Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

Protein bolluğu Yönetmelik hemen hemen her hücresel süreç için çok önemlidir. Protein bolluk protein sentezi ve protein yıkımı oranları entegrasyonunu yansıtmaktadır. Protein bolluk raporlama birçok tahliller, protein düzeyleri çeviri ve proteoliz göreli etkilerinin ayrımcılığa izin vermez (örneğin, tek zamanlı noktası batı lekeleme, sitometri floresan mikroskobu veya büyüme-temelli muhabir deneyleri akış). Bu makalede, özellikle model, tek hücreli ökaryot protein parçalanmasını analiz etmek batı blot takip sikloheksimid kovalamacanın kullanımını, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) açıklar. Bu prosedürde, maya hücreleri translasyonel önleyicisi sikloheksimid mevcudiyetinde inkübe edilir. Hücrelerin alikotlan sonra siklohekzimid eklenerek, aşağıdaki özel zaman noktalarında hemen toplanır. Hücreler lizlenir ve lisatlar fo poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılırHer bir zaman noktasında, protein bolluğu Western blot analizini r. sikloheksimid Chase prosedürü hücresel proteinlerin çeşitli sabit durum nüfusun degradasyon kinetiğinin görselleştirme izin verir. Prosedür protein yıkımı üzerinde genetik gereksinimleri ve çevresel etkileri araştırmak için kullanılabilir.

Introduction

Proteinler hemen her hücresel süreçte önemli işlevleri yerine getirir. Pek çok fizyolojik işlem zaman ya da belirli koşullar altında, belirli bir süre için belirli bir protein (ya da proteinlerin) varlığını gerektirir. Organizmalar nedenle izlemek ve hücresel ihtiyaçlarını karşılamak 1 protein bolluğu düzenler. Örneğin, siklinler (hücre bölünmesini kontrol eden proteinler), hücre döngüsünün belirli aşamalarında mevcut olduğu ve düzenlenmiş siklin seviyelerinin kaybı habis tümör oluşumu 2 ile ilişkili olmuştur. Hücresel ihtiyaçlarını karşılamak için, protein düzeylerinin düzenlemenin yanı sıra hücreler, yanlış katlanmış, birleştirilmemiş ya da başka anormal bir protein moleküllerini 3 ortadan kaldırmak için bozundurucu bir kalite kontrol mekanizmaları kullanır. protein oranından kontrol makromoleküler sentezinin (kopya ve çeviri) ve bozulmaya (RNA çürüğü ve proteoliz) hem düzenlenmesini içerir. Bozulmuş veya aşırı protein yıkımı birden patolojilerin katkıdaKanser, sistik fibroz, nörodejeneratif koşullar, ve kalp-damar bozuklukları 4-8 dahildir. Proteolitik mekanizmaları nedenle hastalıkların 9-12 aralığı için gelecek vaat eden terapötik hedeflerini temsil eder.

Tek bir zaman noktasında proteinlerin analizi sentezi veya bozulma göreli katkılarını vermeden kararlı durum proteini bolluğu anlık görüntüsünü sağlar (örneğin, western blot 13 ​​tarafından, sitometri 14 veya floresan mikroskobu 15 akış). Benzer bir şekilde, büyüme göre raportör testleri sentez ve degradasyon 15-20 etkilerini ayırt olmadan uzun bir süre boyunca sabit durum protein seviyesini göstermektedir. Daha önce bolluk karşılaştırarak ve farmakolojik prote inaktive ederek, örneğin parçalayıcı mekanizmasının (belirli bileşenlerini inhibe sonra kararlı durum protein düzeyleri parçalayıcı süreçlerin katkısını anlaması mümkünasome 21 veya varsayılmış bir gen nakavt bozulması 13) için gerekli olduğu. Parçalayıcı yolları inhibe sonra kararlı durum protein düzeylerinde bir değişiklik protein bolluğu 13 kontrolüne proteoliz katkısı için güçlü kanıtlar sağlar. Ancak, bu tür bir analiz de protein döngüsü kinetiği ilişkin bilgi sağlamaz. Batı blot takip Siklohekzimid kovalamaca araştırmacılar zaman 22-24 üzerinde protein parçalanmasını görselleştirmek için izin vererek bu zayıflıkları üstesinden gelir. Sikloheksimid Chase, aşağıdaki protein saptama, batı lekeleme, radyoaktif izotoplar ve uzun immünopresipitasyon aşamalarla gerçekleştirilir, çünkü daha fazla, aynı zamanda protein degradasyonunu 25 görselleştirmek için gerçekleştirilen çok sayıda yaygın olarak kullanılan darbe takip teknikleri, farklı olarak, sikloheksimid Chase gerekli değildir.

Sikloheksimit birinci anti-mantar, uygun olan bir bileşik olarak tanımlanmıştır26,27 griseus gram-pozitif bakteri Streptomyces tarafından üretilen kravatlar. Özellikle ribozomal translokasyonu 28-31 bozarak ökaryot sitozolik (ama organel değil) çeviri inhibe eden hücre geçirgen bir moleküldür. Bir sikloheksimid Chase deneyde, sikloheksimid hücrelere ilave edilir ve hücre numuneleri, hemen ve bileşik 22 ilave edildikten sonra belirli zaman noktalarında alınır. Hücreler lizlenir ve her zaman noktasında bir protein bolluğu tipik western blot ile analiz edilmiştir. güvenle protein yıkımı atfedilebilir siklohekzimid eklenerek, aşağıdaki proteini bolluğu azaltır. nispeten istikrarlı bir protein bolca az değişiklik gösterecektir sırasında bir kararsız protein, zamanla bolca azalacaktır.

seçici protein yıkımı mekanizmaları son derece ökaryotlarının boyunca muhafaza edilmiştir. protein yıkımı hakkında bilinen çok ne ilk öğrenildiModel tek hücreli ökaryot, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) 25,32-36. maya ile yapılan çalışmalar protein yıkımı içine yeni ve önemli bilgiler sunmaya devam etmek olasıdır. protein oranından Western blot analizi ile, ardından maya hücrelerinde sikloheksimid Chase bir yöntem sunulmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Maya hücrelerinin 1. Büyüme ve Hasat

  1. Bir endojen maya protein degradasyon kinetiği analiz değilse, ilgili proteini kodlayan bir plazmid ile arzu edilen maya suşu (ler) dönüşümü. Maya transformasyonu için güvenilir yöntemler, daha önce 37 tarif edilmiştir.
  2. Uygun bir ortamda 5 ml maya inoküle (örneğin, dönüştürülmüş hücreler ya da dönüştürülmemiş hücreler için seçici olmayan bir maya ekstresi-pepton dekstroz (YPD) orta plasmid bakımı için Seçici Sentetik tanımlanan (SD) ortamı). döner, 30 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
    Not: 30 ° C, tipik vahşi tip laboratuar maya kökleri 38 için en uygun bir büyüme sıcaklığıdır. Mutant maya cinsleri, 30 ° C 'de en iyi şekilde büyümez ve bazı proteinler sıcaklığa bağlı bozunmaya maruz Ancak, maya hücresi büyümesi ve sikloheksimid Chase için kullanılan sıcaklıklar deneysel 39 tespit edilmelidir.
  3. th ölçünHer gecede kültür, 600 nm (OD 600) e optik yoğunluk.
    Not: Hücreler logaritmik ya da sabit büyüme fazında olabilir, fakat minimal = OD 600 seyreltme izin 0.2 ml taze ortam 15 bir yoğunluğa ulaştığı olmalıdır.
  4. Taze ortam 0.2 15 ml'lik bir OD 600 değerine gece boyunca kültürler ile seyreltilir.
  5. Hücreler, orta-logaritmik büyüme fazı ulaşana kadar çalkalanarak 30 ° C'de inkübe edin maya (örneğin, OD 0.8 ve 1.2 arasında, 600).
  6. maya hücre büyümesi sırasında, sikloheksimid kovalamaca prosedürü için hazırlık aşağıdakileri gerçekleştirin:
    1. sikloheksimid mevcudiyetinde hücre inkübasyon için 30 ° C, 15 ml konik tüpü bir ısıtma bloğu ayarlayın. kültürlere verimli ısı dağılımını sağlamak için ısı bloğu çukurlarına su eklenir. 15 ml konik tüp, su seviyesi taşma yükselecek, ancak iyi bir dudak neden olacağını her kuyu gibi su ekleyin.
    2. hücre lisizini takiben protein denatürasyonu 95 ° C'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ikinci bir ısıtma bloğu ayarlayın.
    3. Ön sıcak taze büyüme ortamı, 30 ° C (analiz edilecek kültür başına zaman noktası başına 1.1 mi).
    4. 50 ul 20x Durdurma Mix ekle (kültür başına bir tüp zaman başına nokta denenecek) mikrosantrifüj tüpleri önceden etiketlenmiş. buz üzerinde tüpler yerleştirin.
      DİKKAT: sodyum azid, 20x Durdurma Karışım bir madde, oral yoldan ya da deri teması ile toksiktir. Hazırlanması, saklanması ve sodyum azit tutarken üretici tavsiyelerine uyun. Kazara maruz kalma durumunda, üretici tarafından sağlanan malzeme güvenlik bilgi formunu danışın.
  7. Hücreler, orta-logaritmik büyüme ulaştığı zaman, her zaman noktasında her kültür 2.5 OD 600 birim toplamak (örneğin, 7,5 OD 600 tane üç zaman noktasında protein bolluğu analiz etmek için) tahlil edilecek. Santrifüj Eğer 3,0, 15 ml konik tüplerde hücreler toplanmış2 dakika boyunca oda sıcaklığında 00 xg.
    NOT: Bir OD 600 ünite OD 1.0 600, 1 ml kültüre mevcut maya miktarına eşittir. V = x OD 600 birim / OD 600 ölçüm süresi: X, OD 600 birim (V) hasat için gereken kültür (ml) hacmi, aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenebilir. Örneğin, bir OD 1.0 600 maya hücresi kültürü 7.5 OD 600 birim hasat 7.5 OD 600 birim / 1.0 = 7.5 ml maya kültürü toplamak.
  8. 30 ° C (7.5 OD 600 birim örneğin, 3 ml), hücrelerin 2.5 OD 600 birimi başına (önceden ısıtılmış), taze büyüme ortamı, 1 ml her bir hücre pelletini.

2. Siklohekzimid Chase

  1. 30 ° C ısı bloğu 5 dakika boyunca kuluçkalama ile maya hücre süspansiyonları dengelenmesi.
  2. 0:00 kadar saymak için bir zamanlayıcı hazırlayın.
  3. zamanlayıcı sikloheksimid kovalamaca, basın "Başlat" başlayacak. hızla,ama dikkatle, aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
    1. İlk maya hücre süspansiyonuna, 250 ug / ml'lik bir son konsantrasyona kadar sikloheksimid ekleme (örneğin, hücre süspansiyonu, 3 ml, 20 mg / ml siklohegzimid stokunun 37.5 ul), ve vorteks kısa bir süre karıştırmak.
      DİKKAT: Siklohekzimid dermal tahriş ve ağız yoluyla ilaç yoluyla toksiktir. Hazırlanması, saklanması ve Siklohekzimidsiz işlerken üretici tavsiyelerine uyun. Kazara maruz kalma durumunda, üretici tarafından sağlanan malzeme güvenlik bilgi formunu danışın.
    2. Hemen sikloheksimid ve vorteks ilave edildikten sonra, 50 ul buz soğukluğunda 20x durdurma karışımı ihtiva eden bir ön-etiketli mikrosantrifüj tüpüne eklenmiştir sikloheksimid maya hücre süspansiyonu 950 ul (~ 2.4 OD 600 birim) aktarın. Tüm örnekler toplanmıştır kadar buz üzerinde ependorf tüp, ve yer Vortex.
    3. 30 ° C'ye kadar maya hücre süspansiyonu geri dönün.
  4. Adımları tekrarlayın 2.3 ile 2.3.1.3 Düzenli zaman aralıklarında (kalan maya hücresi süspansiyonları her biri için, örneğin, sikloheksimid ilave edilir, öyle ki, her 30 saniye, 1:00 de, 0:30 de, 0:00 de örnek # 3 Örnek 2. 1. Numune vb.).
  5. sonraki her zaman noktasında 50 ul önceden soğutulmuş 20x Durdurma Mix ihtiva eden etiketli mikrosantrifüj tüplerine vorteks maya hücresi süspansiyonları ve transfer 950 ul. Vortex ve buz üzerinde yer hücreler toplandı. 30 ° C ısı bloğu 15 ml konik tüpler dönün.
    1. Örneğin, 30 dakika sikloheksimid ilave edildikten sonra hücrelerin toplanması için, girdap (zamanla başlangıcında, maya hücre süspansiyonlarına sikloheksimid ilave arasında 30 saniyelik aralıklarla varsayarak) ve 30:00 de örnek # 1 hücre süspansiyonu 950 ul çıkarın . böylece 30:30 de örnek # 2 için tekrarlayın ve.
      Not: Chase süresince konik tüp yaklaşık 5 dakika 15 ml maya, girdap hücre süspansiyonları oturmasını önlemek için. Alternatif olarak, maya hücre süspansiyonus sikloheksimid takip deney süresince sürekli olarak ajite su banyosu içinde muhafaza edilebilir.
  6. Tüm numuneler toplanmıştır sonra, pelet 30 saniye boyunca oda sıcaklığında 6500 x g'de santrifüj ile hücreler toplandı. pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. Hücreler artık alkali lizis için hazır. Seçenek olarak ise, ek bileşen dondurularak sıvı azot ve mağaza pelet hücreleri -80 ° C'de ilave edildi.

3. Post-alkali Protein Ekstraksiyonu (16,40 den Modifiye)

  1. Her hücre pelletine damıtılmış suyun 100 ul ekle. Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks tarafından süspanse edin.
  2. Her bir örnek için 0.2 M NaOH, 100 ul ekle. yukarı pipetleme ve aşağı ya da vorteks karıştırın.
  3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında süspansiye edilmiş hücreler inkübe edin. Bu aşamada, maya hücreleri lize edilmemiştir ve proteinler 40 serbest edilmemiştir.
  4. Oda öfke 18.000 xg santrifüj Pelet hücreleri30 sn için çalıçtırdıgınızda. pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı.
  5. , Hücreler lize edildi Her hücre pelletine Laemmli numune tampon 100 ul ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks tarafından süspanse edin.
    Not: Tris-glisin çalışan tamponu sistemi kullanılarak sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile uyumlu bir biçimde NaOH ve Laemmli numune tamponu bültenleri proteinleri ile hücrelerin ardışık inkübasyon.
  6. 5 dakika tam proteinleri denatüre etmek için 95 ° C'de inkübe edin.
    Not: 95 ° C'de inkübasyon toplama eğilimli proteinlerin analizi için uygun değildir (örneğin, çeşitli transmembran segmentlerle proteinleri). Yüksek sıcaklıklarda 41 ° C'de inkübe bu proteinler çözünmez hale gelebilir. Bu nedenle, bu tür proteinlerin analizinde, lizatlar daha düşük sıcaklıklarda inkübe edilmelidir (örneğin, 37 ° C - 70 ° C) 10 - 30 dakika, hem deneysel olarak belirlenebilir.
  7. ro 18.000 xg'de santrifüj lizatları1 dakika için OM sıcaklığı çözünmeyen malzeme peletlendi. Süpernatan (çözünebilir ekstre protein), SDS-PAGE ve ardından Western blot analizi ile ayrılması için hazır hale gelir. Alternatif olarak, -20 ° C'de mağaza lizatları.

4. Temsilcisi SDS-PAGE ve Western Blot Prosedürü (16 uyarlanmıştır)

  1. Yük proteini moleküler ağırlık standartları ve bir SDS-PAGE jeli üzerine lizatları ampirik bir biçimde tespit hacmi.
    Not: ilgilenilen proteinin moleküler ağırlığı bazında SDS-PAGE jeli akrilamid ve bis-akrilamid yüzdesini seçin. Genel olarak, düşük bir yüzde jeller yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin çözülmesi için daha uygundur.
  2. boya ön kadar 200 V çalıştırmak jel jel alt kenarı ulaşmıştır.
  3. 4 ° C'de 90 dakika - 60 20 V ıslak transferi poliviniliden florit (PVDF) membrana jel proteinleri aktarın.
  4. (TBC Tris tamponlu tuz içinde kuluçkalanmasıyla zar blokeS),% 5 kaymağı alınmış süt içeren, 1 saat boyunca veya bütün gece 4 ° C'de, oda sıcaklığında, sallanan.
    Not: gece boyunca inkübe bir membran mevcudiyetinde mikrobiyal büyümeyi önlemek için,% 0.02 nihai bir konsantrasyonda bloke çözeltisi içinde sodyum azit dahil edilmesi önerilmektedir.
  5. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında,% 0.1 Tween-20 (TBS / T) ve% 1 yağsız süt, sallanan TBS daki protein için spesifik primer antikor ile membran inkübe edin.
  6. sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın.
  7. Sallanan 1 saat boyunca oda sıcaklığında% 1 yağsız süt ile TBS / T uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin.
    NOT: Flüoroforlar ışığa duyarlıdır. Bu nedenle, florofor konjüge antikor seyreltileri karanlıkta hazırlanmıştır ve membranların ışık geçirmeyen (ör, metal yaprak sarılı) co gerçekleşmelidir fluorophores ve daha sonra yıkama aşamasına konjuge antikor varlığında olmalıdırntainers.
  8. sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın.
  9. LI-COR Odyssey CLX ve üretici tavsiyelerine aşağıdaki Image Studio yazılımı (ya da benzer görüntüleme cihazları ve yazılım), kullanarak görüntü membran.
  10. Membran görüntü aldıktan sonra, sallama, 1 saat süre ile, oda sıcaklığında,% 1 yağsız süt ile TBS / T içinde bir yükleme kontrol proteini için spesifik bir primer antikor ile membran inkübe edin.
  11. sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın.
  12. Sallanan 1 saat boyunca oda sıcaklığında% 1 yağsız süt ile TBS / T uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin.
  13. sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın.
  14. Adım 4.9 gibi görüntü membran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sikloheksimid Chase yöntemi göstermek için, Deg1 -Sec62 stabilitesi (Şekil 1) bir model maya endoplazmik retikulum (ER) -associated bozulması (ERAD) alt-tabaka, 42-44 analiz edilmiştir. ERAD, kalite kontrol ubikuitin ligaz enzimleri kovalent ER zarında lokalize anormal proteinlerin küçük bir protein ubikitinin zincirlerini takın. Böyle polyubiquitylated proteinler daha sonra ER kaldırılır ve proteazom, büyük, sitozolik proteaz 45 tarafından yıkılırlar. Israrla ve anormal translokon ER lümenine veya zar 43 içine protein translokasyonu kolaylaştıran bir kanal yürütmektedir sonra Deg1 -Sec62 protein yıkımı için hedeflenmiştir. Benzer bir şekilde, memeli, apolipoprotein B, düşük yoğunluklu lipoproteinlerin bir protein bileşeni, sürekli ER translokon geçer ve daha sonra zaman onun dudak ilgili bir mekanizma ile bozulmaya uğrarid bağlayıcı ortaklar 46-48 yoktur. (Translokon ilişkili için) 43 alt tabakalar Böylece, ısrarla ya da anormal translokon meşgul proteinlerin bozulması içgörü verebilir maya hücrelerinde Deg1 -Sec62 bozulma analizleri, geçici ERAD-T olarak adlandırılan.

Daha önceki çalışmalar, ubikitin-konjüge enzimi Ubc7 ER yerleşik ubikuitin ligaz Hrd1 fonksiyonları Deg1 -Sec62 16,42-44 bozunmasını katalize etmek üzere olduğunu göstermiştir. Transmembran proteini Cue1 ER zarı Ubc7 çapa ve enzim 49-51 harekete geçirir. Bununla birlikte, Deg1 -Sec62 parçalanmasında Cue1 için bir gereklilik doğrudan araştırılmamıştır. Cue1, Hrd1 ve Ubc7 gibi Deg1 -Sec62 etkin parçalanması için gerekli olduğu hipotezini test etmek için, Deg1 -Sec62 ifade vahşi tip ve mutant maya hücreleri sikloheksimid Chase ve Wes'e tabi tutulmuşturtern blot analizi (Şekil 2A). Deg1 -Sec62 proteini çok türlü SDS-PAGE üzerinde hareket eder. Bu protein 43,44,52 geniş translasyon sonrası modifikasyonu gösteren daha önceki çalışmalar ile uyum içindedir. Yabani tip maya hücrelerinde, Deg1 -Sec62 kolaylıkla ayrışırlar oldu. Daha önce görüldüğü gibi, Hrd1 ya Ubc7 ya kaybı büyük ölçüde Deg1 -Sec62 protein 42-44 stabilize. Tahmin edildiği gibi, Deg1 -Sec62 ERAD-T içinde Ubc7 etkileşen proteini için bir rol teyit (Ubc7 yokluğunda benzer bir ölçüde) Cue1 yokluğunda stabilize edildi.

Her bir zaman noktasında kalan Deg1 -Sec62 protein oranı ölçülür ve Şekil 2B 'de çizilmiştir. Vahşi tip hücrelerde Deg1 -Sec62 kaybolması belirgin oranı olgunlaşmamış Deg1 -Sec62 degradasyon oranının bir az değer olabilir dikkat(Yani, en doğrudan darbe takip analizi 43 belirlenebilir proteinin yarılanma ömrü). Yabani tip maya aktif sikloheksimid ilavesinden önce Deg1 -Sec62 proteinini degrade için, Deg1 -Sec62 kararlı durum çokluğu esas olarak (bozunma bozulmuş olduğu hücrelere kıyasla) bu hücrelerde azaltılır. Bu Şekil 2A, her bir suş için ilk zaman noktalarında Deg1 -Sec62 bolluğu karşılaştırılarak takdir edilebilir. (Protein yıkımı önlenir olan hücre içi havuzlarında sahip olursa, örneğin) Bundan başka, alt-tabaka proteini 'nin degradasyon dayanıklı alt popülasyonu deney süresi boyunca vahşi tür hücrelerinde nispeten kararlı görünebilir.

Şekil 1
Deg1 ve Bozulması Şekil 1. Model -Sec62 Translokon anormal Etkileşim (A) Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 sırayla, aşağıdaki elemanlardan oluşur şematik olarak gösterilmesi, aşağıdaki.:. Deg1 (maya transkripsiyon bastırıcı MATα2 amino-terminal 67 amino asit), bir bayrak (F) epitopunun, 2-transmembran proteini Sec62 ve endoplazmik retikulum (ER) zarına iki transmembran segmentlerinin normal ko-translasyonel ekleme sonrasında Staphylococcus aureus protein A (PRA). (B), iki adet kalıcı ilişki translokon ile Deg1 -Sec62 anormal, Deg1 bağımlı, post-translasyonel translokon nişan tetikler. Sitosolik amino ucunda bir bölümü anormal içi translokon kalır olasılıkla girer-ve. (C) translokon bağlanmasını takiben, Hrd1 ubikuitin ligaz Deg1 -Sec62 ubiquitylates. Hrd1 ubikuitin konjuge enzim U tarafından desteklenmektedirCue1 ER zar içinde yerine sabitlenmiş bc7. Ub, ubikitin protein monomerler. (D) Ubiquitylated Deg1 -Sec62 ER zarında çıkarılır ve translokon tıkanıklığı giderici, proteazom tarafından bozulmuş. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Western Blot ardından Şekil 2. Siklohekzimid Chase Cue1 Verimli Deg1 -Sec62 Bozulması İçin Gerekli olduğunu gösterir. Belirtilen genotipleri (A) Maya hücreleri, bir maya sentromerik plazmid kodlayan Deg1 -Sec62 ile transforme edildi (pRS416-P MET25 - Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) ve sikloheksimid takip analizine tabi tutulmuştur. Protein(0.125 OD 600 ünitesine denk) içerebilir, her bir zaman noktasında S% 8 SDS-PAGE jeli üzerinde ayrılır ve Batı doğrudan Deg1 C-terminal protein A epitoplarını bağlayan tavşan anti-fare ikincil antikorlar ile lekeleme ile tespit edildi - Sec62 füzyon proteini. Bir yükleme kontrolü olarak, membran daha sonra PGK1 özgü antikorlar ile inkübe edildi. Bu deney üç kez çoğaltılmış edilmiştir; temsilcisi sonuçları resmedilmiştir. veri (B) Kantitasyonu (A) görüntüleme yazılımı (Malzeme Tabloya bakınız) kullanılarak gerçekleştirildi. Deg1 -Sec62 proteinini kapsayan bir alan, toplam floresan yoğunluğu, her bir örnek için tespit edildi. Her numune için arka plan floresan yoğunluğu Deg1 -Sec62 proteininin yakın piksellerin ortalama floresan yoğunluğu yola çıkılarak edildi. Bu ekstrapolasyon plan flüoresan yoğunluğu ayarlı fluoresc vermek üzere, toplam floresan yoğunluğu çıkartılmıştırHer numune için ence şiddeti. Toplamda, arka plan ve düzeltilmiş floresan yoğunlukları için benzer sayımsal PGK1, kimin bolluk tahlil şartlarda değişmez bir yükleme kontrol proteini uygulandı. Örnekleri arasında Deg1 -Sec62 proteininin çokluğunun mukayese edilmesi için, PGK1 için Deg1 -Sec62 düzeltilmiş sinyal yoğunluklarının oranı, her bir örnek için tespit edildi. Deg1 -Sec62 / PGK1 oranı analiz edilen her bir suş için (örneğin, hemen sikloheksimid ilave edildikten sonra), ilk zaman noktası için% 100 olarak tanımlandı. (Deg1 -Sec62 / PGK1 oranları yani) ilk kez noktasında Deg1 -Sec62 / PGK1 oranının yüzdesi olarak hesaplanmıştır sonraki zaman noktalarında kalan Deg1 -Sec62 miktarı. Büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.

Sentetik Tanımlı (SD) Minimal Maya Orta % 2 dekstroz, amino asitler içermeyen% 0.67 maya azot baz,% 0.002 adenin,% 0.004 urasil,% 0.002 arginin,% 0.001 histidin,% 0.006 izolösin,% 0.006 leusin,% 0.004 lisin,% 0.001 metionin% 0.006 fenilalanin, 0.005 % treonin,% 0.004 triptofan. bir katı (plaka) ortam için,% 2 agar bulunmaktadır. 1. Seçici ortam uygun amino asit (ler) ya da azotlu bazlar çıkarılmasıyla hazırlanır.
aşağıda kolaylık sağlamak için 2, bu maddeler konsantre stok çözeltiler olarak muhafaza edilebilir. Amino asitler, tüm istenen amino asitleri ihtiva eden 100x stok çözeltisi olarak muhafaza edilebilir. Maya azot baz 20x stok çözeltisi (% 13.4) 'de muhafaza edilebilir. Dekstroz% 40 stok solüsyonunda muhafaza edilebilir. Adenin ve urasil 0.1 M NaOH içinde% 1 stok solüsyonları olarak sağlanabilir.
3..otoklav ile orta sterilize edin.
Maya Özü-pepton Dekstroz (YPD) Zengin maya Orta % 1 maya özütü,% 2 pepton,% 2 dekstroz (İsteğe bağlı:% 0.002 adenin). bir katı (plaka) ortam için,% 2 agar bulunmaktadır. 1. adenin yavaş büyüme ve özellikle laboratuar maya kökü kırmızı renk özelliği yokluğunda (ya da düşük bolluk) önlemek için, adenin YPD büyüme ortamına ilave edilebilir.
aşağıda kolaylık sağlamak için 2. bazı katkı maddeleri konsantre stok çözeltiler olarak muhafaza edilebilir. Dekstroz% 40 stok solüsyonunda muhafaza edilebilir. Adenin, 0.1 M NaOH içinde% 1 'lik stok çözeltisi olarak muhafaza edilebilir.
3. otoklav ile orta sterilize edin.
20x Dur Mix 200 mM sodyum azit, 5 mg / ml sığır serumu albümini Sodyum azid oral yoldan veya deri teması yoluyla toksiktir. üretici izleyinöneriler hazırlarken, saklarken ve sodyum azit tutarken. Kazara maruz kalma durumunda, üretici tarafından sağlanan malzeme güvenlik bilgi formunu danışın.
20 mg / ml Sikloheksimit 1. etanol içinde hazırlayın. -20 ° C'de saklayın.
2. Siklohekzimid bir dermal tahriş ve ağız yoluyla ilaç yoluyla toksiktir. Hazırlanması, saklanması ve Siklohekzimidsiz işlerken üretici tavsiyelerine uyun. Kazara maruz kalma durumunda, üretici tarafından sağlanan malzeme güvenlik bilgi formunu danışın.
0,2 M Sodyum hidroksit Suda hazırlayın. Sodyum hidroksit cam ile reaksiyona girer. Bu nedenle, uzun süreli depolama için, 0.2 M sodyum hidroksit plastik kaplarda muhafaza edilmelidir.
Laemmli numune tampon % 2 SDS,% 10 gliserol,% 5# 946; mersaptoetanol, 60 mM Tris HCI pH 6.8, mavi 0.008% bromofenol 1. Laemmli numune tampon genellikle daha konsantre (örneğin, 5x) stok seyreltilmesi ile hazırlanır.
2. Boya bromofenol mavi istenen yoğunluğuna ilave edilebilir. Bir "tutam" (bir spatula kenarından aday çok az miktarda), tipik olarak yeterlidir.
Laemmli Buffer Running (5x) 125 mM Tris, 960 mM glisin,% 0.5 SDS 1x Laemmli 1 L Tamponu Running hazırlamak için, 1 sulandırmak: 5 dH 2 O.
Tris asetat-SDS transfer tampon maddesi (5x) 125 mM Tris asetat (pH 8.8), 960 mM glisin,% 0.05 SDS , Buffer Transferi 1x Tris Asetat-SDS 20 L hazırlamak 5x stokunun 4 L, metanol 4 L, ve dH 2 O 12 L birleştirmek için
10x Tris tamponlu tuz (TBS) 500 mM Tris, 1.5 M NaCl; pH 7.5 değerine ayarlandı 1x TBS 1 L hazırlamak için, DH 2 O. 1:10 sulandırmak 1x TBS uygun deterjan Tween-20 ve toz haline getirilmiş kaymaksız süt ile takviye edilebilir.

Bu Çalışmada Kullanılan Tablo 1. Çözümler.

Gerilme Adı takma ad ilgili Genotip Kaynaklar
VJY42 MHY501 MATα Chen ve diğ., 1993
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY47 YWO55; MHY507 MATα Jungmann ve arkadaşları., 1993; Rubenstein ve ark. 2012
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105; MHY1364 MATα Biederer ve diğ., 1997; Ravid ve ark. 2006
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MATα Bu çalışma
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1Δ :: kanMX4

Bu Çalışmada Kullanılan Tablo 2. Maya suşlar. Tüm suşlar MHY500 53 ile congenic vardır. VJY42, VJY47 ve VJY56 önce 49,53,54 tanımlanmıştır. (Bu çalışma için hazırlanmış) VJY172 için ayrıntılı bir gerilme üretimi ve onay stratejisi istek üzerine mevcuttur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, protein yıkımı kinetik analiz etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu teknik hali hazırda çeşitli mekanizmalar ile bozulmuş proteinler, bir dizi uygulanabilir. Sikloheksimid kovalamaca deneyleri belirli bir proteinin kararlı durum havuzunun bozulma kinetiği rapor dikkat etmek önemlidir. Diğer teknikler proteinlerinin spesifik popülasyonlarının degradasyon kinetiğinin analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, doğmakta olan polipeptidlerin parçalayıcı kaderi darbe kovalamaca analizi 55 tarafından izlenebilir. Bu tür deneylerde, olgunlaşmamış proteinler kısa darbe etiketli (örneğin, radyoaktif amino asitler) 'dir. (Ya da kalıcı hal proteini bolca değişiklikleri ayna olmayabilir) etiketli doğmakta olan proteinlerin bolca değişiklikler zamanla takip edilebilir.

Sikloheksimit Chase (yani, en fazla iki saate kadar) nispeten kısa bir süre boyunca protein stabilitesini analiz için uygundur. uzun bir zaman c üzerindeourses (yani, iki gün saat), sikloheksimid, çeviri küresel bir önleyicisi, bağlı ubikitin 56 tükenmesi olasılığı, hücrelere toksiktir. Bundan başka, daha uzun sürelerle fazla protein stabilitesi analizleri ilgili proteinin (bozunması ile ilgili genel olarak bozulmuş protein sentezi dolaylı etkiler tarafından zayıflatılmadığı olması daha olasıdır, örneğin, proteinin parçalanması ile ilgili kısa süreli bir protein degradasyon faiz). Bu darbe kovalayıcı metabolik etiketleme deneyleri gibi diğer teknikler, bu nedenle daha uygun uzun ömürlü proteinlerin bozunmasıyla incelemek için geçerlidir, sikloheksimid takip deneylerinde elde edilen sonuçları doğrulamak için gerçekleştirilebilir.

Hücrelerin Sikloheksimit ve toplama ilave zamanlaması bu prosedürde önemli bir husustur. zaman içinde küçük sapmalar sikloheksimid addin itibaren geçen şekilde hassas, çok kısa yarı ömürlü proteinlerin analizinde özellikle önemlidirHücre hasat yon belirgin bozulma kinetiği üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Ayrıca, bu zamana duyarlı adımlar yürütmek için net bir plan olmadan, bir deney hızla kaos ve hayal kırıklığı içine devretmek olabilir. Bu nedenle, planlanan düzenli aralıklarla kültürlere siklohekzimid ilave edilmesi tavsiye edilmektedir. 30-saniye aralıklarla bu protokolü önerilmektedir, ancak zamanlama araştırmacının konfor düzeyi ve maharet maç için ayarlanabilir. Acemi araştırmacılar yararlı önce deney başlamadan numune toplama kez bir program yazmak için ve gerçekleşen her tarifeli koleksiyonunu geçmeye bulabilirsiniz.

Adım 1.7 ve burada tarif edilen protokol 1.8 maya hücresi kültürleri daha sonra sikloheksimid takip işlemi sırasında manipülasyon kolaylığı için büyüme ortamı, indirgenmiş hacim içinde konsantre edilmiştir. Bununla birlikte, maya hücrelerinin santrifüj hızlı bazı hücresel stresi tepkileri (örneğin, sinyal yolları uyardığınıglikoz yoksunluk) 57,58 tarafından aktive edilir. Müfettişler, bu nedenle santrifüj uzun süre karşı uyarılmaktadır. santrifüj duyarlı olabilir proteinlerin stabilitesini analiz ederken, araştırmacılar önceden santrifüj olmadan orta-log faz kültürler doğrudan CYCLOHEXIMIDE eklemek isteyebilirsiniz. Bu gibi durumlarda, sikloheksimid, aynı nihai konsantrasyonda (250 ug / ml) ilave edilmelidir, ve maya hücresi örnekleri bir ilk santrifüj adımı (örneğin, hızlı filtrasyon) 57 gerektirmeyen yöntemler ile hasat edilebilir. Bundan başka, adımda 2,3-2,5, her bir zaman noktasında alınan numuneler sodyum azit ihtiva eden bir çözeltiye aktarılır ve buz üzerine yerleştirilir. Bu koşullar kovalamaca süresince protein parçalanmasını devam inhibe. Azid, böylece spesifik olarak ATP-bağımlı proteaz aktivitesini inhibe etmek, ATP 59 hücre konsantrasyonu azalttığı dikkate alınmalıdır. Iken azaltılmış sıcaklık gereken birLSO, bu mekanizmalarıyla bozulmuş proteinler çalışan araştırmacılar, alternatif olarak her bir numune hasat olarak sıvı azot içinde hücre pelletleri donma ek tercih olabilir olmayan ATP-bağımlı proteolitik süreçler işlevi de azaltmaktadır.

Hücre lizizi ve bu yazıda yer alan batı blot için temsili bir protokol için örnek bir protokol önceki raporlarda 16,40 adapte edilmiştir. Burada açıklanan sonrası alkalin lisiz yöntemi olarak, NaOH ön-muamele Laemmli numune tamponu daha sonra ilave edildikten sonra, maya proteinleri çıkarılmasını arttırır. Bu iyileştirme meydana hangi mekanizma kötü 40 karakterizedir. Bununla birlikte, bu maya hücre duvarlarında bulunan gibi polisakaritler, alkali koşullar 60 eritilir. Nedenle onlara daha fazla Hassas hale (yani, hücre duvarı bileşenleri ortadan kaldırır), kısmen ya da tamamen maya hücreleri spheroplastlar NaOH varlığında inkübasyonun kurgulanabilirLaemmli numune tamponu içinde SDS deterjanın e. proteinler yüksek denatüre edici koşullar altında serbest olduğundan, proteaz inhibitörleri Laemmli numune tamponu içinde dahil edilmesi gerekmez. Hücre lizizi spesifik bir yöntem, belirli bir deney için uygun şekilde modifiye edilebilir. Örneğin, post-alkalin lisiz yöntemi zayıf western blot ile tespit edilir, düşük miktardaki protein ya da proteinleri için uygun olmayabilir. Bu gibi durumlarda, 61 en uygun yöntem olabilir protein örneklerinin konsantre bir trikloroasetik asit çökeltme aşamasını içerir yöntemlerde. Ayrıca, antikor seçimi konusunda birçok önemli hususlar, yükleme kontrol seçim ve algılama alternatif araçları (örneğin, film ya da dijital görüntüleme sistemleri kullanılarak kemilüminesan batı lekeleme) son zamanlarda 16 tartıştık. sikloheksimid tedavi sonrası protein bolluğu kantitasyonu yapılabilir. Birçok görüntüleme sistemleri kolaylaştıran yazılım paketleri ile satılmaktadırBu analiz.

Sikloheksimit takip maya proteinleri çeşitli bozulma analiz etmek için uygulanabilir ve diğer ökaryotik hücrelerde protein stabilitesini incelemek için uyarlanabilir. Bu protokolde tarif edildiği gibi, sikloheksimid tedavisi hücre lizizi ve Western blot analizi ile, protein bolluğu saptanması izlemektedir. Uygulamaya bağlı olarak, ancak, sikloheksimid tedaviden sonra, protein bolluğu araştırma amaçları için uygun olarak, bir dizi teknik ile değerlendirilebilir. Protein boyu analizi için uygun bir faktör ise, örneğin, hücre lizatları, protein bolluğu rapor nokta leke veya enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) analizlerine tabi tutuldu, ancak görünür molekül ağırlığı 62 olabilir. Hücre yüzeyi üzerinde proteinleri için, akış sitometrisi sikloheksimid ilave 51 sonrası farklı zamanlarda örneklerin protein bolluğu ölçmek için kullanılabilir (veya iç floresan iç etiketli proteinlerin). fluorescence mikroskopi aşağıdaki sikloheksimid tedavi protein bolluk ve lokalizasyon 18 hem de bilgi sağlayacaktır. yüzeylerde, organizmalar ve sikloheksimid kovalamaca mükellef aşağı uygulamalar aralığı tekniktir protein parçalanmasını okuyan bir çok yönlü ve bilgilendirici araçlar yapar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Tags

Biyokimya Sayı 110, Maya mutantlar endoplazmik retikulum ilişkili bozulması protein parçalanmasını sikloheksimid kovalamaca translokon ubikitin-proteazom sistemi tomurcuklanan
Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E.,… More

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter