Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

में प्रोटीन गिरावट के cycloheximide चेस विश्लेषण Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

प्रोटीन बहुतायत के नियमन लगभग हर सेलुलर प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटीन बहुतायत प्रोटीन संश्लेषण और प्रोटीन गिरावट की दर के एकीकरण को दर्शाता है। कई प्रोटीन बहुतायत पर रिपोर्टिंग assays (जैसे, एकल समय बिंदु पश्चिमी सोख्ता, cytometry, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, या विकास आधारित संवाददाता assays के प्रवाह) प्रोटीन के स्तर पर अनुवाद और प्रोटियोलिसिस के सापेक्ष प्रभाव के भेदभाव की अनुमति नहीं है। यह लेख cycloheximide चेस के उपयोग के पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा विशेष मॉडल कोशिकीय यूकेरियोट में प्रोटीन गिरावट का विश्लेषण करने के लिए, Saccharomyces cerevisiae (नवोदित खमीर) का वर्णन है। इस प्रक्रिया में, खमीर कोशिकाओं translational अवरोध cycloheximide की उपस्थिति में incubated हैं। कोशिकाओं की aliquots के बाद और निम्न cycloheximide के अलावा विशिष्ट समय बिंदुओं पर तुरंत एकत्र कर रहे हैं। कोशिकाओं lysed रहे हैं, और lysates के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन से अलग हो रहे हैंr हर समय बिंदु पर प्रोटीन बहुतायत के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। cycloheximide चेस प्रक्रिया सेलुलर प्रोटीन की एक किस्म के स्थिर राज्य की आबादी की गिरावट कैनेटीक्स के दृश्य परमिट। प्रक्रिया प्रोटीन गिरावट पर के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं और पर्यावरणीय प्रभावों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

प्रोटीन लगभग हर सेलुलर प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कार्य करते हैं। कई शारीरिक प्रक्रियाओं के समय या विशेष परिस्थितियों के तहत एक निर्धारित अवधि के लिए एक विशेष प्रोटीन (या प्रोटीन) की उपस्थिति की आवश्यकता होती है। जीवों इसलिए नजर रखने और प्रोटीन बहुतायत विनियमित सेलुलर जरूरतों को पूरा करने के लिए 1। उदाहरण के लिए, cyclins (प्रोटीन है कि कोशिकाओं के विभाजन पर नियंत्रण) सेल चक्र के विशिष्ट चरणों में मौजूद हैं, और विनियमित cyclin स्तरों के नुकसान घातक ट्यूमर गठन 2 के साथ संबद्ध किया गया है। प्रोटीन के स्तर को विनियमित सेलुलर जरूरतों को पूरा करने के अलावा, कोशिकाओं misfolded, unassembled, या अन्यथा न्यायपालिका प्रोटीन अणुओं 3 को खत्म करने degradative गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र को रोजगार। प्रोटीन बहुतायत के नियंत्रण दोनों macromolecular संश्लेषण (प्रतिलेखन और अनुवाद) और गिरावट (आरएनए क्षय और प्रोटियोलिसिस) के विनियमन शामिल है। बिगड़ा या अत्यधिक प्रोटीन गिरावट कई विकृतियों के लिए योगदान, कैंसर, सिस्टिक फाइब्रोसिस, neurodegenerative की स्थिति, और हृदय संबंधी विकार 4-8 शामिल है। प्रोटिओलिटिक तंत्र इसलिए बीमारियों 9-12 की एक श्रृंखला के लिए आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्यों प्रतिनिधित्व करते हैं।

एक ही समय बिंदु पर प्रोटीन का विश्लेषण स्थिर राज्य प्रोटीन बहुतायत के एक स्नैपशॉट प्रदान करता है संश्लेषण या गिरावट के रिश्तेदार योगदान का खुलासा किए बिना (जैसे, पश्चिमी धब्बा 13 से, cytometry 14, या 15 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रवाह)। इसी तरह, विकास आधारित संवाददाता assays के संश्लेषण और गिरावट 15-20 के प्रभावों के बीच भेदभाव के बिना स्थिर एक विस्तारित समय अवधि में राज्य प्रोटीन का स्तर दर्शाते हैं। यह पहले की तुलना द्वारा बहुतायत और, degradative तंत्र (जैसे की विशिष्ट घटकों बाधा औषधीय prote निष्क्रिय के बाद स्थिर राज्य प्रोटीन के स्तर को degradative प्रक्रियाओं का योगदान अनुमान करने के लिए संभव हैasome 21 या एक जीन धारणा बाहर दस्तक गिरावट 13) के लिए आवश्यक हो। Degradative रास्ते में बाधा के बाद स्थिर राज्य प्रोटीन के स्तर में बदलाव प्रोटीन बहुतायत 13 के नियंत्रण के लिए प्रोटियोलिसिस के योगदान के लिए मजबूत सबूत उपलब्ध कराता है। हालांकि, इस तरह के एक विश्लेषण अभी भी प्रोटीन कारोबार के कैनेटीक्स के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है। Cycloheximide चेस पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा किया शोधकर्ताओं समय 22-24 ओवर प्रोटीन गिरावट कल्पना करने की अनुमति देकर इन कमजोरियों पर काबू। इसके अलावा, क्योंकि cycloheximide पीछा निम्नलिखित प्रोटीन का पता लगाने के लिए आम तौर पर पश्चिमी सोख्ता, रेडियोधर्मी आइसोटोप और लंबी immunoprecipitation कदम द्वारा किया जाता है cycloheximide पीछा करने के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं, कई आमतौर पर इस्तेमाल किया पल्स चेस तकनीक है, जो भी प्रोटीन गिरावट 25 कल्पना करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं के विपरीत है।

Cycloheximide के साथ पहली बार एंटी-फंगल उचित एक यौगिक के रूप में पहचान की गई थी26,27 griseus ग्राम पॉजिटिव जीवाणु Streptomyces द्वारा उत्पादित संबंधों। यह एक सेल पारगम्य अणु है कि विशेष रूप ribosomal translocation 28-31 आई द्वारा यूकेरियोटिक साइटोसोलिक (लेकिन organellar नहीं) अनुवाद रोकता है। एक cycloheximide चेस प्रयोग में, cycloheximide कोशिकाओं को जोड़ा जाता है, और कोशिकाओं की aliquots तुरंत और निम्न यौगिक 22 के अलावा विशिष्ट समय बिंदुओं पर एकत्र कर रहे हैं। कोशिकाओं lysed रहे हैं, और हर समय बिंदु पर प्रोटीन बहुतायत विश्लेषण किया जाता है, आम तौर पर पश्चिमी धब्बा। cycloheximide के अलावा आत्मविश्वास से प्रोटीन गिरावट के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है निम्नलिखित प्रोटीन बहुतायत में कम हो जाती है। एक अस्थिर प्रोटीन समय के साथ बहुतायत में कमी होगी, जबकि एक अपेक्षाकृत स्थिर प्रोटीन बहुतायत में थोड़ा परिवर्तन प्रदर्शन करेंगे।

चयनात्मक प्रोटीन गिरावट के तंत्र अत्यधिक यूकेरिया भर में संरक्षित किया गया है। क्या प्रोटीन गिरावट के बारे में जाना जाता है की ज्यादातर पहली बार में सीखा थामॉडल कोशिकीय यूकेरियोट, Saccharomyces cerevisiae (नवोदित खमीर) 25,32-36। खमीर के साथ अध्ययन प्रोटीन गिरावट में उपन्यास और महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान जारी रखने की संभावना है। प्रोटीन बहुतायत के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के बाद खमीर कोशिकाओं में cycloheximide पीछा करने के लिए एक विधि यहां प्रस्तुत किया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. विकास और खमीर कोशिकाओं की फसल

  1. अगर एक अंतर्जात खमीर प्रोटीन की गिरावट कैनेटीक्स का विश्लेषण नहीं, एक प्लाज्मिड ब्याज की प्रोटीन एन्कोडिंग के साथ वांछित खमीर तनाव (ओं) बदलना। खमीर परिवर्तन के लिए विश्वसनीय तरीकों पहले 37 में वर्णित किया गया है।
  2. उचित माध्यम के 5 मिलीलीटर में खमीर टीका लगाना (जैसे, चयनात्मक सिंथेटिक परिभाषित (एसडी) बदल कोशिकाओं या गैर चयनात्मक खमीर निकालने-peptone-डेक्सट्रोज (YPD) गैर-बदल कोशिकाओं के लिए माध्यम की प्लाज्मिड रखरखाव के लिए मध्यम)। 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं, घूर्णन।
    नोट: 30 डिग्री सेल्सियस ठेठ जंगली प्रकार प्रयोगशाला खमीर उपभेदों 38 के लिए इष्टतम विकास तापमान है। हालांकि, क्योंकि कुछ उत्परिवर्ती खमीर उपभेदों 30 डिग्री सेल्सियस पर बेहतर हो जाना नहीं है और कुछ प्रोटीन तापमान पर निर्भर गिरावट से गुजरना, खमीर सेल के विकास और cycloheximide पीछा करने के लिए इस्तेमाल किया तापमान अनुभव से 39 निर्धारित किया जाना चाहिए।
  3. उपाय वेंई प्रत्येक रातोंरात संस्कृति के 600 एनएम (600 आयुध डिपो) पर ऑप्टिकल घनत्व।
    नोट: प्रकोष्ठों लघुगणक या स्थिर विकास के चरण में हो सकता है, लेकिन न्यूनतम एक घनत्व है कि ताजा माध्यम के 15 में 0.2 मिलीलीटर एक आयुध डिपो से 600 कमजोर पड़ने की अनुमति देगा = पहुँच जाना चाहिए था।
  4. ताजा माध्यम से 0.2 मिलीलीटर 15 में से एक आयुध डिपो के 600 मूल्य के लिए रात भर संस्कृतियों पतला।
  5. 30 डिग्री सेल्सियस पर खमीर सेते हैं, मिलाते हुए जब तक कोशिकाओं के मध्य लघुगणक विकास के चरण तक पहुंचने के (यानी, एक आयुध डिपो 0.8 और 1.2 के बीच 600)।
  6. खमीर सेल के विकास के दौरान प्रदर्शन cycloheximide पीछा करने की प्रक्रिया के लिए तैयारी में निम्नलिखित हैं:
    1. एक गर्मी ब्लॉक कि cycloheximide की उपस्थिति में कोशिकाओं के ऊष्मायन के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के लिए शंक्वाकार ट्यूबों 15 मिलीलीटर समायोजित कर सकते हैं निर्धारित करें। गर्मी ब्लॉक के कुओं के लिए पानी जोड़ें संस्कृतियों के लिए कुशल गर्मी वितरण की अनुमति है। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पानी जोड़ें है कि एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब जल स्तर वृद्धि करने के लिए, लेकिन नहीं अतिप्रवाह के लिए, अच्छी तरह से होंठ कारण होगा।
    2. एक दूसरी गर्मी ब्लॉक कि 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge सेल निम्नलिखित प्रोटीन विकृतीकरण के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक की नलियों को समायोजित कर सकते हैं निर्धारित करें।
    3. पूर्व गर्म ताजा मध्यम विकास 30 डिग्री सेल्सियस के लिए (संस्कृति के अनुसार समय बिंदु प्रति 1.1 मिलीलीटर यत्न किया जा सकता है)।
    4. 50 μl 20x रोक मिश्रण में जोड़ने के पूर्व लेबल microcentrifuge ट्यूब (एक बार प्रति ट्यूब संस्कृति के अनुसार बिंदु यत्न किया जा सकता है)। बर्फ पर ट्यूबों रखें।
      चेतावनी: सोडियम azide, 20x रोक मिक्स में एक घटक, मौखिक घूस या त्वचीय संपर्क के माध्यम से विषैला होता है। , जब तैयारी भंडारण, और सोडियम azide से निपटने के निर्माता की सिफारिशों का पालन करें। आकस्मिक जोखिम की स्थिति में परामर्श निर्माता द्वारा प्रदान की सामग्री सुरक्षा डाटा शीट।
  7. जब कोशिकाओं के मध्य लघुगणक विकास पर पहुंच गया है, समय बिंदु प्रति प्रत्येक संस्कृति के 2.5 आयुध डिपो 600 इकाइयों इकट्ठा यत्न किया जा करने के लिए (जैसे, 7.5 आयुध डिपो 600 इकाइयों तीन बिंदुओं पर समय प्रोटीन बहुतायत का विश्लेषण करने के लिए)। अपकेंद्रित्र 3,0 पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को एकत्र2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 00 XG।
    नोट: एक आयुध डिपो 600 यूनिट एक आयुध डिपो के 600 1.0 पर 1 मिलीलीटर संस्कृति में मौजूद खमीर की राशि के बराबर है। वी = एक्स आयुध डिपो 600 इकाइयों / मापा 600 आयुध डिपो: संस्कृति (एमएल) में फसल के लिए एक्स आयुध डिपो 600 इकाइयों (वी) की आवश्यकता की मात्रा निम्न समीकरण का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक आयुध डिपो के 600 1.0 पर खमीर सेल संस्कृति के 7.5 आयुध डिपो 600 इकाइयों फसल के लिए, 7.5 आयुध डिपो 600 इकाइयों / 1.0 = 7.5 मिलीलीटर खमीर संस्कृति इकट्ठा।
  8. 30 डिग्री सेल्सियस (पूर्व गर्म) ताजा विकास दर (7.5 आयुध डिपो 600 इकाइयों के लिए जैसे, 3 एमएल) के प्रति कोशिकाओं के 2.5 आयुध डिपो 600 इकाइयों के माध्यम से 1 मिलीलीटर में प्रत्येक कोशिका गोली Resuspend।

2. cycloheximide चेस

  1. 30 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में 5 मिनट के लिए ऊष्मायन द्वारा खमीर सेल निलंबन संतुलित करना।
  2. 00:00 से गिनती करने के लिए एक टाइमर तैयार करें।
  3. cycloheximide चेस, प्रेस "प्रारंभ" टाइमर पर शुरू करने के लिए। तेजी से,लेकिन ध्यान से, निम्न चरणों का पालन:
    1. पहले खमीर सेल निलंबन के लिए 250 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए cycloheximide जोड़ें (जैसे, सेल निलंबन के 3 मिलीग्राम से 20 मिलीग्राम / मिलीलीटर cycloheximide शेयर की 37.5 μl जोड़ने के लिए), और भंवर संक्षेप में मिश्रण करने के लिए।
      चेतावनी: cycloheximide एक त्वचीय अड़चन है और मौखिक घूस के माध्यम से विषैला होता है। , जब तैयारी भंडारण, और cycloheximide से निपटने के निर्माता की सिफारिशों का पालन करें। आकस्मिक जोखिम की स्थिति में परामर्श निर्माता द्वारा प्रदान की सामग्री सुरक्षा डाटा शीट।
    2. इसके तत्काल बाद cycloheximide और vortexing जोड़ने के बाद, एक पूर्व लेबल microcentrifuge 50 μl ठंडा 20x रोक मिश्रण युक्त ट्यूब को जोड़ा गया cycloheximide के साथ खमीर सेल निलंबन के 950 μl (~ 2.4 आयुध डिपो 600 इकाइयों) हस्तांतरण। बर्फ पर microcentrifuge ट्यूब, और जगह भंवर जब तक सभी नमूने एकत्र किया गया है।
    3. 30 डिग्री सेल्सियस के लिए खमीर सेल निलंबन लौटें।
  4. दोहराएँ कदम 2.3.1 2.3 के माध्यम से.3 नियमित समय अंतराल पर (शेष खमीर सेल निलंबन से प्रत्येक के लिए जैसे, हर 30 सेकंड है, जैसे कि cycloheximide जोड़ा जाता है # 1 0:00 पर 0:30 पर 1:00 पर नमूने के लिए, # 2 नमूना, # 3 नमूना , आदि।)।
  5. प्रत्येक बाद समय बिंदु पर, भंवर खमीर सेल निलंबन और लेबल microcentrifuge 50 μl पूर्व ठंडा 20x रोक मिश्रण युक्त ट्यूबों को हस्तांतरण 950 μl। भंवर और बर्फ पर जगह एकत्र कोशिकाओं। 30 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक करने के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों लौटें।
    1. उदाहरण के लिए, cycloheximide इसके बाद 30 मिनट कोशिकाओं के संग्रह के लिए, भंवर (समय पाठ्यक्रम की शुरुआत में खमीर सेल निलंबन के लिए cycloheximide अलावा बीच 30 सेकंड के अंतराल संभालने) और 30:00 पर # 1 नमूना से सेल निलंबन के 950 μl को दूर । 30:30 पर # 2 नमूना के लिए दोहराएँ, और इतने पर।
      नोट: चेस के पाठ्यक्रम में 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लगभग हर 5 मिनट में खमीर, भंवर सेल निलंबन के निपटाने को रोकने के लिए। वैकल्पिक रूप से, खमीर सेल निलंबनएस cycloheximide चेस प्रयोग की अवधि के लिए एक लगातार आंदोलन कर नहाने के पानी में बनाए रखा जा सकता है।
  6. जब सभी के नमूने एकत्र किया गया है, गोली कोशिकाओं centrifugation द्वारा 6500 XG पर कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए एकत्र। pipetting या आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें। कोशिकाओं को अब क्षारीय सेल के लिए तैयार हैं। वैकल्पिक रूप से, स्नैप-फ्रीज तरल नाइट्रोजन और दुकान में pelleted कोशिकाओं -80 डिग्री सेल्सियस पर।

3. पोस्ट-क्षारीय प्रोटीन निष्कर्षण (16,40 से संशोधित)

  1. प्रत्येक सेल गोली आसुत जल के 100 μl जोड़ें। नीचे या vortexing ऊपर pipetting और Resuspend।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए 0.2 एम NaOH के 100 μl जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा या vortexing मिक्स।
  3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर निलंबित कर दिया कोशिकाओं को सेते हैं। इस स्तर पर, खमीर कोशिकाओं lysed नहीं किया गया है, और प्रोटीन 40 जारी नहीं किया गया।
  4. कमरे आपा पर 18,000 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं30 सेकंड के लिए ature। pipetting या आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  5. कोशिकाओं lyse करने के लिए, प्रत्येक सेल गोली Laemmli नमूना बफर के 100 μl जोड़ें। नीचे या vortexing ऊपर pipetting और Resuspend।
    नोट: एक रूप सोडियम सल्फेट dodecyl-जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) के साथ संगत में NaOH और Laemmli नमूना बफर विज्ञप्ति प्रोटीन एक Tris ग्लाइसिन चल बफर सिस्टम का उपयोग कर के साथ कोशिकाओं के अनुक्रमिक ऊष्मायन।
  6. 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते 5 मिनट के लिए पूरी तरह से प्रोटीन denature करने के लिए।
    नोट: 95 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन प्रोटीन है कि एकत्रीकरण से ग्रस्त हैं के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है (उदाहरण के लिए, कई transmembrane क्षेत्रों के साथ प्रोटीन)। ये प्रोटीन अघुलनशील जब ऊंचा तापमान 41 में incubated बन सकता है। इस प्रकार, इस तरह के प्रोटीन के विश्लेषण के लिए, lysates कम तापमान पर incubated किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस - 70 डिग्री सेल्सियस) 10 - 30 मिनट, के रूप में अनुभव से निर्धारित।
  7. ro पर 18,000 XG पर अपकेंद्रित्र lysates1 मिनट के लिए ओम तापमान अघुलनशील सामग्री गोली। सतह पर तैरनेवाला (solubilized निकाले प्रोटीन) एसडीएस पृष्ठ और बाद में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से अलग होने के लिए तैयार है। वैकल्पिक रूप से, -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान lysates।

4. प्रतिनिधि एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता प्रक्रिया (16 से अनुकूलित)

  1. लोड प्रोटीन आणविक भार मानकों और एक एसडीएस पृष्ठ जेल पर lysates के अनुभव से निर्धारित मात्रा।
    नोट: ब्याज की प्रोटीन की आणविक वजन के आधार पर एसडीएस पृष्ठ जेल में एक्रिलामाइड और बीआईएस acrylamide का प्रतिशत चुनें। सामान्य तौर पर, कम प्रतिशत जैल बेहतर उच्च आणविक भार प्रोटीन को हल करने के लिए उपयुक्त हैं।
  2. 200 वी पर चलाने के लिए जेल डाई सामने जब तक जेल के नीचे किनारे पर पहुंच गया है।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट - प्रोटीन polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली को जेल से 60 के लिए 20 वी पर गीला हस्तांतरण द्वारा स्थानांतरण।
  4. Tris-buffered खारा में incubating द्वारा झिल्ली ब्लॉक (टीबीएस), 5% दूध स्किम युक्त 1 घंटे के लिए या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर, कमाल।
    नोट: एक झिल्ली रातोंरात incubated की उपस्थिति में माइक्रोबियल विकास को रोकने के लिए, यह 0.02% की एक अंतिम एकाग्रता में अवरुद्ध समाधान में सोडियम azide शामिल करने के लिए सिफारिश की है।
  5. 1 घंटे के लिए 0.1% बीच 20 (टीबीएस / टी) और 1% मलाई निकाला दूध, कमाल के साथ टीबीएस में ब्याज की प्रोटीन के लिए विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली, कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  6. टीबीएस / टी के साथ कमरे के तापमान पर झिल्ली धो 3 एक्स 5 मिनट, कमाल।
  7. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 1% स्किम दूध के साथ टीबीएस / टी में उचित fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं, कमाल।
    नोट: fluorophores प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं। इसलिए, एंटीबॉडी के dilutions fluorophores संयुग्मित अंधेरे में तैयार किया जाना चाहिए, और fluorophores और बाद में धोने कदम संयुग्मित एंटीबॉडी की उपस्थिति में lightproof (जैसे, पन्नी लिपटे) सह हो जाना चाहिए में झिल्ली के ऊष्मायनntainers।
  8. टीबीएस / टी के साथ कमरे के तापमान पर झिल्ली धो 3 एक्स 5 मिनट, कमाल।
  9. छवि लाइट-भ्रष्टाचार ओडिसी CLX और छवि स्टूडियो सॉफ्टवेयर (या तुलनीय इमेजिंग उपकरण और सॉफ्टवेयर), निर्माता सिफारिशों का पालन का उपयोग कर झिल्ली।
  10. झिल्ली छवि प्राप्त करने के बाद, 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर टीबीएस / टी में एक लोडिंग नियंत्रण के प्रोटीन के लिए विशिष्ट एक प्राथमिक एंटीबॉडी 1% स्किम दूध के साथ साथ झिल्ली सेते हैं, कमाल।
  11. टीबीएस / टी के साथ कमरे के तापमान पर झिल्ली धो 3 एक्स 5 मिनट, कमाल।
  12. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 1% स्किम दूध के साथ टीबीएस / टी में उचित fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं, कमाल।
  13. टीबीएस / टी के साथ कमरे के तापमान पर झिल्ली धो 3 एक्स 5 मिनट, कमाल।
  14. कदम 4.9 में के रूप में छवि झिल्ली।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cycloheximide चेस कार्यप्रणाली वर्णन, Deg1 -Sec62 की स्थिरता (चित्रा 1), एक मॉडल खमीर जालिका (ईआर) -associated गिरावट (Erad) सब्सट्रेट, 42-44 विश्लेषण किया गया था। Erad में, गुणवत्ता नियंत्रण यूबीक्यूटिन ligase एंजाइमों covalently ईआर झिल्ली के लिए स्थानीय न्यायपालिका प्रोटीन के छोटे प्रोटीन यूबीक्यूटिन की जंजीरों देते हैं। इस तरह के प्रोटीन polyubiquitylated बाद में ईआर से हटा दिया है और एंटीबॉडी, एक बड़े, साइटोसोलिक प्रोटीज 45 से अपमानित कर रहे हैं। Deg1 -Sec62 प्रोटीन गिरावट के लिए लक्षित करने के बाद यह लगातार और aberrantly translocon, एक चैनल है कि ईआर लुमेन या झिल्ली 43 में प्रोटीन की सुविधा संलग्न है। इसी तरह, स्तनधारी apolipoprotein बी, कम घनत्व लिपो प्रोटीन के एक प्रोटीन घटक, लगातार ईआर translocon संलग्न है और बाद में जब उसके होंठ एक संबंधित तंत्र द्वारा गिरावट से होकर गुजरती हैआईडी बाध्यकारी भागीदारों अनुपस्थित 46-48 कर रहे हैं। इस प्रकार, खमीर कोशिकाओं में Deg1 -Sec62 गिरावट का विश्लेषण करती है प्रोटीन है कि लगातार या aberrantly translocon संलग्न की गिरावट में अंतर्दृष्टि उपज हो सकती है, प्रावधिक करार दिया Erad-टी (translocon जुड़े लिए) substrates 43।

पिछले अध्ययनों से संकेत दिया है कि यूबीक्यूटिन-conjugating एंजाइम Ubc7 साथ ईआर निवासी यूबीक्यूटिन ligase Hrd1 कार्यों Deg1 -Sec62 16,42-44 की गिरावट को उत्प्रेरित करने के लिए। Transmembrane प्रोटीन Cue1 ईआर झिल्ली को Ubc7 एंकर और एंजाइम 49-51 को सक्रिय करता है। हालांकि, Deg1 -Sec62 की गिरावट में Cue1 के लिए एक आवश्यकता सीधे जांच नहीं की गई है। परिकल्पना है कि Cue1, Hrd1 और Ubc7 की तरह, Deg1 -Sec62 के कुशल गिरावट के लिए आवश्यक है परीक्षण करने के लिए, जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती खमीर कोशिकाओं Deg1 -Sec62 व्यक्त cycloheximide चेस और वेस के अधीन थेटर्न धब्बा विश्लेषण (2A चित्रा)। Deg1 -Sec62 प्रोटीन कई प्रजाति के रूप में एसडीएस पृष्ठ पर माइग्रेट करती है। यह पहले के अध्ययनों प्रोटीन 43,44,52 के व्यापक बाद translational संशोधन का संकेत के साथ संगत है। जंगली प्रकार खमीर कोशिकाओं में, Deg1 -Sec62 आसानी से अपमानित किया गया था। पहले मनाया के रूप में, या तो Hrd1 या Ubc7 के नुकसान काफी हद तक Deg1 -Sec62 प्रोटीन 42-44 स्थिर हो। जैसा कि भविष्यवाणी की, Deg1 -Sec62 (Ubc7 के अभाव में के रूप में एक समान हद तक) Cue1 के अभाव में स्थिर हो गया था, Erad-टी में Ubc7 बातचीत प्रोटीन के लिए एक भूमिका की पुष्टि।

Deg1 -Sec62 प्रोटीन हर समय बिंदु पर शेष के अनुपात में मात्रा निर्धारित किया गया था और चित्रा 2B में साजिश रची है। हम ध्यान दें जंगली प्रकार की कोशिकाओं में Deg1 -Sec62 के लापता होने के स्पष्ट दर नवजात Deg1 -Sec62 की गिरावट की दर की एक मूल्यवान समझना हो सकता है कि(यानी, प्रोटीन आधा जीवन है, जो सबसे सीधे पल्स चेस विश्लेषण 43 से निर्धारित किया जा सकता है)। क्योंकि जंगली प्रकार खमीर सक्रिय रूप से Deg1 -Sec62 प्रोटीन cycloheximide अलावा पहले नीचा, Deg1 -Sec62 के स्थिर राज्य बहुतायत काफी हद तक (जो कोशिकाओं में गिरावट बिगड़ा हुआ है) की तुलना में इन कोशिकाओं में कम हो जाता है। यह चित्रा 2A में प्रत्येक तनाव के लिए प्रारंभिक समय बिंदुओं पर Deg1 -Sec62 की बहुतायत की तुलना द्वारा सराहना की जा सकती है। इसके अलावा, सब्सट्रेट प्रोटीन के किसी भी गिरावट प्रतिरोधी उप-जनसंख्या (जैसे, अगर प्रोटीन intracellular पूल से गिरावट को रोका जाता है में जम जाता है) के प्रयोग के समय के पाठ्यक्रम पर जंगली प्रकार की कोशिकाओं में अपेक्षाकृत स्थिर प्रकट हो सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. Deg1 की गिरावट के लिए मॉडल -Sec62 Translocon की न्यायपालिका सगाई (ए) Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 अनुक्रम में, निम्नलिखित तत्व होते हैं के योजनाबद्ध चित्रण निम्नलिखित हैं:।। Deg1 (खमीर ट्रांसक्रिप्शनल repressor MATα2 से एमिनो टर्मिनल 67 एमिनो एसिड), एक झंडा (एफ) मिलान, 2-transmembrane प्रोटीन Sec62, और स्ताफ्य्लोकोच्चुस एक प्रोटीन (पीआरए)। (बी) की दो प्रतियां जालिका (ईआर) झिल्ली में अपने दो transmembrane खंडों के सामान्य सह translational प्रविष्टि के बाद लगातार एसोसिएशन के translocon साथ Deg1 -Sec62 असामान्य, Deg1 निर्भर, बाद translational translocon सगाई हो सके। साइटोसोलिक अमीनो टर्मिनस के एक हिस्से aberrantly में प्रवेश करती है और संभावना के भीतर-translocon बनी हुई है। (सी) translocon सगाई के बाद, Hrd1 यूबीक्यूटिन ligase Deg1 -Sec62 ubiquitylates। Hrd1 यूबीक्यूटिन-conjugating एंजाइम यू द्वारा सहायता प्रदान की हैbc7, जो Cue1 द्वारा ईआर झिल्ली में लंगर डाले है। यूबी, यूबीक्यूटिन प्रोटीन monomers। (डी) Ubiquitylated Deg1 -Sec62 ईआर झिल्ली से निकाला और एंटीबॉडी द्वारा अपमानित, translocon बाधा से राहत है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. cycloheximide चेस पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा किया इंगित करता है कि Cue1 कुशल Deg1 -Sec62 गिरावट लिए आवश्यक है। संकेत दिया जीनोटाइप के (ए) खमीर कोशिकाओं को एक खमीर centromeric प्लाज्मिड एन्कोडिंग Deg1 -Sec62 के साथ बदल गया (pRS416-पी MET25 - Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) और cycloheximide चेस विश्लेषण के अधीन। प्रोटीनहर समय बिंदु (0.125 आयुध डिपो 600 इकाइयों के बराबर) से एक 8% एसडीएस पृष्ठ जेल पर अलग कर दिया और पश्चिमी खरगोश विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी, जो सीधे Deg1 के सी टर्मिनल एक प्रोटीन epitopes बाँध के साथ सोख्ता द्वारा पता चला रहे थे - Sec62 संलयन प्रोटीन। एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में, झिल्ली बाद में Pgk1 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ incubated था। इस प्रयोग को तीन बार दोहराया गया है; प्रतिनिधि परिणाम कल्पना कर रहे हैं। (बी) में डेटा की मात्रा (ए) इमेजिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया गया था। एक क्षेत्र Deg1 -Sec62 प्रोटीन को शामिल की कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रत्येक नमूना के लिए निर्धारित किया गया था। प्रत्येक नमूना के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता Deg1 -Sec62 प्रोटीन के पास पिक्सल की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता से extrapolated किया गया था। इस extrapolated पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता से घटाया गया था समायोजित fluoresc उपज के लिएप्रत्येक नमूना के लिए खिलाडि़यों तीव्रता। कुल, पृष्ठभूमि, और समायोजित प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए इसी तरह quantifications Pgk1, एक लोडिंग नियंत्रण प्रोटीन जिसका बहुतायत की स्थिति यत्न में भिन्नता नहीं है के लिए प्रदर्शन किया गया। नमूनों के बीच Deg1 -Sec62 प्रोटीन की प्रचुरता की तुलना करने के लिए, Pgk1 को Deg1 -Sec62 की समायोजित संकेत तीव्रता के अनुपात के प्रत्येक नमूना के लिए निर्धारित किया गया था। Deg1 -Sec62 / Pgk1 अनुपात (यानी, तुरंत cycloheximide इसके बाद) विश्लेषण के तहत प्रत्येक तनाव के लिए पहली बार बिंदु के लिए 100% के रूप में परिभाषित किया गया था। Deg1 -Sec62 की राशि बाद में समय अंक (यानी, Deg1 -Sec62 / Pgk1 अनुपात) पहली बार बिंदु पर Deg1 -Sec62 / Pgk1 अनुपात के एक प्रतिशत के रूप में गणना की गई पर शेष। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

सिंथेटिक परिभाषित (एसडी) मिनिमल खमीर मझौले 2% डेक्सट्रोज, 0.67% अमीनो एसिड के बिना खमीर नाइट्रोजन का आधार है, 0.002% adenine, 0.004% uracil, 0.002% arginine, 0.001% हिस्टिडीन, 0.006% isoleucine, 0.006% leucine, 0.004% लाइसिन, 0.001% methionine, 0.006% फेनिलएलनिन, 0.005 % threonine, 0.004% tryptophan। ठोस (प्लेट) मध्यम के लिए, 2% अगर शामिल हैं। 1. चयनात्मक माध्यम उचित एमिनो एसिड (ओं) या नाइट्रोजन ठिकानों को छोड़ते हुए तैयार किया जाता है।
2. सुविधा के लिए इस प्रकार के रूप में, इन मुद्दों को ध्यान केंद्रित शेयर समाधान के रूप में बनाए रखा जा सकता है। एमिनो एसिड 100x शेयर सभी वांछित अमीनो एसिड युक्त समाधान के रूप में बनाए रखा जा सकता है। खमीर नाइट्रोजन बेस एक 20x शेयर समाधान (13.4%) में बनाए रखा जा सकता है। डेक्सट्रोज एक 40% शेयर समाधान में बनाए रखा जा सकता है। Adenine और uracil 0.1 एम NaOH में 1% शेयर समाधान के रूप में बनाए रखा जा सकता है।
3।autoclaving द्वारा मध्यम जीवाणुरहित।
खमीर निकालें-Peptone Dextrose (YPD) अमीर खमीर मझौले 1% खमीर निकालने, 2% peptone, 2% डेक्सट्रोज (वैकल्पिक: 0.002% adenine)। ठोस (प्लेट) मध्यम के लिए, 2% अगर शामिल हैं। 1. adenine की धीमी वृद्धि और विशेष रूप से प्रयोगशाला खमीर उपभेदों के लाल रंगाई विशेषता अभाव में (या कम बहुतायत) को रोकने के लिए, adenine YPD मध्यम विकास के लिए जोड़ा जा सकता है।
2. सुविधा के लिए इस प्रकार के रूप में, कुछ सामग्री केंद्रित शेयर समाधान के रूप में बनाए रखा जा सकता है। डेक्सट्रोज एक 40% शेयर समाधान में बनाए रखा जा सकता है। Adenine 0.1 एम NaOH में एक 1% शेयर समाधान के रूप में रखा जा सकता है।
3. autoclaving द्वारा मध्यम जीवाणुरहित।
20x रोक मिक्स 200 मिमी सोडियम azide, 5 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin सोडियम azide मौखिक घूस या त्वचीय संपर्क के माध्यम से विषैला होता है। निर्माता का पालन करेंसिफारिशों जब, तैयारी, भंडारण, और सोडियम azide से निपटने। आकस्मिक जोखिम की स्थिति में परामर्श निर्माता द्वारा प्रदान की सामग्री सुरक्षा डाटा शीट।
20 मिलीग्राम / मिलीलीटर cycloheximide 1. इथेनॉल में तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
2. cycloheximide एक त्वचीय अड़चन है और मौखिक घूस के माध्यम से विषैला होता है। , जब तैयारी भंडारण, और cycloheximide से निपटने के निर्माता की सिफारिशों का पालन करें। आकस्मिक जोखिम की स्थिति में परामर्श निर्माता द्वारा प्रदान की सामग्री सुरक्षा डाटा शीट।
0.2 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड पानी में तैयार करें। सोडियम हाइड्रॉक्साइड गिलास के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। इसलिए, लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 0.2 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड प्लास्टिक के कंटेनर में रखा जाना चाहिए।
Laemmli नमूना बफर 2% एसडीएस, 10% ग्लिसरॉल, 5% और# 946; -mercaptoethanol, 60 मिमी Tris एचसीएल पीएच 6.8, 0.008% bromophenol नीले 1. Laemmli नमूना बफर अक्सर एक अधिक ध्यान केंद्रित किया है (जैसे, 5x) शेयर गिराए द्वारा तैयार किया जाता है।
2. डाई bromophenol नीले वांछित तीव्रता को जोड़ा जा सकता है। ए 'चुटकी' (बहुत छोटे से एक रंग के किनारे से टेप राशि) आमतौर पर पर्याप्त है।
Laemmli चल बफर (5x) 125 मिमी Tris, 960 मिमी ग्लाइसिन, 0.5% एसडीएस DH 2 ओ 5: 1x Laemmli के 1 एल चल बफर तैयार करने के लिए, पतला 1
Tris एसीटेट एसडीएस स्थानांतरण बफर (5x) 125 मिमी Tris एसीटेट (पीएच 8.8), 960 मिमी ग्लाइसिन, 0.05% एसडीएस 1x Tris एसीटेट एसडीएस के 20 एल तैयार स्थानांतरण बफर, गठबंधन 5x शेयर की 4 एल, मेथनॉल के 4 एल, और DH 2 ओ की 12 एल
10x Tris buffered खारा (टीबीएस) 500 मिमी Tris, 1.5 एम NaCl; पीएच 7.5 करने के लिए समायोजित 1x टीबीएस के 1 एल तैयार करने के लिए, DH 2 ओ 1:10 पतला 1x टीबीएस डिटर्जेंट बीच -20 और पाउडर दूध स्किम, के रूप में उपयुक्त के साथ पूरक हो सकता है।

तालिका 1 समाधान इस अध्ययन में इस्तेमाल।

तनाव का नाम उपनाम प्रासंगिक जीनोटाइप संदर्भ
VJY42 MHY501 MATα चेन एट अल।, 1993
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY47 YWO55; MHY507 MATα Jungmann एट अल, 1993। Rubenstein एट अल।, 2012
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105; MHY1364 MATα Biederer एट अल, 1997। Ravid एट अल।, 2006
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MATα ये पढाई
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1Δ :: kanMX4

तालिका 2 खमीर उपभेदों इस अध्ययन में इस्तेमाल। सभी उपभेदों MHY500 53 के साथ congenic हैं। VJY42, VJY47, और VJY56 पहले से 49,53,54 वर्णित किया गया। एक विस्तृत तनाव पीढ़ी और VJY172 के लिए पुष्टि रणनीति (इस अध्ययन के लिए तैयार) अनुरोध पर उपलब्ध है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस पत्र में, प्रोटीन गिरावट कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत किया है। इस तकनीक को आसानी से तंत्र की एक किस्म द्वारा अपमानित प्रोटीन की एक श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है। यह ध्यान रखें कि cycloheximide चेस प्रयोगों एक दिया प्रोटीन की स्थिर अवस्था पूल की गिरावट कैनेटीक्स पर रिपोर्ट महत्वपूर्ण है। अन्य तकनीकों प्रोटीन के विशिष्ट आबादी की गिरावट कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, नवजात polypeptides की degradative भाग्य पल्स चेस विश्लेषण 55 से लगाया जा सकता है। इस तरह के प्रयोगों में, नवजात प्रोटीन संक्षेप में पल्स लेबल (जैसे, रेडियोधर्मी एमिनो एसिड के साथ) कर रहे हैं। लेबल नवजात प्रोटीन (जो या स्थिर राज्य प्रोटीन बहुतायत में परिवर्तन दर्पण नहीं हो सकता है) की बहुतायत में परिवर्तन के समय के साथ लगाया जा सकता है।

Cycloheximide चेस एक अपेक्षाकृत कम समय के पाठ्यक्रम पर प्रोटीन स्थिरता का विश्लेषण करने (यानी, दो घंटे तक) के लिए उपयुक्त है। पर अब समय गourses (यानी, दो दिनों के लिए घंटे), cycloheximide, अनुवाद के एक वैश्विक अवरोध, यूबीक्यूटिन 56 की कमी के कारण कोशिकाओं को विषाक्त, संभावना है। इसके अलावा, लंबे समय के पाठ्यक्रम से अधिक प्रोटीन स्थिरता का विश्लेषण करती है और अधिक ब्याज की प्रोटीन (की गिरावट पर विश्व स्तर पर बिगड़ा प्रोटीन संश्लेषण के अप्रत्यक्ष प्रभाव से समझौता होने की संभावना है जैसे, एक अल्पकालिक प्रोटीन की प्रोटीन की गिरावट में शामिल की गिरावट ब्याज)। ऐसे पल्स चेस चयापचय लेबलिंग प्रयोगों के रूप में अन्य तकनीक, इसलिए बेहतर लंबे समय रहते प्रोटीन की गिरावट के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं और cycloheximide चेस प्रयोगों में प्राप्त परिणामों की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है।

cycloheximide और कोशिकाओं के संग्रह के अलावा के समय इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण विचार है। कुछ ही समय में छोटे विचलन cycloheximide addi से गुजरे रूप में सटीक, बहुत कम रहता प्रोटीन के विश्लेषण में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैसेल फसल के लिए tion स्पष्ट गिरावट कैनेटीक्स पर काफी प्रभाव पड़ सकता है। इसके अलावा, इन समय के प्रति संवेदनशील चरणों को क्रियान्वित करने के लिए एक स्पष्ट योजना के बिना, एक प्रयोग तेजी से अराजकता और हताशा में उतरना सकता है। इस कारण से, यह योजना बनाई है, नियमित अंतराल पर संस्कृतियों के लिए cycloheximide जोड़ने की सिफारिश की है। 30 सेकंड के अंतराल में इस प्रोटोकॉल में सुझाव दिया है, लेकिन समय आराम के स्तर और अन्वेषक की निपुणता मैच के लिए समायोजित किया जा सकता है। नौसिखिए जांचकर्ताओं यह प्रयोग की शुरुआत करने से पहले नमूना संग्रह बार के एक कार्यक्रम के बारे में और प्रत्येक अनुसूचित संग्रह बंद पार करने के लिए के रूप में यह होता है के लिए उपयोगी मिल सकता है।

कदम 1.7 और यहां वर्णित प्रोटोकॉल का 1.8 में, खमीर सेल संस्कृतियों बाद cycloheximide पीछा करने की प्रक्रिया के दौरान गड़बड़ी की आसानी के लिए मध्यम विकास के लिए कम मात्रा में केंद्रित कर रहे हैं। हालांकि, खमीर कोशिकाओं का तेजी से centrifugation कुछ सेलुलर तनाव प्रतिक्रियाओं (जैसे, संकेत दे रास्ते लाती है किग्लूकोज अभाव) 57,58 से सक्रिय कर रहे हैं। जांचकर्ता इसलिए centrifugation की विस्तारित अवधि के खिलाफ आगाह कर रहे हैं। जब प्रोटीन की स्थिरता कि centrifugation के प्रति संवेदनशील हो सकता है का विश्लेषण करने, जांचकर्ताओं से पहले centrifugation के बिना मध्य लॉग चरण संस्कृतियों के लिए सीधे cycloheximide जोड़ने की इच्छा हो सकती है। ऐसे मामलों में, cycloheximide ही अंतिम एकाग्रता (250 माइक्रोग्राम / एमएल) को जोड़ा जाना चाहिए, और खमीर सेल के नमूने तरीके में है कि एक प्रारंभिक centrifugation कदम (जैसे, तेजी से निस्पंदन) 57 की आवश्यकता नहीं है द्वारा काटा जा सकता है। इसके अलावा, कदम में 2.3 - 2.5, हर समय बिंदु पर एकत्र नमूनों एक समाधान सोडियम azide युक्त करने के लिए स्थानांतरित और बर्फ पर रखा जाता है। इन शर्तों का पीछा करने की अवधि के लिए प्रोटीन गिरावट जारी रखा रोकना। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि azide, एटीपी 59 के सेलुलर एकाग्रता कम कर देता है जिससे विशेष रूप से एटीपी निर्भर proteases की गतिविधि में बाधा। जबकि कम तापमान चाहिए एकLSO दर जो गैर एटीपी निर्भर प्रोटिओलिटिक प्रक्रियाओं समारोह में, इस तरह के तंत्र द्वारा अपमानित प्रोटीन का अध्ययन जांचकर्ताओं वैकल्पिक रूप से तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रीज करने के लिए सेल छर्रों के रूप में प्रत्येक नमूना काटा जाता है चुन सकते हैं कम।

सेल और पश्चिमी सोख्ता इस पांडुलिपि में शामिल करने के लिए एक प्रतिनिधि प्रोटोकॉल के लिए एक नमूना प्रोटोकॉल पिछली रिपोर्टों 16,40 से अनुकूलित किया गया है। पोस्ट-क्षारीय सेल यहाँ वर्णित विधि में, NaOH pretreatment Laemmli नमूना बफर के बाद के अलावा पर खमीर प्रोटीन की निकासी को बढ़ाता है। व्यवस्था है जिसके द्वारा इस वृद्धि होती है खराब 40 विशेषता है। हालांकि, इस तरह खमीर सेल दीवारों में पाए जाने वाले के रूप में polysaccharides क्षार की स्थिति 60 में solubilized रहे हैं। यह इसलिए उन्हें और अधिक sensitiv प्रतिपादन NaOH की उपस्थिति में है कि ऊष्मायन सट्टा करने के लिए आकर्षक है आंशिक रूप से या पूरी तरह से खमीर कोशिकाओं स्फेरोप्लास्ट (यानी, सेल दीवार घटकों को हटाता है),Laemmli नमूना बफर में एसडीएस डिटर्जेंट पेश करने के लिए ई। क्योंकि प्रोटीन अत्यधिक denaturing शर्तों के तहत जारी किया जाता है, प्रोटीज अवरोधकों Laemmli नमूना बफर में शामिल होने की जरूरत नहीं। सेल की विशेष विधि एक दिया प्रयोग के लिए उपयुक्त के रूप में संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पोस्ट-क्षारीय सेल विधि कम बहुतायत प्रोटीन या प्रोटीन है कि खराब पश्चिमी धब्बा द्वारा पता चला रहे हैं के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। ऐसे मामलों में, तरीकों कि प्रोटीन के नमूने ध्यान केंद्रित करने के लिए सबसे उपयुक्त हो सकता है 61 एक Trichloroacetic एसिड वर्षा कदम शामिल हैं। इसके अलावा, कई महत्वपूर्ण एंटीबॉडी चयन के बारे में विचार, लोडिंग नियंत्रण पसंद है, और पता लगाने के वैकल्पिक साधन (जैसे, chemiluminescent पश्चिमी सोख्ता फिल्म या डिजिटल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग) ने हाल ही में किया गया है 16 चर्चा की। cycloheximide इलाज के बाद प्रोटीन बहुतायत के quantitation प्रदर्शन किया जा सकता है। कई इमेजिंग सिस्टम सॉफ्टवेयर संकुल है कि सुविधा के साथ बेच रहे हैंइस विश्लेषण।

Cycloheximide चेस खमीर प्रोटीन की एक किस्म की गिरावट का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है और अन्य कोशिकाओं में प्रोटीन स्थिरता का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, cycloheximide इलाज सेल और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा प्रोटीन बहुतायत का पता लगाने के बाद है। आवेदन पर निर्भर करता है, हालांकि, प्रोटीन बहुतायत cycloheximide इलाज के बाद तकनीकों की एक श्रृंखला के द्वारा, अनुसंधान उद्देश्यों के लिए उचित रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि प्रोटीन आकार के विश्लेषण के लिए एक प्रासंगिक कारक नहीं है, सेल lysates डॉट धब्बा या एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) विश्लेषण है, जो प्रोटीन बहुतायत पर रिपोर्ट करने के लिए नहीं स्पष्ट आणविक वजन 62 के अधीन किया जा सकता है, लेकिन। कोशिका की सतह पर प्रोटीन के लिए (या आंतरिक fluorescently आंतरिक प्रोटीन से टैग), प्रवाह cytometry cycloheximide इसके अलावा 51 के बाद अलग अलग समय पर नमूने के प्रोटीन बहुतायत मात्रा ठहराना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Fluorescence माइक्रोस्कोपी निम्नलिखित cycloheximide उपचार दोनों प्रोटीन बहुतायत और स्थानीयकरण 18 के बारे में जानकारी प्रदान करेगा। substrates, जीव, और बहाव के अनुप्रयोगों cycloheximide का पीछा करने के लिए उत्तरदायी की सीमा तकनीक प्रोटीन गिरावट का अध्ययन करने के लिए एक बहुत बहुमुखी और सूचनात्मक साधन बनाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Tags

जैव रसायन अंक 110, खमीर म्यूटेंट जालिका जुड़े गिरावट प्रोटीन गिरावट cycloheximide चेस translocon यूबीक्यूटिन-एंटीबॉडी प्रणाली नवोदित
में प्रोटीन गिरावट के cycloheximide चेस विश्लेषण<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E.,… More

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter