Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Análisis cicloheximida persecución de degradación de proteínas en Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

La regulación de la abundancia de proteínas es crucial para prácticamente todos los procesos celulares. la abundancia de proteínas refleja la integración de las tasas de síntesis de proteínas y la degradación de proteínas. Muchos ensayos de presentación de informes sobre la abundancia de proteínas (por ejemplo, de una sola vez punto de transferencia de western, citometría de flujo, microscopía de fluorescencia, o los ensayos de reportero basadas en el crecimiento) no permiten la discriminación de los efectos relativos de la traducción y la proteolisis en los niveles de proteína. En este artículo se describe el uso de persecución cicloheximida seguido por el Western Blot para analizar específicamente la degradación de proteínas en el eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes). En este procedimiento, las células de levadura se incuban en presencia de cicloheximida inhibidor de la traducción. Las alícuotas de células se recogen inmediatamente después y en puntos específicos de tiempo después de la adición de cicloheximida. Las células se lisaron, y los lisados ​​se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida for análisis de transferencia Western de la abundancia de proteínas en cada punto de tiempo. El procedimiento de persecución cicloheximida permite la visualización de la cinética de degradación de la población en estado estacionario de una variedad de proteínas celulares. El procedimiento puede utilizarse para investigar los requisitos genéticos para y las influencias ambientales sobre la degradación de proteínas.

Introduction

Las proteínas desempeñan funciones cruciales en prácticamente todos los procesos celulares. Muchos procesos fisiológicos requieren la presencia de una proteína específica (o proteínas) durante un período de tiempo determinado o en circunstancias particulares. Por lo tanto, los organismos supervisan y regulan la abundancia de proteínas para satisfacer las necesidades celulares 1. Por ejemplo, las ciclinas (proteínas que controlan la división celular) están presentes en fases específicas del ciclo celular, y la pérdida de los niveles de ciclina regulados se ha asociado con la formación de tumores malignos 2. Además de regular los niveles de proteína para satisfacer las necesidades celulares, las células emplean mecanismos de control de calidad de degradación para eliminar mal plegadas, las moléculas de proteína sin ensamblar, o de otra manera aberrantes 3. El control de la abundancia de proteínas implica regulación tanto de la síntesis de macromoléculas (transcripción y traducción) y la degradación (proteólisis y la decadencia de ARN). degradación de la proteína alterada o excesiva contribuye a múltiples patologías, Incluyendo el cáncer, fibrosis quística, enfermedades neurodegenerativas, y trastornos cardiovasculares 4-8. Por lo tanto, los mecanismos proteolíticos representan dianas terapéuticas prometedoras para una gama de enfermedades 9-12.

Análisis de proteínas en un solo punto de tiempo (por ejemplo, mediante transferencia Western 13, 14 citometría de flujo o microscopía de fluorescencia 15) proporciona una instantánea de la abundancia de proteínas en estado estacionario sin revelar las contribuciones relativas de la síntesis o degradación. Del mismo modo, reportero ensayos basados ​​en el crecimiento reflejan los niveles de proteína en estado estacionario durante un período de tiempo prolongado sin discriminar entre las influencias de la síntesis y degradación de 15-20. Es posible inferir la contribución de los procesos de degradación a los niveles de proteína en estado estacionario mediante la comparación de la abundancia antes y después de la inhibición de los componentes específicos del mecanismo de degradación (por ejemplo, mediante la inactivación de la prote farmacológicamenteasome 21 o la anulación de un gen de la hipótesis de ser necesarios para la degradación 13). Un cambio en los niveles de proteína en estado estacionario después de la inhibición de rutas de degradación proporciona una fuerte evidencia de la contribución de la proteolisis con el control de la abundancia de proteínas 13. Sin embargo, este análisis todavía no ofrece información sobre la cinética de rotación de proteínas. Persecución cicloheximida seguido por el Western Blot supera estas deficiencias, permitiendo a los investigadores visualizar la degradación de proteínas con el tiempo 22-24. Además, debido a la detección de proteínas cicloheximida siguiente persecución se realiza típicamente por el Western Blot, isótopos radiactivos y largos pasos de inmunoprecipitación no son necesarios para la persecución cicloheximida, a diferencia de muchas técnicas de persecución de impulsos de uso común, que también se realizan para visualizar la degradación de proteínas 25.

La cicloheximida se identificó por primera vez como un compuesto con buen anti-hongoslazos producidos por la bacteria Streptomyces griseus gram-positivas 26,27. Es una molécula de células permeable que inhibe específicamente citosólica eucariota (pero no organellar) Traducción al alterar ribosomal translocación 28-31. En un experimento de cicloheximida persecución, se añade la cicloheximida a las células, y las alícuotas de células se recogen inmediatamente y en puntos de tiempo específicos después de la adición del compuesto 22. Las células se lisaron, y se analiza la abundancia de proteínas en cada punto de tiempo, típicamente por Western blot. Las disminuciones en la abundancia de proteínas después de la adición de cicloheximida se puede atribuir a la degradación de proteínas con confianza. Una proteína inestable disminuirá en abundancia con el tiempo, mientras que una proteína relativamente estable exhibirá poco cambio en la abundancia.

Mecanismos de degradación de proteínas selectiva han sido altamente conservado a lo largo Eukarya. Mucho de lo que se conoce acerca de la degradación de proteínas se supo por primera vez enel modelo eucariota unicelular, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) 25,32-36. Los estudios con levaduras es probable que continúen proporcionando nuevos e importantes conocimientos sobre la degradación de proteínas. Un método para la persecución de cicloheximida en células de levadura, seguido por Western blot de la abundancia de proteínas se presenta aquí.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Crecimiento y cosecha de células de levadura

  1. Si no el análisis de la cinética de degradación de una proteína de levadura endógena, transformar la cepa (s) de levadura deseada con un plásmido que codifica la proteína de interés. Métodos fiables para la transformación de levadura se han descrito previamente 37.
  2. Inocular la levadura en 5 ml de medio apropiado (por ejemplo, selectiva definida (SD) medio sintético para el mantenimiento del plásmido de las células transformadas o YPD) medio de levadura no selectivo extracto-peptona-dextrosa (para las células no transformadas). Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación.
    NOTA: 30 ° C es la temperatura óptima para el crecimiento de tipo salvaje típica cepas de levadura de laboratorio 38. Sin embargo, debido a que algunas cepas de levadura mutantes no crecen de manera óptima a 30 ° C y algunas proteínas sufren degradación dependiente de la temperatura, las temperaturas utilizadas para el crecimiento de células de levadura y Chase cicloheximida deben determinarse empíricamente 39.
  3. medir THdensidad óptica a 600 nm de correo (OD 600) de cada cultivo durante la noche.
    NOTA: Las células pueden estar en fase de crecimiento logarítmico o estacionario pero debe haber alcanzado mínimamente una densidad que permita la dilución hasta una DO 600 = 0,2 en 15 ml de medio fresco.
  4. Diluir los cultivos de una noche a un valor de DO 600 de 0,2 en 15 ml de medio fresco.
  5. Incubar levadura a 30 ° C, agitando hasta que las células alcanzan la fase de crecimiento semilogarítmica (es decir, una DO 600 entre 0,8 y 1,2).
  6. Durante el crecimiento de células de levadura, realice lo siguiente para prepararse para el procedimiento de cicloheximida grano:
    1. Establecer un bloque de calor que puede acomodar tubos de 15 ml cónicos a 30 ° C para la incubación de las células en presencia de cicloheximida. Añadir agua a los pozos del bloque de calor para permitir la distribución de calor eficiente a las culturas. Añadir agua a cada pocillo de tal manera que un tubo cónico de 15 ml hará que el nivel de agua a la altura de, pero no desborde, el labio del pozo.
    2. Establecer un segundo bloque de calor que puede acomodar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga a 95ºC para la desnaturalización de proteínas después de la lisis celular.
    3. Pre-caliente medio de cultivo fresco (1,1 ml por punto de tiempo por la cultura para ser ensayadas) a 30 ° C.
    4. Añadir 50 l de 20x Detener la mezcla a tubos de microcentrífuga de pre-marcado (un tubo por el tiempo del punto por cultivo a ensayar). Colocar los tubos en hielo.
      PRECAUCIÓN: La azida de sodio, un ingrediente de 20x Detener la mezcla, es tóxico por ingestión o por contacto dérmico. Siga las recomendaciones del fabricante en la preparación, el almacenamiento y el manejo de azida de sodio. En caso de exposición accidental, consultar hoja de datos proporcionada por el fabricante.
  7. Cuando las células han alcanzado el crecimiento semilogarítmica, recoger 2,5 OD 600 unidades de cada cultivo por punto de tiempo a ensayar (por ejemplo, 7,5 OD 600 unidades para analizar la abundancia de proteínas en tres puntos de tiempo). Centrifugadora recogieron las células en 15 ml tubos cónicos a 3,000 xg a temperatura ambiente durante 2 min.
    NOTA: Una OD 600 unidad es igual a la cantidad de levadura presente en 1 ml de cultivo a una DO 600 de 1,0. El volumen de cultivo (en ml) que se requieren para cosechar X OD 600 unidades (V) se puede determinar mediante el uso de la siguiente ecuación: V = X OD 600 unidades / OD 600 de medición. Por ejemplo, para la cosecha de 7,5 OD 600 unidades de cultivo de células de levadura a una DO 600 de 1,0, recoger 7,5 OD 600 unidades / 1,0 = 7,5 ml de cultivo de levadura.
  8. Resuspender cada sedimento celular en 1 ml de 30 ° C (pre-calentado) medio de crecimiento fresco por 2,5 OD 600 unidades de células (por ejemplo, 3 ml de 7,5 OD 600 unidades).

2. La cicloheximida Caza

  1. Equilibrar las suspensiones de células de levadura por incubación durante 5 min en el bloque de calor C 30 °.
  2. Preparar un temporizador para contar a partir de las 0:00.
  3. Para comenzar la persecución cicloheximida, pulse el botón "Inicio" en el temporizador. Rápidamente,pero con cuidado, lleve a cabo los siguientes pasos:
    1. Añadir cicloheximida a una concentración final de 250 mg / ml a la suspensión de células de levadura primero (por ejemplo, añadir 37,5 l de 20 mg / ml de la cicloheximida a 3 ml de suspensión de células), y vortex brevemente para mezclar.
      PRECAUCIÓN: La cicloheximida es un irritante cutáneo y es tóxico por ingestión oral. Siga las recomendaciones del fabricante en la preparación, el almacenamiento y el manejo de cicloheximida. En caso de exposición accidental, consultar hoja de datos proporcionada por el fabricante.
    2. Inmediatamente después de la adición de cicloheximida y agitación en vórtex, la transferencia de 950 l (~ 2,4 OD 600 unidades) de la suspensión de células de levadura con cicloheximida añadido a un tubo de microcentrífuga de pre-marcado que contiene 50 l enfriado en hielo mezcla 20x de parada. Vortex el tubo de microcentrífuga, y el lugar en hielo hasta que se han recogido todas las muestras.
    3. Devolver la suspensión de células de levadura a 30 ° C.
  4. Repita los pasos 2.3.1 a 2.30.3 para cada una de las suspensiones de células de levadura restantes a intervalos de tiempo regulares (por ejemplo, cada 30 segundos, de manera que se añade a la cicloheximida la muestra # 1 a las 0:00, muestra # 2 a las 0:30, muestra # 3 a las 1:00 , etc.).
  5. En cada punto de tiempo posterior, las suspensiones de células de levadura vórtice y de transferencia de 950 l a tubos de microcentrífuga de marcado que contiene 50 l pre-refrigerada 20x parada Mix. Vortex y lugar recogido células en hielo. Salida 15 ml tubos cónicos de 30 ° C bloque de calor.
    1. Por ejemplo, para la recogida de las células 30 min después de la adición de cicloheximida (suponiendo 30-sec intervalos entre adición de cicloheximida a suspensiones de células de levadura al principio de la evolución en el tiempo) y agitar y remover 950 l de suspensión de células de la muestra # 1 en 30:00 . Repita para la Muestra # 2 a 30:30, y así sucesivamente.
      NOTA: para evitar la sedimentación de la levadura, las suspensiones de células de vórtice en tubos de 15 ml cónicos aproximadamente cada 5 min durante todo el curso de la persecución. Alternativamente, la suspensión de células de levaduras puede ser mantenido en un baño de agua agitando de forma continua durante la duración del experimento cicloheximida persecución.
  6. Cuando todas las muestras se han recogido, pellet recogió células por centrifugación a 6500 xg a temperatura ambiente durante 30 seg. Eliminar el sobrenadante con la pipeta o aspiración. Las células están ahora listas para la lisis alcalina. Como alternativa, complemento de congelación células se sedimentaron en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.

3. extracción de proteínas post-alcalina (Modificado de 16,40)

  1. Añadir 100 ml de agua destilada a cada sedimento celular. Volver a suspender pipeteando arriba y abajo o vórtex.
  2. Añadir 100 ml de NaOH 0,2 M a cada muestra. Mezclar pipeteando arriba y abajo o vórtex.
  3. Se incuban las células en suspensión a temperatura ambiente durante 5 min. En esta etapa, las células de levadura no se han lisaron, y las proteínas no se han publicado 40.
  4. Precipitar las células por centrifugación a 18.000 xg en los estribos habitaciónambiente durante 30 seg. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración.
  5. Para lisar las células, añadir 100 l de tampón de muestra Laemmli a cada sedimento celular. Volver a suspender pipeteando arriba y abajo o vórtex.
    NOTA: la incubación secuencial de las células con proteínas libera tampón de muestra de Laemmli y NaOH en una forma compatible con sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando un sistema de tampón de Tris-glicina.
  6. Incubar a 95 ° C durante 5 minutos para desnaturalizar completamente proteínas.
    NOTA: La incubación a 95 ° C puede no ser adecuado para el análisis de las proteínas que son propensas a la agregación (por ejemplo, las proteínas con varios segmentos transmembrana). Estas proteínas pueden llegar a ser insoluble cuando se incuban a temperaturas elevadas 41. Por lo tanto, para el análisis de tales proteínas, los lisados ​​deben incubarse a temperaturas más bajas (por ejemplo, 37 ° C - 70 ° C) durante 10 - 30 min, como se determina empíricamente.
  7. lisados ​​centrifugar a 18.000 xga room temperatura durante 1 min para sedimentar el material insoluble. El sobrenadante (solubilizado proteína extraída) está listo para la separación por SDS-PAGE y análisis de transferencia western posterior. Como alternativa, las tiendas lisados ​​a -20 ° C.

4. Representante de SDS-PAGE y procedimiento de Western blot (Adaptado de 16)

  1. Carga de proteína estándares de peso molecular y el volumen determinado empíricamente de los lisados ​​en un gel de SDS-PAGE.
    NOTA: Elija el porcentaje de acrilamida y bis-acrilamida en el gel SDS-PAGE basada en el peso molecular de la proteína de interés. En general, inferiores geles porcentuales son más adecuados para la resolución de proteínas de mayor peso molecular.
  2. gel funcionar a 200 V hasta que el frente de colorante ha alcanzado el borde inferior del gel.
  3. Transferencia de las proteínas desde el gel a membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) por transferencia en húmedo a 20 V para 60 a 90 min a 4 ° C.
  4. Bloquear la membrana por incubación en Tris-solución salina tamponada (TBS) que contiene 5% de leche desnatada, oscilación, a temperatura ambiente durante 1 hr o a 4 ° C durante la noche.
    NOTA: Para evitar el crecimiento microbiano en la presencia de una membrana incubaron durante la noche, se recomienda incluir azida de sodio en la solución de bloqueo a una concentración final de 0,02%.
  5. Incubar la membrana con el anticuerpo primario específico para la proteína de interés en TBS con 0,1% de Tween-20 (TBS / T) y 1% de leche desnatada, oscilación, a temperatura ambiente durante 1 hr.
  6. Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose.
  7. Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en TBS / T con leche desnatada 1% a temperatura ambiente durante 1 hr, balanceo.
    NOTA: Los fluoróforos son sensibles a la luz. Por lo tanto, diluciones de anticuerpos conjugados con fluoróforos deben estar preparados en la oscuridad, y la incubación de las membranas en presencia de anticuerpos conjugados con fluoróforos y posteriores pasos de lavado debe ocurrir en prueba de luz (por ejemplo, envueltas en papel aluminio) containers.
  8. Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose.
  9. membrana de imagen utilizando LI-COR Odyssey CLx y el software Image Studio (o equipos de imagen comparable y software), siguiendo las recomendaciones del fabricante.
  10. Después de la adquisición de la imagen de la membrana, se incuba la membrana con un anticuerpo primario específico para una proteína de control de carga en TBS / T con leche desnatada 1% a temperatura ambiente durante 1 hr, balanceo.
  11. Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose.
  12. Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en TBS / T con leche desnatada 1% a temperatura ambiente durante 1 hr, balanceo.
  13. Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose.
  14. membrana de imagen como en el paso 4.9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Para ilustrar la metodología de persecución cicloheximida, la estabilidad de Deg1 -Sec62 (Figura 1), un sustrato modelo de levadura retículo endoplásmico (ER) -asociado degradación (ERAD), se analizó 42-44. En ERAD, de control de calidad enzimas ubiquitina ligasa se unen covalentemente las cadenas de la pequeña proteína ubiquitina a las proteínas aberrantes localizado en la membrana ER. Tales proteínas polyubiquitylated se retiran posteriormente de la sala de emergencia y degradadas por el proteasoma, un grande, proteasas citosólicas 45. La proteína Deg1 -Sec62 está destinada a la degradación después de que de manera persistente y aberrante se acopla a la translocon, un canal que facilita la translocación de proteínas en el lumen del RE o membrana 43. Del mismo modo, la apolipoproteína B de mamífero, un componente de proteína de lipoproteínas de baja densidad, se acopla persistentemente la translocon ER y, posteriormente, se somete a la degradación por un mecanismo relacionado cuando su labioparejas de unión de identificación están ausentes 46-48. Por lo tanto, los análisis de la degradación Deg1 -Sec62 en células de levadura puede dar una idea de la degradación de las proteínas que persistentemente o aberrante se acoplan con la translocon, denominado provisionalmente ERAD-T (por translocon-asociado) sustratos 43.

Estudios previos han indicado que las ER-ubiquitina ligasa residente funciones HRD1 con la enzima ubiquitina-conjugación Ubc7 para catalizar la degradación de Deg1 -Sec62 16,42-44. La proteína transmembrana CUE1 ancla Ubc7 a la membrana del RE y activa la enzima 49-51. Sin embargo, un requisito para CUE1 en la degradación de Deg1 -Sec62 no se ha investigado directamente. Para probar la hipótesis de que CUE1, como Hrd1 y Ubc7, es necesario para la degradación eficiente de Deg1 -Sec62, de tipo salvaje y las células mutantes de levadura que expresa Deg1 -Sec62 fueron sometidos a persecución cicloheximida y WesEl análisis de transferencia golondrina de mar (Figura 2A). La proteína Deg1 -Sec62 migra en SDS-PAGE como múltiples especies. Esto es consistente con estudios anteriores que indican una amplia modificación postraduccional de la proteína 43,44,52. En células de levadura de tipo salvaje, Deg1 -Sec62 era fácilmente degradado. Como ya se observó, la pérdida de cualquiera Hrd1 o Ubc7 estabilizado sustancialmente la proteína Deg1 -Sec62 42-44. Como se predijo, Deg1 -Sec62 se estabilizó en ausencia de CUE1 (en un grado similar como en la ausencia de Ubc7), lo que confirma el papel de la proteína Ubc7-que interactúan en ERAD-T.

La proporción de proteína Deg1 -Sec62 restante en cada punto de tiempo se cuantificó y se representa gráficamente en la Figura 2B. Observamos que la tasa aparente de desaparición de Deg1 -Sec62 en las células de tipo salvaje puede ser una subestimación de la velocidad de degradación de la naciente Deg1 -Sec62(Es decir, la vida media de la proteína, que se puede determinar más directamente por análisis de persecución de impulsos 43). Debido levadura de tipo salvaje degradan activamente la proteína Deg1 -Sec62 antes de la adición de cicloheximida, la abundancia de estado estacionario de Deg1 -Sec62 se reduce sustancialmente en estas células (en comparación con células en las que se altera la degradación). Esto puede apreciarse mediante la comparación de la abundancia de Deg1 -Sec62 en los puntos de tiempo iniciales para cada cepa en la Figura 2A. Además, cualquier subpoblación resistente a la degradación de la proteína sustrato (por ejemplo, si la proteína se acumula en piscinas intracelulares de la que se evita la degradación) podría parecer relativamente estable en células de tipo salvaje en el transcurso de tiempo del experimento.

Figura 1
Figura 1. Modelo para la degradación de Deg1 -Sec62 Siguiente aberrante de compromiso de translocon (A) Representación esquemática de Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 consta de los siguientes elementos, en secuencia:.. Deg1 (los 67 aminoácidos amino-terminal de la levadura represor transcripcional MATα2), una bandera (F) epítopo, la proteína 2-transmembrana Sec62, y dos copias de la proteína A de Staphylococcus aureus (PRA). (B) después de la inserción co-traduccional normal de sus dos segmentos transmembrana en la membrana del retículo endoplásmico (ER), de asociación persistente de Deg1 -Sec62 con el translocon desencadena, Deg1 dependiente, compromiso translocon postraduccional anormal. Una porción del extremo amino terminal citosólica aberrante entra-y es probable que se mantiene dentro de-la translocon. (C) Después de compromiso translocon, la ubiquitina ligasa Hrd1 ubiquitylates Deg1 -Sec62. Hrd1 es asistido por la enzima ubiquitina-conjugación de UFC7, que está anclado en la membrana del ER por CUE1. Ub, monómeros de proteína ubiquitina. (D) ubiquitylated Deg1 -Sec62 se extrae de la membrana del ER y degradada por el proteasoma, aliviar la obstrucción translocon. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. La cicloheximida Chase, seguido de transferencia Western Indica que CUE1 se requiere para la degradación eficiente Deg1 -Sec62. Células (A) de la levadura de los genotipos indicados se transformaron con un plásmido que codifica la levadura centromérica Deg1 -Sec62 (pRS416-P MET25 - Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) y se sometieron a análisis de cicloheximida persecución. Proteínas de cada punto de tiempo (equivalente a 0,125 OD 600 unidades) se separaron en un gel de SDS-PAGE 8% y detectado por Western Blot con anticuerpos secundarios de conejo anti-ratón, que se unen directamente a los epítopos de proteína A C-terminales de la Deg1 - proteína de fusión Sec62. Como control de carga, la membrana se incubó posteriormente con anticuerpos específicos para PGK1. Este experimento se ha repetido tres veces; Los resultados representativos se representan. (B) Cuantificación de los datos en (A) se realizó utilizando el software de imagen (véase la Tabla de Materiales). Se determinó la intensidad de fluorescencia total de un área que abarca la proteína Deg1 -Sec62 para cada muestra. La intensidad de fluorescencia de fondo para cada muestra fue extrapolada de la intensidad media de fluorescencia de los píxeles cercanos a la proteína Deg1 -Sec62. Esta intensidad de fluorescencia de fondo extrapolada se restó de la intensidad total de fluorescencia para producir FLUORESC ajustadocia de intensidad para cada muestra. cuantificaciones similares para total, el fondo y la intensidad de fluorescencia se realizaron ajustadas para PGK1, una proteína de control de carga cuya abundancia no varía en las condiciones ensayadas. Para comparar la abundancia de proteína Deg1 -Sec62 entre las muestras, se determinó una relación de las intensidades de señal ajustada de Deg1 -Sec62 a PGK1 para cada muestra. La relación Deg1 -Sec62 / PGK1 se definió como 100% en el primer punto de tiempo (es decir, inmediatamente después de la adición de cicloheximida) para cada cepa en análisis. La cantidad de Deg1 -Sec62 restante en puntos de tiempo posteriores (es decir, las relaciones Deg1 -Sec62 / PGK1) se calculan como un porcentaje de la relación Deg1 -Sec62 / PGK1 en el primer punto del tiempo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Definido sintética (SD) Medio Mínimo levadura Dextrosa al 2%, 0,67% de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 0,002% de adenina, 0,004% uracilo, 0,002% de arginina, 0,001% histidina, 0,006% isoleucina, 0,006% de leucina, 0.004% de lisina, 0,001% de metionina, 0,006% de fenilalanina, 0,005 % treonina, 0,004% de triptófano. Para (placa) medio sólido, incluyen 2% de agar. 1. Medio selectivo se prepara por la omisión de ácido apropiado amino (s) o bases nitrogenadas.
2. Para mayor comodidad, estos ingredientes se pueden mantener como soluciones madre concentradas de la siguiente manera. Los aminoácidos se pueden mantener como solución de reserva que contenía 100x todos los aminoácidos deseados. base de nitrógeno de levadura puede ser mantenida en una solución 20x de stock (13,4%). La dextrosa se puede mantener en una solución de 40%. Adenina y uracilo pueden ser mantenidos como 1% de soluciones madre en NaOH 0,1 M.
3.Esterilizar en autoclave medio.
Extract-peptona de levadura dextrosa (YPD) Medio de levadura Rich 1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de dextrosa (Opcional: 0,002% de adenina). Para (placa) medio sólido, incluyen 2% de agar. 1. Para evitar el lento crecimiento y característica coloración roja de cepas particulares de levadura de laboratorio en ausencia (o baja abundancia) de adenina, adenina se puede añadir al medio de cultivo YPD.
2. Para mayor comodidad, algunos ingredientes se pueden mantener como soluciones madre concentradas de la siguiente manera. La dextrosa se puede mantener en una solución de 40%. Adenina puede mantenerse como una solución de 1% en NaOH 0,1 M.
3. Esterilizar medio en autoclave.
20x Detener Mix 200 mM de azida de sodio, 5 mg / ml de albúmina de suero bovino La azida sódica es tóxico por ingestión oral o el contacto dérmico. siga fabricanterecomendaciones en la preparación, el almacenamiento y el manejo de azida de sodio. En caso de exposición accidental, consultar hoja de datos proporcionada por el fabricante.
20 mg / ml cicloheximida 1. Preparar en etanol. Almacenar a -20 ° C.
2. La cicloheximida es un irritante cutáneo y es tóxico por ingestión oral. Siga las recomendaciones del fabricante en la preparación, el almacenamiento y el manejo de cicloheximida. En caso de exposición accidental, consultar hoja de datos proporcionada por el fabricante.
0,2 M de hidróxido de sodio Preparar en el agua. El hidróxido de sodio reacciona con el vidrio. Por lo tanto, para el almacenamiento a largo plazo, hidróxido de sodio 0,2 M se debe mantener en envases de plástico.
Tampón de muestras de Laemmli 2% de SDS, 10% de glicerol, 5% y# 946; mercaptoetanol, 60 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,008% de azul de bromofenol 1. Laemmli de tampón de muestras es a menudo prepara diluyendo una acción más concentrada (por ejemplo, 5x).
2. El colorante azul de bromofenol se puede añadir a la intensidad deseada. A "pellizco" (muy pequeña cantidad girada desde el borde de una espátula) es típicamente suficiente.
Laemmli Running Buffer (5x) Tris 125 mM, glicina 960 mM, 0,5% de SDS Para preparar 1 l de 1x Laemmli Running Buffer, diluir 1: 5 en dH2O
Tris acetato-SDS Transfer Buffer (5x) 125 acetato de Tris mM (pH 8,8), glicina 960 mM, 0,05% de SDS Para preparar 20 l de 1x Tris acetato-SDS Transferencia Buffer, combine 4 L de 5x de valores, 4 L de metanol, y 12 L de dH 2 O.
10x Tris-solución salina tamponada (TBS) Tris 500 mM, 1,5 M NaCl; pH ajustado a 7,5 Para preparar 1 litro de TBS 1x, se diluye 1:10 en dH2O 1x TBS puede complementarse con el detergente Tween-20 y la leche desnatada en polvo, según el caso.

Tabla 1. Las soluciones utilizadas en este estudio.

Nombre cepa Alias Genotipo relevante referencias
VJY42 MHY501 MATα Chen et al., 1993
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY47 YWO55; MHY507 MATα Jungmann et al., 1993; Rubenstein et al., 2012
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105; MHY1364 MATα Biederer et al., 1997; Ravid et al., 2006
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MATα Este estudio
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1Δ :: kanMX4

Tabla 2. Las cepas de levadura utilizadas en este estudio. Todas las cepas son congenic con MHY500 53. VJY42, VJY47, y VJY56 fueron descritas anteriormente 49,53,54. Una generación detallada cepa y la estrategia de confirmación para VJY172 (preparado para este estudio) está disponible bajo petición.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En este trabajo, se presenta un método para el análisis de la cinética de degradación de proteínas. Esta técnica se puede aplicar fácilmente a una gama de proteínas degradadas por una variedad de mecanismos. Es importante tener en cuenta que los experimentos de persecución cicloheximida informan sobre la cinética de degradación de la piscina en estado estable de una proteína dada. Otras técnicas pueden ser usadas para analizar la cinética de degradación de poblaciones específicas de las proteínas. Por ejemplo, el destino de degradación de polipéptidos nacientes puede ser seguido por análisis de persecución de impulsos 55. En estos experimentos, las proteínas nacientes son pulso marcado brevemente (por ejemplo, con aminoácidos radiactivos). Los cambios en la abundancia de las proteínas nacientes marcados (que puede o no puede duplicar cambios en la abundancia de proteínas en estado estable) pueden ser rastreados con el tiempo.

Persecución cicloheximida es adecuado para el análisis de estabilidad de la proteína durante un transcurso de tiempo relativamente corto (es decir, un máximo de dos horas). Durante largo tiempo cURSOS (es decir, dos horas o días), cicloheximida, un inhibidor mundial de la traducción, es tóxico para las células, probablemente debido al agotamiento de la ubiquitina 56. Además, los análisis de estabilidad de la proteína sobre los cursos de tiempo más largos son más propensos a verse comprometida por los efectos indirectos de la síntesis de proteínas alterada a nivel mundial sobre la degradación de la proteína de interés (por ejemplo, la degradación de una proteína de corta duración implicada en la degradación de la proteína de interesar). Otras técnicas, como la persecución de impulsos experimentos de marcaje metabólico, por lo tanto, son más adecuados para el estudio de la degradación de las proteínas de larga vida y pueden llevar a cabo para corroborar los resultados obtenidos en los experimentos de persecución cicloheximida.

El momento de la adición de cicloheximida y la recogida de las células es una consideración importante en este procedimiento. La precisión es especialmente importante en el análisis de proteínas de muy corta duración, ya que las pequeñas desviaciones en el tiempo transcurrido desde adi cicloheximidación a la cosecha de células puede tener un impacto sustancial sobre la cinética de degradación aparente. Además, sin un plan claro para la ejecución de estas medidas sensibles al tiempo, un experimento puede transferir rápidamente en el caos y la frustración. Por esta razón, se recomienda añadir cicloheximida a los cultivos a intervalos planificados, regulares. intervalos de 30 seg se sugieren en este protocolo, pero el tiempo se pueden ajustar para que coincida con el nivel de confort y destreza del investigador. investigadores noveles pueden encontrar útil para escribir un cronograma de horarios de recogida de la muestra antes de iniciar el experimento y para tachar cada colección programado ya que se produce.

En los pasos 1.7 y 1.8 del protocolo descrito aquí, los cultivos de células de levadura se concentran en volúmenes reducidos de medio de crecimiento para la facilidad de manipulación durante el procedimiento de cicloheximida persecución subsiguiente. Sin embargo, la centrifugación de las células de levadura induce rápidamente ciertas respuestas de estrés celular (por ejemplo, vías de señalización queson activados por la privación de glucosa) 57,58. Por lo tanto, los investigadores Se advierte a los largos períodos de centrifugación. Al analizar la estabilidad de las proteínas que pueden ser sensibles a la centrifugación, los investigadores pueden desear añadir cicloheximida directamente a cultivos en fase logarítmica media sin centrifugación previa. En tales casos, la cicloheximida, debe añadirse a la misma concentración final (250 mg / ml), y muestras de células de levadura puede ser cosechado por metodologías que no requieren una etapa de centrifugación inicial (por ejemplo, filtración rápida) 57. Además, en los pasos 2.3 a 2.5, las muestras recogidas en cada punto de tiempo se transfieren a una solución que contiene azida de sodio y se colocaron en hielo. Estas condiciones inhiben la degradación de proteínas continuaron durante la duración de la persecución. Cabe señalar que la azida se reduce la concentración celular de ATP 59, de ese modo inhibir específicamente la actividad de proteasas dependientes de ATP. Mientras que la temperatura reducido, unalso reducir la velocidad a la que no dependiente de ATP proteolítica función procesos, los investigadores que estudian las proteínas degradadas por tales mecanismos pueden alternativamente escoger complemento congelación sedimentos de células en nitrógeno líquido como se cosecha cada muestra.

Un protocolo de ejemplo para la lisis celular y un protocolo representativo para el Western Blot incluidos en este manuscrito se han adaptado a partir de los informes anteriores 16,40. En el método de lisis alcalina descrito post-aquí, NaOH pretratamiento mejora la extracción de proteínas de levadura después de la adición posterior de tampón de muestra Laemmli. El mecanismo por el cual se produce esta mejora está mal caracterizado 40. Sin embargo, los polisacáridos tales como las que se encuentran en las paredes celulares de levadura se solubilizan en condiciones alcalinas 60. Por lo tanto, es tentador especular que la incubación en presencia de NaOH parcial o completamente esferoplastos células de levadura (es decir, elimina los componentes de la pared celular), ellos haciendo más sensitive para el detergente presente SDS en el tampón de muestra Laemmli. Como las proteínas se liberan bajo condiciones altamente desnaturalizantes, inhibidores de la proteasa no necesitan ser incluidas en el tampón de muestra Laemmli. El método específico de la lisis celular puede ser modificado según sea apropiado para un experimento dado. Por ejemplo, el método de lisis alcalina post-puede no ser adecuado para las proteínas de baja abundancia o proteínas que están mal detectados por Western blot. En tales casos, los métodos que incluyen una etapa de precipitación de ácido tricloroacético para concentrar muestras de proteína puede ser más apropiado 61. Por otra parte, varias consideraciones importantes con respecto a la selección de anticuerpos, la carga de la elección de control, y medios alternativos de detección (por ejemplo, el Western Blot de quimioluminiscencia utilizando sistemas de película o de imagen digital) han sido recientemente discutido 16. La cuantificación de la abundancia de proteínas después del tratamiento con cicloheximida puede llevar a cabo. Muchos sistemas de imágenes se venden con los paquetes de software que facilitaneste análisis.

persecución cicloheximida se puede implementar para analizar la degradación de una variedad de proteínas de levadura y puede ser adaptado para estudiar la estabilidad de proteínas en otras células eucariotas. Como se describe en este protocolo, el tratamiento con cicloheximida es seguido por la lisis celular y la detección de la abundancia de proteínas por Western blot. Dependiendo de la aplicación, sin embargo, la abundancia de proteínas después del tratamiento con cicloheximida se puede evaluar mediante una variedad de técnicas, según sea apropiado para los objetivos de investigación. Por ejemplo, si el tamaño de la proteína no es un factor relevante para el análisis, los lisados ​​celulares pueden ser sometidos a transferencia de puntos o análisis de enzima de ensayo de inmunoabsorción ligado (ELISA), que informe sobre la abundancia de proteínas, pero no de peso molecular aparente 62. Para las proteínas de la superficie celular (o con fluorescencia interna etiquetada proteínas internas), citometría de flujo puede utilizarse para cuantificar la abundancia de proteínas de las muestras en diferentes momentos después de la adición de cicloheximida 51. fluoLa microscopía cencia tratamiento después de cicloheximida proporcionaría información tanto sobre la abundancia de proteínas y localización 18. La gama de sustratos, organismos y aplicaciones posteriores susceptibles de persecución cicloheximida hace que la técnica un medio muy versátiles e informativas de estudiar la degradación de proteínas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Tags

Bioquímica No. 110, La levadura en ciernes mutantes la degradación del retículo endoplasmático asociada la degradación de proteínas persecución cicloheximida translocon el sistema ubiquitina-proteasoma
Análisis cicloheximida persecución de degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E.,… More

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter