Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Cycloheximid Chase Analyse af proteinnedbrydning i Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

Regulering af protein overflod er afgørende for næsten alle cellulære proces. Protein overflod afspejler integrationen af ​​satserne for proteinsyntese og proteinnedbrydning. Mange analyser rapportering på protein overflod (f.eks single-tidspunkt western blotting, flowcytometri, fluorescens mikroskopi, eller vækst-baserede reporter analyser) tillader ikke diskrimination af de relative effekter af oversættelse og proteolyse på protein niveauer. I denne artikel beskrives anvendelsen af cycloheximid chase efterfulgt af western blotting til specifikt at analysere proteinnedbrydning i modellen encellede eukaryot, Saccharomyces cerevisiae (knopskydende gær). I denne procedure, er gærceller inkuberes i nærvær af den translationelle inhibitor cycloheximid. Portioner af celler opsamles umiddelbart efter og ved specifikke tidspunkter efter tilsætning af cycloheximid. Cellerne lyseres, og lysaterne adskilles ved polyacrylamidgelelektroforese for Western blot-analyse af protein overflod på hvert tidspunkt. Proceduren for cycloheximid chase tillader visualisering af nedbrydningsprodukterne kinetik steady state population af en række cellulære proteiner. Proceduren kan anvendes til at undersøge de genetiske krav til og miljømæssige påvirkninger af proteinnedbrydning.

Introduction

Proteiner udfører livsvigtige funktioner i næsten alle cellulære proces. Mange fysiologiske processer kræver tilstedeværelsen af ​​et specifikt protein (eller proteiner) i en bestemt periode eller under særlige omstændigheder. Organismer derfor overvåge og regulere protein overflod at opfylde cellulære behov 1. For eksempel cycliner (proteiner, der styrer celledeling) er til stede på specifikke faser af cellecyklussen, og tabet af regulerede cyclin niveauer har været forbundet med malign tumordannelse 2. Ud over at regulere protein niveauer for at opfylde cellulære behov, celler ansætte nedbrydende kontrolmekanismer, som kan eliminere forkert foldede, ikke samlede eller på anden måde afvigende proteinmolekyler 3. Kontrol af protein overflod involverer regulering af både makromolekylær syntese (transskription og translation) og nedbrydning (RNA forfald og proteolyse). Nedsat eller overdreven protein nedbrydning bidrager til flere patologier, Herunder cancer, cystisk fibrose, neurodegenerative tilstande, og cardiovaskulære lidelser 4-8. Proteolytiske mekanismer udgør derfor lovende terapeutiske mål for en række sygdomme 9-12.

Analyse af proteiner på et enkelt tidspunkt (fx ved Western blot 13, flowcytometri 14, eller fluorescensmikroskopi 15) giver et øjebliksbillede af steady state-protein overflod uden at afsløre de relative bidrag af syntese eller nedbrydning. Ligeledes vækst-baserede reporter analyser afspejler steady state protein niveauer over en længere tidsperiode uden at forskelsbehandle de påvirkninger af syntese og nedbrydning 15-20. Det er muligt at udlede bidrag nedbrydende processer til steady state protein niveauer ved at sammenligne overflod før og efter at hæmme specifikke komponenter af nedbrydende mekanisme (fx ved farmakologisk inaktivere proteasome 21 eller banke ud et gen hypotese at være nødvendig for nedbrydning 13). En ændring i steady state protein niveauer efter at hæmme nedbrydningsveje giver stærke beviser for bidrag proteolyse til kontrol af protein overflod 13. Men en sådan analyse stadig ikke give oplysninger om kinetikken af ​​protein omsætning. Cycloheximid chase efterfulgt af western blotting overvinder disse svagheder ved at tillade forskerne at visualisere protein nedbrydning over tid 22-24. Da endvidere proteinpåvisning følgende cycloheximid chase typisk udføres ved western blotting, radioaktive isotoper og langvarige immunpræcipitation trin er ikke påkrævet for cycloheximid chase i modsætning til mange almindeligt anvendte puls chase teknikker, som også udføres for at visualisere proteinnedbrydning 25.

Cycloheximid blev først identificeret som en forbindelse med anti-fungal korrektbånd fremstillet af gram-positiv bakterie Streptomyces griseus 26,27. Det er en celle-gennemtrængelig molekyle, der specifikt hæmmer eukaryote cytosol (men ikke organellar) oversættelse ved at ændre ribosomal translokation 28-31. I et cycloheximid chase eksperiment cycloheximid tilsat til cellerne, og alikvoter af celler opsamles straks og ved specifikke tidspunkter efter tilsætning af forbindelse 22. Cellerne lyseres, og protein overflod ved hvert tidspunkt analyseres, typisk ved western blot. Fald i protein overflod efter tilsætning af cycloheximid kan trygt tilskrives proteinnedbrydning. En ustabil protein vil falde i overflod med tiden, mens et relativt stabilt protein vil udvise en lille ændring i overflod.

Mekanismer af selektiv proteinnedbrydning er blevet stærkt bevaret hele Eukarya. Meget af hvad man ved om protein nedbrydning blev først lært imodellen encellede eukaryot, Saccharomyces cerevisiae (knopskydende gær) 25,32-36. Undersøgelser med gær sandsynligvis fortsat levere nye og vigtige indsigt i protein nedbrydning. Fremgangsmåde til cycloheximid chase i gærceller, efterfulgt af Western blot-analyse af protein overflod præsenteres her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vækst og Harvest af gærceller

  1. Hvis ikke analysere nedbrydningskinetik af et endogent gærprotein, transformere ønskede gærstamme (er) med et plasmid der koder for proteinet af interesse. Pålidelige metoder til gærtransformation er tidligere blevet beskrevet 37.
  2. Pode gær i 5 ml passende medium (f.eks selektiv syntetiske defineret (SD) medium til plasmid vedligeholdelse af transformerede celler eller ikke-selektiv gærekstrakt-pepton-dextrose (YPD) medium til ikke-transformerede celler). Inkuber natten over ved 30 ° C, roterer.
    BEMÆRK: 30 ° C er den optimale væksttemperatur for typiske vildtype laboratorium gærstammer 38. Men fordi nogle mutante gærstammer ikke vokser optimalt ved 30 ° C, og nogle proteiner undergår temperaturafhængige nedbrydning, de anvendte temperaturer for gær cellevækst og cycloheximid chase bør bestemmes empirisk 39.
  3. Mål the optisk densitet ved 600 nm (OD600) af hver overnatskultur.
    BEMÆRK: Celler kan være i logaritmisk eller stationære vækstfase, men burde have minimalt nået en densitet, der vil tillade fortynding til en OD600 = 0,2 i 15 ml frisk medium.
  4. Fortynde overnatskulturer til en OD 600-værdi på 0,2 i 15 ml frisk medium.
  5. Inkuber gær ved 30 ° C, omrystning, indtil cellerne når mid-logaritmisk vækstfase (dvs. en OD600 mellem 0,8 og 1,2).
  6. Under gær cellevækst, udfør følgende som forberedelse til cycloheximid chase procedure:
    1. Indstil en varmeblok, der kan rumme 15 ml koniske rør til 30 ° C til inkubation af celler i nærvær af cycloheximid. Tilsæt vand til brøndene i varmeblokken for at muliggøre effektiv varmefordeling til kulturer. Tilsæt vand til hver brønd, således at et 15 ml konisk rør vil forårsage vandet til at stige til, men ikke flyde, læben af ​​brønden.
    2. Fastsætte en anden varmeblok, der kan rumme 1,5 ml mikrocentrifugerør til 95 ° C for proteindenaturering følgende cellelysis.
    3. Pre-varm frisk vækstmedium (1,1 ml pr tidspunkt per kultur, der skal analyseres) til 30 ° C.
    4. Tilsæt 50 pi 20x Stop Mix til at pre-mærket mikrocentrifugerør (ét rør pr tidspunkt per kultur, der skal analyseres). Rørene anbringes på is.
      ADVARSEL: Natriumazid, en ingrediens i 20x Stop Mix, er giftigt via oral indtagelse eller hudkontakt. Følg producentens anbefalinger ved udarbejdelsen, opbevaring og håndtering af natriumazid. I tilfælde af utilsigtet eksponering, konsultere sikkerhedsdatablad leveres af producenten.
  7. Når cellerne har nået mid-logaritmisk vækst, indsamle 2,5 OD600 enheder af hver kultur per tids- punkt, der skal analyseres (fx 7,5 OD600 enheder til at analysere protein overflod på tre tidspunkter). Centrifuge indsamlede celler i 15 ml koniske rør på 3,000 xg ved stuetemperatur i 2 minutter.
    BEMÆRK: En OD600 enhed er lig med mængden af gær til stede i 1 ml kultur på en OD 600 på 1,0. Mængden af kultur (i ml), der kræves for at høste X OD 600 enheder (V) kan bestemmes ved hjælp af følgende ligning: V = X OD 600 enheder / Målt OD 600. For eksempel for at høste 7,5 OD600 enheder af gær-cellekultur ved en OD600 på 1,0, indsamle 7,5 OD600 enheder / 1,0 = 7,5 ml gærkultur.
  8. Resuspender hver cellepellet i 1 ml 30 ° C (forvarmet) frisk vækstmedium pr 2,5 OD600 enheder af celler (f.eks 3 ml i 7,5 OD 600 enheder).

2. Cycloheximid Chase

  1. Ækvilibrering gær cellesuspensioner ved inkubation i 5 minutter i 30 ° C varmeblok.
  2. Forbered en timer til at tælle op fra 0:00.
  3. Til at begynde cycloheximid chase, tryk på "Start" på timeren. hurtigt,men omhyggeligt, udføre følgende trin:
    1. Tilføj cycloheximid til en slutkoncentration på 250 ug / ml til den første gærcelle suspension (dvs. føje 37,5 pi 20 mg / ml cycloheximid lager til 3 ml cellesuspension), og vortex kortvarigt at blande.
      ADVARSEL: Cycloheximid er en dermal irriterende og er giftigt ved oral indtagelse. Følg producentens anbefalinger ved udarbejdelsen, opbevaring og håndtering af cycloheximid. I tilfælde af utilsigtet eksponering, konsultere sikkerhedsdatablad leveres af producenten.
    2. Umiddelbart efter tilsætning cycloheximid og vortexbehandling overføre 950 pi (~ 2,4 OD 600 enheder) af gær cellesuspensionen tilsat cycloheximid til en forud mærket mikrocentrifugerør indeholdende 50 pi iskold 20x-stop mix. Vortex mikrocentrifugerør, og sted på is indtil alle prøver er indsamlet.
    3. Returnere gærcelle suspensionen til 30 ° C.
  4. Gentag trin 2.3.1 gennem 2.3.3 For hver af de resterende gær cellesuspensioner med regelmæssige tidsintervaller (f.eks hvert 30. sek, således at der tilsættes cycloheximid til prøve # 1 på 0:00, prøve # 2 på 00:30, prøve # 3 på 1:00 osv.).
  5. Ved hvert efterfølgende tidspunkt, vortex gær-suspensioner og overføre 950 pi til mærkede mikrocentrifugerør indeholdende 50 pi præ-kølet 20x Stop Mix. Vortex og sted indsamlede celler på is. Retur 15 ml koniske rør til 30 ° C varme blok.
    1. For eksempel til samling af celler 30 minutter efter cycloheximid tilsætning (forudsat 30-sec intervaller mellem cycloheximid tilsætning til gær-suspensioner i begyndelsen af ​​tidsforløbet), vortex og fjerne 950 pi cellesuspension fra Sample # 1 ved 30:00 . Gentag for Sample # 2 på 30:30, og så videre.
      BEMÆRK: For at undgå bundfældning af gær, vortex cellesuspensioner i 15 ml koniske rør cirka hver 5 min under hele jagten. Alternativt gærcelle suspensions kan opretholdes i en kontinuerligt omrøring vandbad for varigheden af ​​cycloheximid chase eksperiment.
  6. Når alle prøver er blevet indsamlet, pellet indsamles cellerne ved centrifugering ved 6.500 x g ved stuetemperatur i 30 sek. Fjern supernatanten ved pipettering eller aspiration. Celler er nu klar til alkalisk lyse. Alternativt, snap-fryse pelleteret celler i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.

3. Post-alkalisk Protein Extraction (modificeret fra 16,40)

  1. Tilsæt 100 pi destilleret vand til hver cellepellet. Opblande ved pipettering op og ned eller vortexbehandling.
  2. Tilsæt 100 pi 0,2 M NaOH til hver prøve. Bland ved pipettering op og ned eller vortexing.
  3. Inkuber suspenderede cellerne ved stuetemperatur i 5 min. På dette trin har gærceller ikke lyseret, og proteiner ikke er overgået 40.
  4. Pellet cellerne ved centrifugering ved 18.000 xg ved stuetemperatur temperamentstemet i 30 sek. Fjern supernatanten ved pipettering eller aspiration.
  5. At lysere celler, der tilsættes 100 pi Laemmli prøve buffer til hver cellepellet. Opblande ved pipettering op og ned eller vortexbehandling.
    BEMÆRK: Sekventiel inkubering af celler med NaOH og Laemmli prøvebuffer frigiver proteiner i en form, forenelig med natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse af en Tris-glycin kørende puffersystem.
  6. Inkuber ved 95 ° C i 5 min til fuldt denaturere proteiner.
    BEMÆRK: Inkubation ved 95 ° C, kan ikke være egnet til analyse af proteiner, der er tilbøjelige til aggregering (f.eks proteiner med flere transmembransegmenter). Disse proteiner kan blive uopløselige ved inkubering ved forhøjede temperaturer 41. Således for analysen af sådanne proteiner, lysater skal inkuberes ved lavere temperaturer (f.eks 37 ° C - 70 ° C) i 10 - 30 min, som bestemmes empirisk.
  7. Centrifugér lysater ved 18.000 xg ved roabout temperatur i 1 min for at pelletere uopløseligt materiale. Supernatanten (solubiliseret ekstraheret protein) er klar til separation ved SDS-PAGE og efterfølgende Western blot-analyse. Alternativt gemme lysater ved -20 ° C.

4. Repræsentant SDS-PAGE og Western blotting-procedure (Tilpasset fra 16)

  1. Load protein molekylvægtstandarder og empirisk volumen af ​​lysater på en SDS-PAGE-gel.
    BEMÆRK: Vælg den procentdel af acrylamid og bis-acrylamid i SDS-PAGE-gel baseret på molekylvægten af ​​proteinet af interesse. Generelt lavere procentdel geler er bedre egnet til at løse højere molekylvægt proteiner.
  2. Kør gel ved 200 V, indtil farvefronten har nået den nederste kant af gelen.
  3. Overfør proteiner fra gelen til polyvinylidenfluorid (PVDF) membran ved våd overførsel ved 20 V i 60 - 90 min ved 4 ° C.
  4. Blokere membranen ved inkubation i Tris-saltvand (TBS) indeholdende 5% skummetmælk, vuggende, ved stuetemperatur i 1 time eller ved 4 ° C natten over.
    BEMÆRK: For at forhindre mikrobiel vækst i nærvær af en membran inkuberet natten, anbefales det at medtage natriumazid i blokeringsopløsningen ved en slutkoncentration på 0,02%.
  5. Inkuber membranen med primært antistof specifikt for proteinet af interesse i TBS med 0,1% Tween-20 (TBS / T) og 1% skummetmælk, vuggende, ved stuetemperatur i 1 time.
  6. Vask membranen ved stuetemperatur 3 x 5 min med TBS / T, rokkende.
  7. Inkuber membranen med passende fluorofor-konjugeret sekundært antistof i TBS / T med 1% skummetmælk ved stuetemperatur i 1 time, vuggende.
    BEMÆRK: Fluoroforer er lysfølsomme. Derfor bør fortyndinger af antistoffer konjugeret til fluoroforer fremstilles i mørke, og inkubering af membraner i nærvær af antistoffer konjugeret til fluoroforer og efterfølgende vasketrin bør forekomme i lystæt (f.eks folie-indpakkede) containers.
  8. Vask membranen ved stuetemperatur 3 x 5 min med TBS / T, rokkende.
  9. Billede membran ved hjælp LI-COR Odyssey CLX og Image Studio software (eller tilsvarende imaging udstyr og software), efter producentens anbefalinger.
  10. Efter erhvervelse membran billede, inkubere membranen med et primært antistof specifikt for en belastning kontrolprotein i TBS / T med 1% skummetmælk ved stuetemperatur i 1 time, vuggende.
  11. Vask membranen ved stuetemperatur 3 x 5 min med TBS / T, rokkende.
  12. Inkuber membranen med passende fluorofor-konjugeret sekundært antistof i TBS / T med 1% skummetmælk ved stuetemperatur i 1 time, vuggende.
  13. Vask membranen ved stuetemperatur 3 x 5 min med TBS / T, rokkende.
  14. Billede membran som i trin 4.9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at illustrere cycloheximid chase metode blev stabiliteten af Deg1 -Sec62 (figur 1), en model gær endoplasmatiske reticulum (ER) associeret nedbrydning (ERAD) substrat, analyseres 42-44. I ERAD, kvalitetskontrol ubiquitin ligaseenzymer covalent vedhæfte kæder af lille protein ubiquitin til afvigende proteiner lokaliseret til ER-membranen. Sådanne polyubiquitylated proteiner fjernes efterfølgende fra ER og nedbrydes af proteasomet, et stort, cytosolisk protease 45. Den Deg1 -Sec62 protein er målrettet til nedbrydning efter det vedholdende og afvigende tilkobler translocon, en kanal, der letter protein translokation ind i ER lumen eller membran 43. Tilsvarende mammal apolipoprotein B, en proteinkomponent af lipoproteiner med lav densitet, vedvarende indgreb ER translocon hvorefter der gennemføres nedbrydning af en beslægtet mekanisme, når dens læbeid bindende partnere er fraværende 46-48. Således analyser af Deg1 -Sec62 nedbrydning i gærceller kan give indsigt i nedbrydningen af proteiner, der vedholdende eller afvigende engagere den translocon, foreløbigt betegnes ERAD-T (for translocon-associeret) substrater 43.

Tidligere undersøgelser har indikeret, at de ER-resident ubiquitinligase Hrd1 funktioner med ubiquitin-konjugerende enzym Ubc7 at katalysere nedbrydning af Deg1 -Sec62 16,42-44. Det transmembrane protein Cue1 forankrer Ubc7 til ER-membranen og aktiverer enzymet 49-51. Men et krav for Cue1 i nedbrydningen af Deg1 -Sec62 er ikke blevet direkte undersøgt. For at teste hypotesen om, at Cue1, ligesom Hrd1 og Ubc7, er nødvendig for effektiv nedbrydning af Deg1 -Sec62 blev vildtype og mutant gærceller der udtrykker Deg1 -Sec62 underkastet cycloheximid chase og western blot-analyse (figur 2A). Den Deg1 -Sec62 protein migrerer på SDS-PAGE som flere arter. Dette er i overensstemmelse med tidligere studier indikerer omfattende posttranslationel modifikation af proteinet 43,44,52. I vildtype gærceller, Deg1 -Sec62 var let nedbrudt. Som tidligere observeret, tab af enten Hrd1 eller Ubc7 stabiliseret væsentligt Deg1 -Sec62 protein 42-44. Som forudsagt blev Deg1 -Sec62 stabiliseret i fravær af Cue1 (til en lignende omfang som i mangel af Ubc7), bekræfter en rolle for Ubc7-interagerende protein i ERAD-T.

Andelen af Deg1 -Sec62 protein tilbage ved hvert tidspunkt blev kvantificeret og afsættes i figur 2B. Vi bemærker, at den tilsyneladende hastighed af forsvinden Deg1 -Sec62 i vildtype celler kan være en undervurdering af hastigheden af nedbrydning af spirende Deg1 -Sec62(Dvs. proteinets halveringstid, som kan mest direkte bestemmes ved pulse chase analyse 43). Fordi vildtype gær aktivt nedbryder Deg1 -Sec62 proteinet forud for cycloheximid tilsætning opnås steady state overflod af Deg1 -Sec62 væsentligt reduceret i disse celler (sammenlignet med celler, hvori nedbrydningen er nedsat). Dette kan forstås ved at sammenligne den overflod af Deg1 -Sec62 i den indledende tidspunkter for hver stamme i figur 2A. Endvidere enhver nedbrydning-resistent underpopulation af substratet protein (fx hvis proteinet akkumuleres i intracellulære pulje, hvorfra nedbrydning forhindres) kan synes forholdsvis stabil i vildtypeceller over tidsforløbet af eksperimentet.

figur 1
Figur 1. Model for Nedbrydning af Deg1 -Sec62 Efter Aberrant Ansættelse af Translocon (A) Skematisk visning af Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 består af følgende elementer, i rækkefølge:.. Deg1 (de aminoterminale 67 aminosyrer fra gæren transskriptionsrepressor MATα2), et Flag (F) epitop, 2-transmembrane protein sec62, og to kopier af Staphylococcus aureus protein A (PRA). (B) efter normal co-translationel indsættelse af sine to transmembransegmenter ind i det endoplasmatiske reticulum (eR) membran, vedvarende forening af Deg1 -Sec62 med translocon udløser unormal, Deg1 -afhængig, posttranslationel translocon engagement. En del af den cytosoliske aminoterminal afvigende kommer ind-og sandsynligvis forbliver inden-for translocon. (C) Efter translocon engagement, den Hrd1 ubiquitinligase ubiquitylates Deg1 -Sec62. Hrd1 bistås af ubiquitin-konjugerende enzym Ubc7, som er forankret i ER-membranen ved Cue1. Ub, ubiquitin protein monomerer. (D) Ubiquitylated Deg1 -Sec62 udvindes fra ER membranen og nedbrydes af proteasomet, lindre translocon obstruktion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Cycloheximid Chase efterfulgt af vestlige Blotting Angiver, at Cue1 er påkrævet for effektiv Deg1 -Sec62 Nedbrydning. (A) Gærceller af de angivne genotyper blev transformeret med en gær centromerisk plasmid, der koder Deg1 -Sec62 (pRS416-P MET25 - Deg1 -flag-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) og underkastet cycloheximid chase analyse. Proteins fra hvert tidspunkt (svarende til 0,125 OD 600 enheder) blev adskilt på en 8% SDS-PAGE-gel og påvist ved western blotting med kanin-anti-muse sekundære antistoffer, der direkte binder de C-terminale Protein A epitoper af Deg1 - sec62 fusionsprotein. Som loading kontrol blev membranen efterfølgende inkuberet med antistoffer specifikke for PGK1. Dette eksperiment er blevet gentaget tre gange; repræsentative resultater er afbilledet. (B) Kvantificering af data i (A) blev udført ved hjælp af imaging software (se tabel of Materials). Den samlede fluorescensintensitet af et område, der omfatter Deg1 -Sec62 protein blev bestemt for hver prøve. Baggrund fluorescensintensitet for hver prøve blev ekstrapoleret fra gennemsnittet fluorescensintensitet af pixel nær Deg1 -Sec62 proteinet. Denne ekstrapolerede baggrund fluorescensintensiteten blev subtraheret fra den totale fluorescensintensitet til opnåelse justerede fluorescerning intensitet for hver prøve. Lignende kvantificeringer til alt, baggrund, og justerede fluorescensintensiteter blev udført for PGK1, en belastning kontrol protein, hvis overflod ikke varierer i forhold analyserede. At sammenligne den overflod af Deg1 -Sec62 protein blandt prøver blev et forhold mellem det indstillede signal intensiteter af Deg1 -Sec62 til PGK1 bestemt for hver prøve. Den Deg1 -Sec62 / PGK1 forholdet blev defineret som 100% for det første tidspunkt (dvs. umiddelbart efter cycloheximid tilsætning) for hver stamme under analyse. Mængden af Deg1 -Sec62 tilbage ved efterfølgende tidspunkter (dvs. de Deg1 -Sec62 / PGK1 nøgletal) blev beregnet som en procentdel af Deg1 -Sec62 / PGK1 ratio på det første tidspunkt. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Syntetisk Defineret (SD) Minimal Gær Medium 2% dextrose, 0,67% gærnitrogenbase uden aminosyrer, 0,002% adenin, 0,004% uracil, 0,002% arginin, 0,001% histidin, 0,006% isoleucin, 0,006% leucin, 0,004% lysin, 0,001% methionin, 0,006% phenylalanin, 0,005 % threonin, 0,004% tryptofan. For faststof (plade) medium, indbefatter 2% agar. 1. Selektiv medium fremstilles ved at udelade passende aminosyre (r) eller nitrogenholdige baser.
2. For nemheds skyld kan disse ingredienser opretholdes som koncentrerede stamopløsninger som følger. Aminosyrer kan opretholdes som 100x stamopløsning indeholdende alle de ønskede aminosyrer. Gærnitrogenbase kan opretholdes i en 20x stamopløsning (13,4%). Dextrose kan opretholdes i en 40% stamopløsning. Adenin og uracil kan opretholdes i 1% stamopløsninger i 0,1 M NaOH.
3.Der steriliseres mediet ved autoklavering.
Gærekstrakt-pepton dextrose (YPD) Rich Gær Medium 1% gærekstrakt, 2% pepton, 2% dextrose (Valgfrit: 0,002% adenin). For faststof (plade) medium, indbefatter 2% agar. 1. For at undgå den langsomme vækst og rødfarvning karakteristisk for særlige laboratorium gærstammer i fravær (eller lav tæthed) af adenin, kan adenin hvormed YPD vækstmedium.
2. For nemheds skyld kan nogle ingredienser opretholdes som koncentrerede stamopløsninger som følger. Dextrose kan opretholdes i en 40% stamopløsning. Adenin kan opretholdes som en 1% stamopløsning i 0,1 M NaOH.
3. steriliseres mediet ved autoklavering.
20x Stop Mix 200 mM natriumazid, 5 mg / ml bovint serumalbumin Natriumazid er giftigt ved oral indtagelse eller hudkontakt. Følg producentensanbefalinger ved udarbejdelsen, opbevaring og håndtering af natriumazid. I tilfælde af utilsigtet eksponering, konsultere sikkerhedsdatablad leveres af producenten.
20 mg / ml cycloheximid 1. Forbered i ethanol. Opbevar ved -20 ° C.
2. Cycloheximid er en dermal irriterende og er giftigt ved oral indtagelse. Følg producentens anbefalinger ved udarbejdelsen, opbevaring og håndtering af cycloheximid. I tilfælde af utilsigtet eksponering, konsultere sikkerhedsdatablad leveres af producenten.
0,2 M natriumhydroxid Forbered i vand. Natriumhydroxid reagerer med glas. Derfor, for langtidsopbevaring, 0,2 M natriumhydroxid bør opretholdes i plastbeholdere.
Laemmli prøvebuffer 2% SDS, 10% glycerol, 5% &# 946; mercaptoethanol, 60 mM Tris-HCI pH 6,8, 0,008% bromphenolblåt 1. Laemmli prøvebuffer ofte fremstilles ved fortynding af et mere koncentreret (f.eks 5x) lager.
2. Farvestoffet bromphenolblåt kan tilsættes til ønskede intensitet. A "klemme" (meget lille mængde tappet fra kanten af ​​en spatel) er typisk tilstrækkelig.
Laemmli Running Buffer (5x) 125 mM Tris, 960 mM glycin, 0,5% SDS For at forberede 1 L 1x Laemmli Running Buffer, fortyndes 1: 5 i dH 2 O.
Tris Acetat-SDS Transfer Buffer (5x) 125 mM Tris-acetat (pH 8,8), 960 mM glycin, 0,05% SDS Til fremstilling 20 l 1x Tris Acetat-SDS Transfer Buffer, kombinere 4 l 5x materiel, 4 I methanol, og 12 L af dH 2 O.
10x Tris-saltvand (TBS) 500 mM Tris, 1,5 M NaCl; pH justeret til 7,5 For at forberede en liter 1x TBS, fortyndes 1:10 i dH 2 O. 1x TBS kan suppleres med detergent Tween-20 og skummetmælkspulver som passende.

Tabel 1. Opløsninger anvendt i denne undersøgelse.

Strain Navn Alias relevant Genotype Referencer
VJY42 MHY501 MATa Chen et al., 1993
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2-
VJY47 YWO55; MHY507 MATa Jungmann et al., 1993; Rubenstein et al. 2012
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2-
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105; MHY1364 MATa Biederer et al., 1997; Ravid et al., 2006
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2-
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MATa denne undersøgelse
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2-
hrd1Δ :: KanMX4

Tabel 2. gærstammer anvendt i denne undersøgelse. Alle stammer er kongene med MHY500 53. VJY42, VJY47, og VJY56 blev beskrevet tidligere 49,53,54. En detaljeret stamme generation og bekræftelse strategi for VJY172 (forberedt for denne undersøgelse) er til rådighed efter anmodning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette papir, er en fremgangsmåde til at analysere protein nedbrydningskinetik fremlagt. Denne teknik kan let påføres til en række proteiner nedbrydes af en række mekanismer. Det er vigtigt at bemærke, at cycloheximid chase rapporterer om nedbrydningskinetik af steady state pulje af et givet protein. Andre teknikker kan anvendes til at analysere nedbrydningskinetik specifikke populationer af proteiner. For eksempel kan nedbrydende skæbne nascente polypeptider spores af pulse chase analyse 55. I sådanne eksperimenter, nascente proteiner er kortvarigt puls-mærket (fx med radioaktive aminosyrer). Ændringer i overflod af de mærkede spirende proteiner (som måske eller måske ikke afspejler ændringer i steady state protein overflod) kan spores over tid.

Cycloheximid Jagten er egnet til analyse af protein stabilitet over et relativt kort tidsforløb (dvs. op til to timer). Over længere tid courses (dvs. to timer til dage), cycloheximid, en global inhibitor af oversættelse, er giftigt for cellerne, sandsynligvis på grund af nedbrydning af ubiquitin 56. Yderligere analyser af proteinstabilitet over længere tidsforløb er mere tilbøjelige til at blive bragt i fare ved indirekte virkninger af globalt svækket proteinsyntese på nedbrydningen af proteinet af interesse (f.eks nedbrydning af en kortvarig protein involveret i nedbrydningen af proteinet af interesse). Andre teknikker, såsom puls chase eksperimenter metabolisk mærkning, er derfor bedre egnet til undersøgelse af nedbrydningen af ​​langlivede proteiner og kan udføres for at bekræfte resultaterne opnået ved cycloheximid chase eksperimenter.

Timingen af ​​tilsætning af cycloheximid og samling af celler er en vigtig overvejelse i denne procedure. Præcision er især vigtigt i analysen af ​​meget kortlivede proteiner, som små afvigelser i den forløbne tid fra cycloheximid suppletion til celle høst kan have en betydelig indvirkning på tilsyneladende nedbrydningskinetik. Endvidere uden en klar plan for gennemførelsen af ​​disse tidsfølsomme trin, et eksperiment kan hurtigt udvikle sig til kaos og frustration. Af denne grund anbefales det at tilføje cycloheximid til kulturer med planlagte, regelmæssige intervaller. 30-sec intervaller er foreslået i denne protokol, men timingen kan justeres til at matche komfort og fingerfærdighed af investigator. Novice efterforskere kan finde det nyttigt at skrive en tidsplan af prøvetagningsrør gange før påbegyndelse eksperimentet og at krydse off hver planlagte samling som det forekommer.

I trin 1.7 og 1.8 i protokollen beskrevet her, er gær cellekulturer koncentreret i reducerede mængder af vækstmedium for at lette manipulation under den efterfølgende cycloheximid chase procedure. Men centrifugering af gærceller inducerer hurtigt visse cellulære stress reaktioner (f.eks signalveje, somaktiveres af glucose deprivation) 57,58. Efterforskere er derfor advarede mod længere perioder centrifugering. Ved analyse af stabiliteten af ​​proteiner, der kan være følsomme over for centrifugering kan undersøgere ønsker at tilføje cycloheximid direkte til midten af ​​logaritmisk fase kulturer uden forudgående centrifugering. I sådanne tilfælde bør cycloheximid sættes til samme slutkoncentration (250 ug / ml), og gær celleprøver kan høstes ved metoder, der ikke kræver en indledende centrifugeringstrin (f.eks hurtig filtrering) 57. Endvidere i trin 2.3 - 2,5, prøver indsamlet ved hvert tidspunkt overføres til en opløsning indeholdende natriumazid og anbragt på is. Disse betingelser hæmmer fortsat proteinnedbrydning for varigheden af ​​jagten. Det skal bemærkes, at azid reducerer cellulære koncentration af ATP 59, hvorved specifikt at inhibere aktiviteten af ATP-afhængige proteaser. Mens reduceret temperatur skal enLSO reducere den hastighed, hvormed ikke-ATP-afhængige proteolytiske processer funktion, kan efterforskerne studerer proteiner nedbrydes af sådanne mekanismer alternativt vælge at snap-freeze cellepellets i flydende nitrogen som hver prøve høstes.

En prøve protokol for celle lysis og en repræsentant protokol for western blotting inkluderet i dette manuskript er blevet tilpasset fra tidligere rapporter 16,40. I den post-alkalisk lyse beskrevet her, NaOH forbehandling forbedrer ekstraktion af gærproteiner efter efterfølgende tilsætning af Laemmli-prøvepuffer. Den mekanisme, hvormed denne forbedring sker er dårligt karakteriseret 40. Imidlertid er polysaccharider, såsom dem der findes i gær cellevægge opløseliggjort i alkali betingelser 60. Det er således fristende at spekulere, at inkubering i nærvær af NaOH delvist eller fuldstændigt sfæroplaster gærceller (dvs. fjerner cellevægkomponenter), hvilket gør dem mere Sensitive til SDS detergent til stede i Laemmli-prøvebuffer. Fordi proteiner er frigivet under stærkt denaturerende betingelser, behøver proteasehæmmere ikke medtages i Laemmli prøvebuffer. Den specifikke metode til cellelyse kan modificeres som passende for en given eksperiment. For eksempel kan den post-alkalisk lyse-metoden ikke være egnet til lav tæthed proteiner eller proteiner, der er dårligt påvises ved western blot. I sådanne tilfælde, metoder, der inkluderer en trichloreddikesyre nedbør skridt at koncentrere protein prøver kan være mest hensigtsmæssigt 61. Desuden flere vigtige overvejelser vedrørende udvælgelse af antistoffer, lastning kontrol valg, og alternative midler til påvisning (f.eks kemiluminescerende western blotting hjælp film eller digital billeddannelse) er for nylig blevet drøftet 16. Kvantificering af protein overflod følgende cycloheximid behandling kan udføres. Mange billeddannende systemer sælges med softwarepakker, der letterdenne analyse.

Cycloheximid chase kan implementeres til at analysere nedbrydningen af ​​en række gærproteiner og kan tilpasses til at studere protein stabilitet i andre eukaryote celler. Som beskrevet i denne protokol, er cycloheximid behandling efterfulgt af cellelysis og påvisning af protein overflod ved Western blot analyse. Afhængig af anvendelsen, men protein overflod efter cycloheximid behandling kan vurderes ved en række teknikker, som er relevant for forskning mål. For eksempel, hvis protein størrelse er ikke en relevant faktor for analyse, cellelysater kan underkastes dot blot eller enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) analyse, der rapporterer om protein overflod, men ikke tilsyneladende molekylvægt 62. For proteiner på celleoverfladen (eller intern fluorescens-mærkede interne proteiner), flowcytometri kan anvendes til at kvantificere protein overflod af prøver på forskellige tidspunkter efter cycloheximid tilsætning 51. Fluorescence mikroskopi efter cycloheximid behandling ville give oplysninger om både protein overflod og lokalisering 18. Rækken af ​​substrater, organismer, og downstream-applikationer kan underkastes cycloheximid chase gør teknikken en yderst alsidige og informative midler til at studere protein nedbrydning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Tags

Biochemistry , Knopskydende gær mutanter endoplasmatisk reticulum-associeret nedbrydning proteinnedbrydning cycloheximid chase translocon ubiquitin-proteasom systemet
Cycloheximid Chase Analyse af proteinnedbrydning i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E.,… More

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter