15 مل أنابيب مخروطية إلى 30 درجة مئوية لمدة الحضانة من الخلايا في وجود سيكلوهيكسيميد. يضاف الماء إلى آبار كتلة الحرارة للسماح توزيع الحرارة كفاءة الثقافات. يضاف الماء إلى كل هذا جيدا أن 15 مل أنبوب مخروطي الشكل سوف يتسبب في منسوب المياه في الارتفاع، ولكن لا تجاوز، الشفة من البئر.
    2. تعيين كتلة حرارة الثانية التي يمكن أن تستوعب 1.5 مل أنابيب microcentrifuge إلى 95 درجة مئوية لمدة تمسخ البروتين بعد تحلل الخلية.
    3. قبل دافئ متوسطة النمو الطازجة (1.1 مل في نقطة زمنية في الثقافة إلى أن يعاير) إلى 30 درجة مئوية.
    4. إضافة 50 ميكرولتر 20x ووقف مزيج ما قبل المسمى أنابيب microcentrifuge (أنبوب واحد في وقت نقطة لكل ثقافة أن يعاير). وضع أنابيب على الجليد.
      تنبيه: أزيد الصوديوم، وهو عنصر في 20x ووقف ميكس، هي سامة عن طريق الابتلاع عن طريق الفم أو ملامسة الجلد. اتبع توصيات الشركة المصنعة عند إعداد وتخزين ومعالجة أزيد الصوديوم. في حال التعرض العرضي، والتشاور المادية ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
  7. عندما وصلت إلى خلايا نمو متوسطة لوغاريتمي، وجمع 2.5 OD 600 وحدة من كل ثقافة في نقطة زمنية إلى أن يعاير (على سبيل المثال، 7.5 OD 600 وحدة لتحليل وفرة البروتين في ثلاث نقاط الوقت). أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها الخلايا في أنابيب مخروطية 15 مل في 3،000 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: واحد OD 600 وحدة مساوية لكمية من الخميرة الموجودة في 1 مل الثقافة في لOD 600 من 1.0. يمكن تحديد حجم الثقافة (في مل) المطلوبة لحصاد X OD 600 وحدة (V) ​​باستخدام المعادلة التالية: V = X OD 600 وحدة / قياس OD 600. على سبيل المثال، لحصاد 7.5 OD 600 وحدة زراعة الخلايا الخميرة في وOD 600 من 1.0، وجمع 7.5 OD 600 وحدة / 1.0 = 7.5 مل الثقافة الخميرة.
  8. resuspend كل بيليه خلية في 1 مل من 30 درجة مئوية (قبل تحسنت) متوسط ​​نمو جديدة في 2.5 OD 600 وحدة من الخلايا (على سبيل المثال، 3 مل 7.5 OD 600 وحدة).

2. سيكلوهيكسيميد تشيس

  1. تتوازن تعليق خلية الخميرة التي كتبها حضانة لمدة 5 دقائق في كتلة C الحرارة 30 درجة.
  2. إعداد جهاز توقيت لالعد حتى من 00:00.
  3. للبدء في مطاردة سيكلوهيكسيميد، اضغط على "ابدأ" على جهاز ضبط الوقت. بسرعة،ولكن بعناية، قم بالخطوات التالية:
    1. إضافة سيكلوهيكسيميد إلى التركيز النهائي من 250 ميكروغرام / مل إلى تعليق الخلية الأولى الخميرة (على سبيل المثال، إضافة 37.5 ميكرولتر من 20 ملغ / مل الأسهم سيكلوهيكسيميد إلى 3 مل من التعليق الخلية)، ودوامة لفترة وجيزة لخلط.
      تنبيه: سيكلوهيكسيميد غير مهيج الجلد وسامة عن طريق الابتلاع عن طريق الفم. اتبع توصيات الشركة المصنعة عند إعداد وتخزين ومعالجة سيكلوهيكسيميد. في حال التعرض العرضي، والتشاور المادية ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
    2. فورا بعد إضافة سيكلوهيكسيميد وvortexing ل، ونقل 950 ميكرولتر (~ 2.4 OD 600 وحدة) من تعليق خلية الخميرة مع سيكلوهيكسيميد إضافة إلى أنبوب microcentrifuge قبل المسمى يحتوي على 50 ميكرولتر مزيج 20x وتوقف الجليد الباردة. دوامة أنبوب microcentrifuge، ومكان على الجليد حتى يتم جمع كل العينات.
    3. إعادة تعليق خلية الخميرة إلى 30 درجة مئوية.
  4. كرر الخطوات من 2.3.1 خلال 2.30.3 لكل من تعليق خلية الخميرة المتبقية على فترات زمنية منتظمة (على سبيل المثال، كل 30 ثانية، بحيث يضاف سيكلوهيكسيميد إلى نموذج رقم 1 الساعة 0:00، نموذج رقم 2 في 00:30، نموذج رقم 3 في الساعة 1:00 ، الخ.).
  5. في كل نقطة زمنية لاحقة، تعليق دوامة الخميرة خلية ونقل 950 ميكروليتر إلى أنابيب microcentrifuge المسمى يحتوي على 50 ميكرولتر قبل المبردة 20x ووقف ميكس. دوامة ومكان جمع الخلايا على الجليد. العودة أنابيب مخروطية 15 مل إلى 30 درجة مئوية كتلة الحرارة.
    1. على سبيل المثال، لمجموعة من الخلايا 30 دقيقة بعد إضافة سيكلوهيكسيميد (على افتراض 30 ثانية فترات بين الجمع سيكلوهيكسيميد إلى تعليق خلية الخميرة في بداية دورة زمنية)، دوامة وإزالة 950 ميكرولتر من تعليق خلية من عينة # 1 في 30:00 . تكرار لنموذج رقم 2 في 30:30، وهلم جرا.
      ملاحظة: لمنع تسوية من الخميرة، تعليق خلية دوامة في أنابيب مخروطية 15 مل تقريبا كل 5 دقائق طوال فترة المطاردة. بدلا من ذلك، تعليق خلية الخميرةالصورة يمكن الاحتفاظ بها في حمام مائي التحريض مستمر لمدة التجربة سيكلوهيكسيميد مطاردة.
  6. عندما تم جمع كل العينات، بيليه جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6500 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح. الخلايا هي الآن جاهزة للتحلل القلوية. بدلا من ذلك، والمفاجئة تجميد مكعبات الخلايا في النيتروجين السائل ومخزن في -80 درجة مئوية.

3. بعد القلوية البروتين استخراج (معدلة من 16،40)

  1. إضافة 100 ميكرولتر من الماء المقطر إلى كل خلية بيليه. و resuspend pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل.
  2. إضافة 100 ميكرولتر من 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم إلى كل عينة. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل.
  3. احتضان خلايا معلق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. في هذه المرحلة، لم هي lysed خلايا الخميرة، والتي لم يتم الافراج عن البروتينات 40.
  4. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 18000 x ج في المزاج الغرفةature لمدة 30 ثانية. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح.
  5. ليز الخلايا، إضافة 100 ميكرولتر من العازلة عينة Laemmli إلى كل خلية بيليه. و resuspend pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل.
    ملاحظة: حضانة متتابعة من الخلايا التي تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم وLaemmli النشرات عينة العازلة البروتينات في شكل متوافق مع دوديسيل الصوديوم وكبريتات إس دي إس بايج (SDS-PAGE) باستخدام نظام المخزن تشغيل تريس، جليكاين.
  6. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد تماما البروتينات.
    ملاحظة: الحضانة في 95 ° C قد لا تكون مناسبة لتحليل البروتينات التي تكون عرضة لتجميع (على سبيل المثال، والبروتينات مع عدة قطاعات الغشاء). قد تصبح هذه البروتينات غير قابلة للذوبان عندما حضنت في درجات حرارة مرتفعة 41. وبالتالي، لتحليل هذه البروتينات، ينبغي المحتضنة لست] في درجات حرارة منخفضة (على سبيل المثال، 37 درجة مئوية - 70 درجة مئوية) لمدة 10 - 30 دقيقة، كما تحدد تجريبيا.
  7. لست] أجهزة الطرد المركزي في 18000 x ج في ريال عمانيدرجة الحرارة أوم لمدة 1 دقيقة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان. طاف (بالفاعلات البروتين المستخرج) جاهز للانفصال من قبل SDS-PAGE واللاحقة تحليل لطخة الغربي. بدلا من ذلك، لست] مخزن في -20 درجة مئوية.

4. ممثل SDS-PAGE والغربية والإجراءات التنشيف (مقتبس من 16)

  1. البروتين تحميل معايير الوزن الجزيئي وحجم مصمم تجريبيا للست] على هلام SDS-PAGE.
    ملاحظة: اختر نسبة الأكريلاميد ومكررا الأكريلاميد في هلام SDS-PAGE على أساس الوزن الجزيئي للبروتين من الفائدة. بشكل عام، وانخفاض المواد الهلامية نسبة أكثر ملاءمة لحل أعلى البروتينات ذات الوزن الجزيئي.
  2. وصلت تشغيل هلام في 200 V حتى الجبهة صبغ الحافة السفلية من هلام.
  3. نقل البروتينات من الهلام إلى فلوريد البولي (PVDF) الغشاء عن طريق التحويل الرطب في 20 V ل60-90 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  4. منع غشاء التي يحتضنها في تريس مخزنة المالحة (السلS) التي تحتوي على الحليب الخالي من الدسم 5٪، هزاز، في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
    ملاحظة: لمنع نمو الجراثيم في وجود غشاء حضنت بين عشية وضحاها، فمن المستحسن أن تشمل أزيد الصوديوم في عرقلة الحل في تركيز النهائي من 0.02٪.
  5. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة للبروتين من الفائدة في TBS مع 0.1٪ توين 20 (TBS / T)، والحليب الخالي من الدسم 1٪، هزاز، في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  6. يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز.
  7. احتضان الغشاء مع المناسبة الضد الثانوي fluorophore مترافق في TBS / T مع الحليب الخالي من الدسم 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، هزاز.
    ملاحظة: Fluorophores وحساسة للضوء. لذلك، التخفيفات الأجسام المضادة مترافق fluorophores يجب أن تكون مستعدة في الظلام، وحضانة للأغشية في وجود الأجسام المضادة مترافق fluorophores والخطوات اللاحقة غسل ينبغي أن يحدث في lightproof (على سبيل المثال، احباط الملفوفة) شاركntainers.
  8. يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز.
  9. صورة غشاء باستخدام LI-COR أوديسي CLX والبرمجيات صورة ستوديو (أو معدات التصوير مقارنة والبرمجيات)، بناء على توصيات الشركة المصنعة.
  10. بعد الحصول على صورة غشاء، واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة لبروتين تحكم تحميل في TBS / T مع الحليب الخالي من الدسم 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، هزاز.
  11. يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز.
  12. احتضان الغشاء مع المناسبة الضد الثانوي fluorophore مترافق في TBS / T مع الحليب الخالي من الدسم 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، هزاز.
  13. يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز.
  14. غشاء صورة كما في الخطوة 4.9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتوضيح منهجية مطاردة سيكلوهيكسيميد، تم تحليل استقرار Deg1 -Sec62 (الشكل 1)، وهذا نموذج الخميرة الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) تدهور -associated (ايراد) الركيزة، 42-44. في ايراد، ومراقبة الجودة الانزيمات اليوبيكويتين يغاز إرفاق تساهمي سلاسل من اليوبيكويتين بروتين صغيرة لالبروتينات الشاذة مترجمة إلى غشاء ER. تتم إزالة هذه البروتينات polyubiquitylated في وقت لاحق من لائحة وتدهورت قبل proteasome و، كبير، البروتيني عصاري خلوي 45. ويستهدف هذا البروتين Deg1 -Sec62 للتدهور بعد ذلك باستمرار وaberrantly يشرك translocon، قناة تسهل النبات البروتين في التجويف ER أو غشاء 43. وبالمثل، ئي الثدييات باء، وهو عنصر البروتين من البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة، يشارك باستمرار في translocon ER، وبعد ذلك يخضع التدهور من خلال آلية ذات الصلة عند شفة لهاشركاء ملزم معرف غائبة 46-48. وهكذا، تحليلات تدهور Deg1 -Sec62 في خلايا الخميرة قد تسفر التبصر في تدهور البروتينات التي بإصرار أو aberrantly إشراك translocon، ووصف مؤقتا اراد-T (مقابل translocon المرتبطة بها) ركائز 43.

وقد أشارت دراسات سابقة إلى أن مهام Hrd1-ER المقيمين اليوبيكويتين يغاز مع انزيم التصريف اليوبيكويتين Ubc7 لتحفيز تدهور Deg1 -Sec62 16،42-44. بروتين الغشاء Cue1 المراسي Ubc7 إلى غشاء ER وينشط الإنزيم 49-51. ومع ذلك، لم يتم التحقيق مباشرة شرطا لCue1 ​​في تدهور Deg1 -Sec62. لاختبار الفرضية القائلة بأن Cue1، مثل Hrd1 وUbc7، مطلوب لتدهور كفاءة Deg1 -Sec62، تعرض من النوع البري وخلايا الخميرة متحولة معربا عن Deg1 -Sec62 لمطاردة سيكلوهيكسيميد ووستحليل لطخة الخرشنة (الشكل 2A). البروتين Deg1 -Sec62 يهاجر على SDS-PAGE كما أنواع متعددة. وهذا يتفق مع الدراسات السابقة التي أظهرت تعديل واسع في مرحلة ما بعد متعدية من البروتين 43،44،52. في خلايا الخميرة من النوع البري، كان Deg1 -Sec62 المتدهورة بسهولة. كما لوحظ سابقا، وفقدان إما Hrd1 أو Ubc7 استقرت إلى حد كبير البروتين Deg1 -Sec62 42-44. وكما كان متوقعا، فقد استقرت Deg1 -Sec62 في غياب Cue1 (إلى حد مماثل في غياب Ubc7)، مما يؤكد وجود دور للبروتين Ubc7-التفاعل في ايراد-T.

وكميا نسبة البروتين Deg1 -Sec62 المتبقية في كل نقطة زمنية وتآمر في الشكل 2B. ونلاحظ أن معدل ما يبدو من اختفاء Deg1 -Sec62 في البرية من نوع الخلايا قد يكون التقليل من معدل تدهور الوليدة Deg1 -Sec62(أي نصف الحياة البروتين، والذي يمكن تحديده بشكل مباشر عن طريق تحليل نبض مطاردة 43). لأنه من النوع البري الخميرة تتحلل بنشاط بروتين Deg1 -Sec62 قبل إضافة سيكلوهيكسيميد، يتم تقليل وفرة حالة مستقرة من Deg1 -Sec62 إلى حد كبير في هذه الخلايا (مقارنة مع الخلايا التي تضعف تدهور). وهذا يمكن أن يكون موضع تقدير من خلال مقارنة وفرة Deg1 -Sec62 في نقطة زمنية الأولية لكل سلالة في الشكل 2A. وعلاوة على ذلك، أي حيوانية مقاومة للتحلل البروتين الركيزة (على سبيل المثال، إذا يتراكم البروتين في برك داخل الخلايا التي يتم منع تدهور) قد تظهر استقرارا نسبيا في الخلايا من النوع البري على مدار الساعة من التجربة.

الشكل 1
الشكل 1. نموذج لتدهور Deg1 -Sec62 التالية الشاذة إشراك Translocon (A) تصوير تخطيطي Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 تتكون من العناصر التالية، في تسلسل:. Deg1 (67 الأحماض الأمينية الأمينية محطة من الخميرة قامع النسخي MATα2)، وهو العلم (F) حاتمة، البروتين 2-الغشاء Sec62، ونسختين من المكورات العنقودية الذهبية البروتين (برا). (ب) بعد الإدراج المشترك متعدية الطبيعي للشرائح الغشاء وهما في غشاء الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا)، جمعية المستمرة من Deg1 -Sec62 مع translocon يطلق الشاذ، Deg1 معتمد على، بعد متعدية المشاركة translocon. جزء من محطة الأمينية عصاري خلوي يدخل وaberrantly على الأرجح لا يزال داخل وtranslocon. (C) في أعقاب اشتباك translocon، واليوبيكويتين يغاز Hrd1 ubiquitylates Deg1 -Sec62. ويساعد Hrd1 من قبل انزيم التصريف اليوبيكويتين Ubc7، الذي يرتكز في غشاء ER التي كتبها Cue1. يو بي، أحادية البروتين اليوبيكويتين. يستخرج (D) Ubiquitylated Deg1 -Sec62 من غشاء ER والمتدهورة التي proteasome و، والتخفيف من translocon إعاقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. سيكلوهيكسيميد تشيس تليها الغربية التنشيف يشير إلى أن Cue1 هو مطلوب لكفاءة تدهور Deg1 -Sec62. تحولت خلايا (A) الخميرة من المورثات المشار إليها مع الخميرة القسيم المركزي ترميز البلازميد Deg1 -Sec62 (pRS416 ف MET25 - Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA، AmpR / URA3 43) وتعرض لتحليل سيكلوهيكسيميد مطاردة. بروتينتم فصل الصورة من كل نقطة زمنية (أي ما يعادل 0.125 OD 600 وحدة) على 8٪ هلام SDS-PAGE والكشف عن طريق ويسترن النشاف مع الأجسام المضادة الثانوية أرنب لمكافحة فأر، التي تربط مباشرة الحواتم البروتين C-الطرفية من Deg1 - Sec62 البروتين الانصهار. كما تحكم التحميل، وحضنت الغشاء في وقت لاحق مع الأجسام المضادة المحددة لPgk1. لقد تم نسخ هذه التجربة ثلاث مرات؛ المصورة نتائج ممثل. (ب) الكمي للبيانات في الفقرة (أ) تم تنفيذها باستخدام برامج التصوير (انظر الجدول المواد). تم تحديد كثافة مضان الإجمالية للمنطقة تشمل البروتين Deg1 -Sec62 لكل عينة. تم استقراء خلفية كثافة مضان لكل عينة من متوسط ​​كثافة مضان من بكسل بالقرب من البروتين Deg1 -Sec62. تم طرح هذا كثافة مضان الخلفية استقراء من إجمالي كثافة مضان أن تسفر fluoresc المعدل كثافة سينعقد لكل عينة. أجريت التحديد الكمي مماثلة لمجموعه، الخلفية، وكثافة مضان المعدلة لPgk1، وهو بروتين تحكم التحميل التي لا تختلف في الظروف يعاير وفرة. للمقارنة بين وفرة البروتين Deg1 -Sec62 بين العينات، تم تحديد نسبة من شدة إشارة تعديل من Deg1 -Sec62 إلى Pgk1 لكل عينة. وقد تم تعريف نسبة Deg1 -Sec62 / Pgk1 إلى 100٪ للنقطة لأول مرة (أي مباشرة بعد إضافة سيكلوهيكسيميد) لكل سلالة قيد التحليل. كمية Deg1 -Sec62 المتبقية في نقطة زمنية لاحقة (أي نسب Deg1 -Sec62 / Pgk1) تم حسابها كنسبة مئوية من نسبة Deg1 -Sec62 / Pgk1 عند نقطة لأول مرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الآثار البيئية، مع next.within صفحة = "دائما">
الاصطناعية تعريف (SD) الحد الأدنى من الخميرة المتوسطة 2٪ سكر العنب، 0.67٪ قاعدة الخميرة النيتروجين دون الأحماض الأمينية، 0.002٪ الأدنين، 0.004٪ اليوراسيل، 0.002٪ أرجينين، 0.001٪ الحامض الاميني، 0.006٪ آيسولوسين، 0.006٪ ليسين، 0.004٪ ليسين، 0.001٪ ميثيونين، 0.006٪ فينيل ألانين، 0.005 ٪ ثريونين، 0.004٪ التربتوفان. للصلب (لوحة) المتوسطة، وتشمل 2٪ أجار. يتم إعداد 1. المتوسطة الانتقائي عن طريق حذف حمض أميني المناسب (ق) أو القواعد النيتروجينية.
2. للراحة، فإنه يجوز الإبقاء على هذه المكونات كحلول الأسهم تتركز على النحو التالي. ويمكن الاحتفاظ الأحماض الأمينية كحل 100X الأسهم التي تحتوي على جميع الأحماض الأمينية المطلوبة. ويمكن الاحتفاظ الخميرة قاعدة النيتروجين في حل 20x والأوراق المالية (13.4٪). فإنه يجوز الإبقاء على سكر العنب في 40٪ محلول المخزون. ويمكن الاحتفاظ الأدينين واليوراسيل من 1٪ الحلول الأسهم في 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم.
3.تعقيم متوسطة قبل التعقيم.
استخراج-ببتون خميرة سكر العنب (YPD) ريتش الخميرة المتوسطة 1٪ خلاصة الخميرة، 2٪ ببتون، 2٪ سكر العنب (اختياري: 0.002٪ الأدنين). للصلب (لوحة) المتوسطة، وتشمل 2٪ أجار. 1. لمنع النمو البطيء ومميزة تلوين حمراء معينة سلالات الخميرة مختبر في غياب (أو منخفضة وفرة) من الأدنين، ويمكن أن يضاف الأدنين إلى متوسطة النمو YPD.
2. للراحة، فإنه يجوز الإبقاء على بعض المكونات كحلول الأسهم تتركز على النحو التالي. فإنه يجوز الإبقاء على سكر العنب في 40٪ محلول المخزون. فإنه يجوز الإبقاء على الأدنين كحل الأسهم بنسبة 1٪ في 0.1 م هيدروكسيد الصوديوم.
3. تعقيم متوسطة قبل التعقيم.
20x ووقف ميكس 200 ملي أزيد الصوديوم، 5 ملغ / مل ألبومين المصل البقري أزيد الصوديوم السامة عن طريق الابتلاع عن طريق الفم أو ملامسة الجلد. اتبع الشركة المصنعةتوصيات عند إعداد وتخزين ومعالجة أزيد الصوديوم. في حال التعرض العرضي، والتشاور المادية ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
20 ملغ / مل سيكلوهيكسيميد 1. إعداد في الإيثانول. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
2. سيكلوهيكسيميد هو مهيج الجلد وسامة عن طريق الابتلاع عن طريق الفم. اتبع توصيات الشركة المصنعة عند إعداد وتخزين ومعالجة سيكلوهيكسيميد. في حال التعرض العرضي، والتشاور المادية ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
0.2 M هيدروكسيد الصوديوم إعداد في الماء. هيدروكسيد الصوديوم يتفاعل مع الزجاج. لذلك، لتخزين على المدى الطويل، وينبغي الحفاظ 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم في حاويات من البلاستيك.
العازلة عينة Laemmli 2٪ SDS، 10٪ الجلسرين، 5٪ و# 946؛ -mercaptoethanol، 60 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 0.008٪ برموفينول الأزرق وغالبا ما أعد 1. العازلة عينة Laemmli عن طريق تمييع الأسهم أكثر تركيزا (على سبيل المثال، 5X).
2. يمكن إضافة برموفينول الأزرق صبغ للكثافة المطلوبة. و"قرصة" (كمية صغيرة جدا استغلالها من على حافة ملعقة) هو عادة كافية.
Laemmli تشغيل العازلة (5X) 125 ملي تريس، 960 ملي الجلايسين، 0.5٪ SDS لإعداد 1 لتر من 1X Laemmli تشغيل العازلة، وتمييع 1: 5 في DH 2 O.
نقل تريس خلات-SDS العازلة (5X) 125 ملي تريس خلات (الرقم الهيدروجيني 8.8)، 960 مم الجلايسين، 0.05٪ SDS لإعداد 20 لتر من 1X تريس خلات-SDS نقل العازلة، والجمع بين 4 لتر ​​من الأسهم 5X، 4 لتر ​​من الميثانول، و 12 L من درهم 2 O.
10X تريس مخزنة المالحة (TBS) 500 ملي تريس، 1.5 M كلوريد الصوديوم. درجة الحموضة تعديلها إلى 7.5 لإعداد 1 لتر من 1X TBS، وتمييع 01:10 في DH 2 O. 1X TBS يمكن أن تستكمل مع المنظفات توين-20 و الحليب الخالي من الدسم مسحوق، حسب الاقتضاء.

الجدول 1. الحلول المستخدمة في هذه الدراسة.

اسم سلالة الاسم المستعار التركيب الوراثي ذات الصلة المراجع
VJY42 MHY501 MATα تشن وآخرون، 1993
HIS3-Δ200
leu2-3،112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY47 YWO55. MHY507 MATα Jungmann وآخرون، 1993؛ روبنشتاين وآخرون، 2012
HIS3-Δ200
leu2-3،112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105. MHY1364 MATα Biederer وآخرون، 1997؛ رابيد وآخرون، 2006
HIS3-Δ200
leu2-3،112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MATα هذه الدراسة
HIS3-Δ200
leu2-3،112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1Δ :: kanMX4

الجدول 2. سلالات الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة. جميع سلالات هي مسانج مع MHY500 53. وصفت VJY42، VJY47، وVJY56 سابقا 49،53،54. جيل مفصل سلالة واستراتيجية تأكيدا لVJY172 (المعد لهذه الدراسة) متوفر عند الطلب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الورقة، وتقدم طريقة لتحليل حركية تدهور البروتين. هذه التقنية يمكن تطبيقها بسهولة إلى مجموعة من البروتينات التي تدهورت بفعل مجموعة متنوعة من الآليات. من المهم أن نلاحظ أن التجارب سيكلوهيكسيميد مطاردة تقرير عن حركية تدهور تجمع الدولة المطرد للبروتين معين. ويمكن استخدام تقنيات أخرى لتحليل حركية تدهور فئات معينة من السكان من البروتينات. على سبيل المثال، يمكن تتبع مصير الهادمة من البروتينية الوليدة من خلال تحليل نبض مطاردة 55. في مثل هذه التجارب، والبروتينات الوليدة هي لفترة وجيزة نبض المسمى (على سبيل المثال، مع الأحماض الأمينية المشعة). يمكن تتبع التغيرات في وفرة من البروتينات الوليدة المسمى (التي قد تكون أو لا تعكس التغييرات في المطردة البروتين وفرة الدولة) مع مرور الوقت.

مطاردة سيكلوهيكسيميد مناسبة لتحليل استقرار البروتين خلال دورة زمنية قصيرة نسبيا (أي ما يصل إلى ساعتين). على مدى أطول وقت جourses (أي اثنين من ساعات إلى أيام)، سيكلوهيكسيميد، مثبط العالمي للترجمة، هي سامة للخلايا، على الأرجح بسبب نضوب اليوبيكويتين 56. وعلاوة على ذلك، يحلل الاستقرار البروتين على دورات زمنية أطول هم أكثر عرضة للخطر بسبب الآثار غير المباشرة للإعاقة على مستوى العالم تخليق البروتين على تدهور البروتين من الفائدة (على سبيل المثال، تدهور البروتين قصيرة الأجل تشارك في تدهور البروتين فائدة). بالتالي أفضل ملاءمة لدراسة تدهور البروتينات طويلة العمر غيرها من التقنيات، مثل نبض مطاردة التجارب وضع العلامات الأيض، هي ويمكن أن تؤدى إلى التثبت من صحة النتائج التي تم الحصول عليها في التجارب سيكلوهيكسيميد مطاردة.

توقيت إضافة سيكلوهيكسيميد ومجموعة من الخلايا هو أحد الاعتبارات الهامة في هذا الإجراء. دقة له أهمية خاصة في تحليل البروتينات قصيرة الأجل جدا، والانحرافات الصغيرة في الوقت انقضى من عدي سيكلوهيكسيميدنشوئها إلى الحصاد خلية يمكن أن يكون لها تأثير كبير على حركية تدهور واضح. وعلاوة على ذلك، من دون خطة واضحة لتنفيذ هذه الخطوات الحساسة للوقت، وهي تجربة قد تؤول بسرعة إلى حالة من الفوضى والإحباط. لهذا السبب، فمن المستحسن أن إضافة سيكلوهيكسيميد على الثقافات في فترات المخطط لها، العادية. واقترح فترات لمدة 30 ثانية في هذا البروتوكول، ولكن توقيت قد يتم تعديلها لتتناسب مع مستوى الراحة والبراعة من المحقق. المحققين المبتدئين قد تجد أنه من المفيد لكتابة جدول مرات جمع العينات قبل البدء في التجربة وشطب كل مجموعة مقررا كما يحدث.

في خطوات 1.7 و 1.8 من بروتوكول الموصوفة هنا، تتركز مزارع الخلايا الخميرة في تقليل أحجام متوسطة النمو لسهولة التلاعب أثناء إجراء سيكلوهيكسيميد مطاردة لاحق. ومع ذلك، الطرد المركزي من خلايا الخميرة يدفع بسرعة معينة استجابات التوتر الخلوي (على سبيل المثال، مسارات مما يشير إلى أنوتفعيلها من خلال الحرمان الجلوكوز) 57،58. ولذلك حذر المحققون ضد فترات طويلة من الطرد المركزي. عند تحليل الاستقرار من البروتينات التي قد تكون حساسة لالطرد المركزي، قد ترغب المحققين لإضافة سيكلوهيكسيميد مباشرة على الثقافات مرحلة منتصف السجل دون الطرد المركزي مسبق. في مثل هذه الحالات، يجب إضافة سيكلوهيكسيميد إلى نفس تركيز النهائي (250 ميكروغرام / مل)، ويمكن حصاد عينات خلية الخميرة التي كتبها المنهجيات التي لا تتطلب خطوة الطرد المركزي الأولية (على سبيل المثال، والترشيح السريع) 57. وعلاوة على ذلك، في خطوات 2،3-2،5، يتم نقل العينات التي تم جمعها في كل نقطة زمنية لمحلول يحتوي على أزيد الصوديوم ووضعها على الجليد. هذه الشروط تمنع استمر تدهور البروتين لمدة المطاردة. وتجدر الإشارة إلى أن أزيد يقلل من تركيز الخلوي للاعبي التنس المحترفين 59، الأمر الذي يعيق تحديدا نشاط البروتياز ATP التي تعتمد على. في حين انخفاض درجة الحرارة ينبغي ليسوتو تقليل المعدل الذي غير ATP التي تعتمد على البروتينات وظيفة العمليات والمحققين يدرسون البروتينات التي تدهورت بفعل هذه الآليات قد تختار بدلا من ذلك لالتقاط تجميد الكريات خلية في النيتروجين السائل كما هو المقطوع كل عينة.

تم تعديل بروتوكول عينة لتحلل الخلايا وبروتوكول ممثل لالنشاف الغربي المدرجة في هذه المخطوطة من التقارير السابقة 16،40. في طريقة تحلل بعد القلوية الموصوفة هنا، هيدروكسيد الصوديوم المعالجة يعزز استخراج البروتينات الخميرة على إضافة لاحقة من عينة العازلة Laemmli. الآلية التي يحدث بها هذا الجهاز يتميز سيئة 40. ومع ذلك، يتم بالفاعلات السكريات مثل تلك التي وجدت في جدران الخلايا الخميرة في الظروف القلوية 60. ولذا فمن المغري إلى التكهن بأن حضانة في وجود هيدروكسيد الصوديوم جزئيا أو كليا spheroplasts خلايا الخميرة (أي يزيل مكونات جدار الخلية)، مما يجعلها أكثر sensitivه إلى SDS المنظفات الموجودة في المخزن المؤقت عينة Laemmli. لأنه يتم الافراج البروتينات في ظل ظروف تغيير طبيعة غاية، ليس من الضروري أن يدرج مثبطات الأنزيم البروتيني في عينة العازلة Laemmli. قد يتم تعديل طريقة محددة للتحلل الخلية بما يتناسب مع تجربة معينة. على سبيل المثال، قد لا تكون الطريقة تحلل بعد القلوية مناسبة للبروتينات وفرة منخفضة أو البروتينات التي يتم الكشف عنها سيئة من قبل لطخة غربية. في مثل هذه الحالات، الأساليب التي تشمل خطوة حمض الخليك ثلاثي الكلور هطول الأمطار على التركيز عينات البروتين قد يكون الأنسب 61. وعلاوة على ذلك، هناك عدة اعتبارات هامة بشأن اختيار الأجسام المضادة، وتحميل السيطرة على اختيار وسيلة بديلة لكشف (على سبيل المثال، النشاف الغربي chemiluminescent باستخدام الفيلم أو التصوير الرقمي الأنظمة) وقد تم مؤخرا مناقشة 16. ويمكن تنفيذ الكميات وفرة البروتين بعد العلاج سيكلوهيكسيميد. وتباع العديد من أنظمة التصوير مع حزم البرمجيات التي تسهلهذا التحليل.

يمكن تنفيذ سيكلوهيكسيميد مطاردة لتحليل تدهور مجموعة متنوعة من البروتينات الخميرة ويمكن تكييفها لدراسة الاستقرار البروتين في الخلايا حقيقية النواة الأخرى. كما هو موضح في هذا البروتوكول، ويتبع العلاج سيكلوهيكسيميد التي تحلل الخلايا والكشف عن وفرة البروتين عن طريق تحليل لطخة غربية. اعتمادا على التطبيق، ومع ذلك، وفرة البروتين بعد العلاج سيكلوهيكسيميد يمكن تقدير من قبل مجموعة من التقنيات، بما يتناسب مع أهداف البحث. على سبيل المثال، إذا كان حجم البروتين ليس عاملا ذا أهمية للتحليل، قد يتعرض لست] الخلية إلى وصمة عار نقطة أو تحليل انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA)، الذي يقدم تقريرا عن وفرة البروتين، ولكن ليس من الواضح الوزن الجزيئي 62. لالبروتينات على سطح الخلية (أو fluorescently الداخلي الموسومة البروتينات الداخلية)، التدفق الخلوي يمكن أن تستخدم لتحديد وفرة البروتين من عينات في أوقات مختلفة بعد سيكلوهيكسيميد إضافة 51. فلووسوف rescence المجهر العلاج سيكلوهيكسيميد التالية تقدم معلومات عن كل من وفرة البروتين وتوطين 18. مجموعة من ركائز والكائنات، والتطبيقات المصب قابلة للمطاردة سيكلوهيكسيميد يجعل هذه التقنية وسيلة مرنة للغاية ومفيدة لدراسة تدهور البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 110،
سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E.,… More

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter