Abstract
タンパク質存在量の調節は、事実上すべての細胞プロセスに不可欠です。タンパク質の存在量は、タンパク質合成およびタンパク質分解の速度の統合を反映しています。多くのタンパク質存在量に関するレポートアッセイ（ 例えば 、単一の時点ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、または増殖に基づくレポーターアッセイ）は、タンパク質レベルでの翻訳とタンパク質分解の相対的効果の差別を許しません。この記事では、具体的には、モデル単細胞真核生物、 サッカロマイセス・セレビシエ （出芽酵母）にタンパク質分解を分析するためのウェスタンブロッティングに続いてシクロヘキシミドチェイスの使用を記載しています。この手順では、酵母細胞は、翻訳阻害剤シクロヘキシミドの存在下でインキュベートされます。細胞のアリコートを後シクロヘキシミドの添加後の特定の時点ですぐに収集されます。細胞を溶解し、そして溶解物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離されるFO各時点でのタンパク質量のウェスタンブロット分析をrは。シクロヘキシミドチェイス手順は、種々の細胞タンパク質の定常状態の人口の分解動態の可視化を可能にします。手順は、タンパク質分解のための遺伝的要件および環境の影響を調査するために使用することができます。
Introduction
タンパク質は、事実上すべての細胞プロセスにおいて重要な機能を実行します。多くの生理学的プロセスは時間のまたは特定の状況下で定義された期間に特定のタンパク質（またはタンパク質）の存在を必要とします。生物は、したがって、監視および携帯ニーズ1を満たすために、タンパク質存在量を調節します。例えば、サイクリン（細胞分裂を調節するタンパク質）は、細胞周期の特定の相に存在し、規制サイクリンレベルの損失は、悪性腫瘍の形成2に関連しています。細胞のニーズを満たすためにタンパク質レベルを調節することに加えて、細胞は、誤って折り畳まれ、組み立てられていない、またはそうでなければ異常なタンパク質分子3を除去するために分解品質管理機構を採用します。タンパク質存在量の制御は、巨大分子の合成（転写および翻訳）および分解（RNAの崩壊とタンパク質分解）の両方の調節を伴います。障害または過剰なタンパク質分解は、複数の病理に貢献します、癌、嚢胞性線維症、神経変性疾患、および心血管障害4-8を含みます。タンパク質分解のメカニズムは、したがって、病気9-12の範囲のための有望な治療標的を表します。
単一時点でのタンパク質の分析は、（ 例えば 、ウェスタンブロットで13、フローサイトメトリー14、または蛍光顕微鏡15）の合成や分解の相対的な寄与を明らかにすることなく定常状態のタンパク質存在量のスナップショットを提供します。同様に、増殖に基づくレポーターアッセイは、合成および分解15~20の影響を区別することなく、長期間にわたる定常状態タンパク質レベルを反映します。前の存在量を比較することにより、薬理学的proteを不活性化することによって、例えば、分解機構（の特定の成分を阻害した後の定常状態タンパク質レベルの分解過程の寄与を推定することが可能ですasome 21または分解13に必要とされることが仮定遺伝子）をノックアウト。分解経路を阻害した後の定常状態のタンパク質レベルの変化は、タンパク質発現量13の制御にタンパク質分解の寄与のための強力な証拠を提供します。しかし、このような分析は、依然としてタンパク質代謝回転の動態に関する情報を提供していません。ウェスタンブロッティングに続いてシクロヘキシミドチェイスは、研究者は、時間22-24かけてタンパク質分解を視覚化することを可能にすることによって、これらの弱点を克服します。シクロヘキシミドチェイス以下のタンパク質の検出は、通常、ウエスタンブロット法、放射性同位体と長い免疫沈降ステップによって行われるためさらに、また、タンパク質分解25を可視化するために行われている多くの一般的に使用されるパルスチェイス技術とは異なり、シクロヘキシミドチェイスのために必要とされていません。
シクロヘキシミドは、最初の抗真菌適切有する化合物として同定されました26,27 グリセウスグラム陽性菌ストレプトミセスによって生成ネクタイ。これは、具体的には、リボソームの転位28-31を損なうことにより、真核生物の細胞質ゾル（しかしオルガネラない）翻訳を阻害する細胞透過性分子です。シクロヘキシミドチェイス実験において、シクロヘキシミドを細胞に添加し、細胞のアリコートを、化合物22の添加後すぐに、特定の時点で収集されます。細胞を溶解し、そして各時点でのタンパク質の存在量は、典型的には、ウェスタンブロットによって分析します。シクロヘキシミドの添加後のタンパク質存在量の減少は、自信を持って、タンパク質の分解に起因することができます。比較的安定したタンパク質が豊富でほとんど変化を示すであろうしながら、不安定なタンパク質は、時間をかけて豊富に減少します。
選択的なタンパク質分解のメカニズムは非常に真核生物を通じて保存されています。タンパク質分解について知られていることの多くは、最初に学習されましたモデル単細胞真核生物、 サッカロマイセス・セレビシエ （出芽酵母）25,32-36。酵母を用いた研究は、タンパク質分解に新規で重要な洞察を提供し続ける可能性が高いです。タンパク質量のウェスタンブロット分析を行った酵母細胞におけるシクロヘキシミド追跡するための方法がここに提示されています。
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Protocol
酵母細胞の1成長と収穫
- 内在性酵母タンパク質の分解速度を分析していない場合は、目的のタンパク質をコードするプラスミドを用いて、所望の酵母菌株（単数または複数）を変換します。酵母の形質転換のための信頼できる方法は、先37に記載されています。
- 適切な培地5mlに酵母を接種する（ 例えば、形質転換細胞または非形質転換細胞のための非選択的な酵母エキス-ペプトン-デキストロース（YPD）培地のプラスミド維持のための選択的な合成に定義（SD）培地）。回転、30℃で一晩インキュベートします。
注：30℃、典型的な野生型実験室酵母株38のための最適な成長温度です。しかし、にいくつかの変異体酵母株は30℃で最適に増殖しないので、いくつかのタンパク質は、温度依存性の分解を受ける、酵母細胞の増殖およびシクロヘキシミドチェイスに使用される温度は、経験的に39を決定すべきです。 - 目を測定します各一晩培養物の600nmで（OD 600）での電子光学密度。
注：細胞は、対数または定常増殖期にあってもよいが、最低限の新鮮な培地15mlにOD 600 = 0.2に希釈を可能にする密度に達している必要があります。 - 新鮮な培地の0.2〜15でミリリットルのOD 600値に一晩培養を希釈します。
- 細胞が中期対数増殖期（ すなわち 、0.8と1.2の間のOD 600）に達するまで振とう、30℃で酵母を培養します。
- 酵母細胞成長の間、シクロヘキシミドチェイス手順の準備のために次の手順を実行します。
- シクロヘキシミドの存在下での細胞のインキュベーションを30℃に15ミリリットルを円錐管を収容することができヒートブロックを設定します。文化への効率的な熱分布を可能にするために、ヒートブロックのウェルに水を追加します。 15ミリリットルコニカルチューブは、水位がオーバーフローに上昇するが、しないように十分の唇を引き起こすであろうことを、各ウェルなどに水を追加します。。
- 細胞溶解後のタンパク質の変性、95℃、1.5 mlマイクロチューブを収容可能な第2ヒートブロックを設定します。
- プリ暖かい新鮮な増殖培地（培養あたりの時点当たり1.1ミリリットルをアッセイする）30℃です。
- 50μlの20倍ストップ・ミックスを追加するために予め標識マイクロ遠心チューブ（分析対象の培養当たりの時間点につき1チューブ）。氷の上にチューブを入れます。
注意：アジ化ナトリウム、20倍ストップミックス中の成分は、経口摂取または皮膚接触を介して、有毒です。 、準備、保存、およびアジ化ナトリウムを取り扱う際、メーカーの推奨事項に従ってください。偶発的曝露の場合には、メーカーが提供する製品安全データシートを参照してください。
- 細胞が中期対数増殖に達したときに、（3つの時点でのタンパク質発現量を解析するために、例えば 、7.5 OD 600単位）アッセイされるべき時点ごとに各培養物の2.5 OD 600単位を収集します。遠心分離機は3,0で15ミリリットルコニカルチューブに細胞を収集しました2分間、室温で00 XG。
注：One OD 600単位はOD 1.0の600で1ミリリットルの培養物中に存在する酵母の量に等しいです。 V = X OD 600単位/ OD 600の測定：X OD 600単位（V）を回収するのに必要な培養液（ml単位）の量は、以下の式を用いて決定することができます。例えば、OD 1.0の600で酵母細胞培養の7.5 OD 600単位を収穫7.5 OD 600単位/ 1.0 = 7.5ミリリットル酵母培養物を収集します。 - 30の1ミリリットル°C（予め温めておいた）細胞の2.5 OD 600ユニット（ 例えば 、7.5 OD 600ユニットの3ミリリットル）あたりの新鮮な増殖培地中で再懸濁し、各細胞ペレット。
2.シクロヘキシミドチェイス
- 30℃のヒートブロックで5分間インキュベートすることによって、酵母細胞懸濁液を平衡化します。
- 午後12時からカウントアップするタイマーを準備します。
- シクロヘキシミドチェイスを開始するには、Enterキーを押して、タイマーに「スタート」。素早く、しかし、慎重に、次の手順を実行します。
- 最初の酵母細胞懸濁液に250μgの/ mlの最終濃度になるようにシクロヘキシミドを追加します（ 例えば、細胞懸濁液の3ミリリットルに20ミリグラム/ mlのシクロヘキシミド株式の37.5μlを添加）、および渦が簡単にミックスします。
注意：シクロヘキシミドは、皮膚刺激性であり、経口摂取を介して、有毒です。 、準備、保存、およびシクロヘキシミドを取り扱う際、メーカーの推奨事項に従ってください。偶発的曝露の場合には、メーカーが提供する製品安全データシートを参照してください。 - すぐにシクロヘキシミドとボルテックスを追加した後、50μlの氷冷20倍ストップミックスを含む前標識されたマイクロ遠心チューブに加え、シクロヘキシミドで酵母細胞懸濁液の950μlの（〜2.4 OD 600ユニット）を転送します。全てのサンプルが収集されるまで氷上にマイクロ遠心管、および場所をボルテックス。
- 30℃に酵母細胞懸濁液を返します。
- 最初の酵母細胞懸濁液に250μgの/ mlの最終濃度になるようにシクロヘキシミドを追加します（ 例えば、細胞懸濁液の3ミリリットルに20ミリグラム/ mlのシクロヘキシミド株式の37.5μlを添加）、および渦が簡単にミックスします。
- 手順を繰り返し2.3を通じて2.3.1午前一時で一定時間間隔（ 例えば、シクロヘキシミドは0時30分で、午後12時で、サンプル＃2を＃1をサンプルに添加されるように30秒ごとに、サンプル＃3で、残りの酵母細胞懸濁液のそれぞれについて0.3 等 。）。
- その後の各時点で、渦酵母細胞懸濁液と50μlの予冷した20倍ストップ・ミックスを含む標識マイクロ遠心チューブに950μlのを転送します。氷上で回収した細胞をボルテックスし、配置します。 30℃のヒートブロックに15ミリリットルを円錐管を返します。
- 例えば、30分シクロヘキシミドの添加後の細胞の収集のために、渦（タイムコースの開始時に、酵母細胞懸濁液にシクロヘキシミド添加の間に30秒の間隔を仮定）と30:00でサンプル＃1からの細胞懸濁液950μLを除去します。ように30:30でサンプル＃2のために繰り返し、。
注：チェイスの過程を通じて約15ミリリットルで、5分ごとにコニカルチューブをボルテックス細胞懸濁液を酵母の沈降を防止するために。あるいは、酵母細胞懸濁液Sはシクロヘキシミドチェイス実験の期間中、連続的に撹拌水浴中で維持することができます。
- 例えば、30分シクロヘキシミドの添加後の細胞の収集のために、渦（タイムコースの開始時に、酵母細胞懸濁液にシクロヘキシミド添加の間に30秒の間隔を仮定）と30:00でサンプル＃1からの細胞懸濁液950μLを除去します。ように30:30でサンプル＃2のために繰り返し、。
- 全てのサンプルが収集されたら、ペレットを30秒間、室温にて6,500×gでの遠心分離によって細胞を収集しました。ピペッティングまたは吸引により上清を取り除きます。細胞は、今、アルカリ溶解のための準備が整いました。また、スナップ凍結液体窒素とストア内のペレット化した細胞を-80℃で。
3.ポストアルカリ性タンパク質抽出（16,40から変更されました）
- 各細胞ペレットに100μlの蒸留水を加えます。ピペッティングまたはボルテックスによって再懸濁します。
- 各試料に0.2 M NaOHを100μLを加えます。ピペッティングまたはボルテックスにより混和します。
- インキュベートは、室温で5分間、細胞を懸濁しました。この段階において、酵母細胞は溶解されていない、およびタンパク質40をリリースしていません。
- 部屋の気性で18,000×gで遠心分離により細胞をペレット化30秒間ature。ピペッティングまたは吸引により上清を取り除きます。
- 細胞を溶解し、各細胞ペレットにレムリ試料緩衝液100μlを加えます。ピペッティングまたはボルテックスによって再懸濁します。
注：トリス - グリシンランニング緩衝系を使用して、ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）と互換性のある形でのNaOHとのLaemmli試料バッファを解放タンパク質と細胞の連続インキュベーション。 - 完全タンパク質を変性するために95℃で5分間インキュベートします。
注：95℃でのインキュベーションは、凝集しやすいタンパク質の分析には適していない（ 例えば 、いくつかの膜貫通セグメントを有するタンパク質）。高温41でインキュベートした場合、これらのタンパク質は不溶性になることがあります。経験的に決定されたとして30分、 - 10 -したがって、そのようなタンパク質の分析のために、溶解物は、より低い温度（70℃、例えば 37℃）でインキュベートする必要があります。 - ROで18,000×gで遠心分離した溶解物不溶性物質をペレット化するために1分間オム温度。上清（可溶化抽出したタンパク質）をSDS-PAGEおよびその後のウエスタンブロット分析による分離のために準備ができています。また、-20℃で保存溶解物。
4.代表的SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング手順（16から適応）
- 負荷タンパク質分子量標準およびSDS-PAGEゲル上に溶解物の経験的に決定されたボリューム。
注：目的のタンパク質の分子量に基づいて、SDS-PAGEゲル中のアクリルアミドおよびビスアクリルアミドの割合を選択します。一般的に、低いパーセンテージのゲルは、より高い分子量のタンパク質を解決するために適しています。 - 色素の先端がゲルの下端に達するまで、200 Vでゲルを実行します。
- 4℃で90分 - ポリフッ化ビニリデン（PVDF）60 20 Vで湿潤転写によって膜にゲルから転送タンパク質。
- （TBトリス緩衝生理食塩水でインキュベートすることにより、膜をブロックS）、5％スキムミルクを含む1時間または4℃で一晩、室温で、ロッキング。
注：一晩インキュベートした膜の存在下で微生物の増殖を防ぐためには、0.02％の最終濃度でブロッキング溶液にアジ化ナトリウムを含むことが推奨されます。 - 室温で1時間、揺動、0.1％のTween-20（TBS / T）及び1％のスキムミルクを含むTBS中で目的のタンパク質に特異的な一次抗体と共に膜をインキュベートします。
- ロッキング、TBS / Tで、室温で3×5分間メンブレンを洗浄。
- ロッキング、室温で1時間1％スキムミルクを含むTBS / Tで適切なフルオロフォア結合二次抗体で膜をインキュベートします。
注：フルオロフォアは、光に敏感です。したがって、フルオロフォアに結合した抗体の希釈液は、暗闇の中で準備する必要があり、かつ蛍光団およびその後の洗浄工程に結合した抗体の存在下での膜のインキュベーションは、（ 例えば、アルミホイルにくるまれた）遮光に起こるべき共同ntainers。 - ロッキング、TBS / Tで、室温で3×5分間メンブレンを洗浄。
- 画像膜メーカーの推奨に従って、LI-CORのオデッセイCLX及び画像Studioソフトウェア（または同等のイメージング機器やソフトウェア）を使用。
- 膜の画像を取得した後、ロッキング、1時間室温で1％スキムミルクを含むTBS / Tでローディングコントロールタンパク質に特異的な一次抗体で膜をインキュベートします。
- ロッキング、TBS / Tで、室温で3×5分間メンブレンを洗浄。
- ロッキング、室温で1時間1％スキムミルクを含むTBS / Tで適切なフルオロフォア結合二次抗体で膜をインキュベートします。
- ロッキング、TBS / Tで、室温で3×5分間メンブレンを洗浄。
- ステップ4.9のように、画像の膜。
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Representative Results
シクロヘキシミド追跡方法を説明するために、Deg1 -Sec62の安定性（ 図1）、モデル酵母の小胞体（ER）関連分解（ERAD）基板は、42〜44を分析しました。 ERADでは、品質管理ユビキチンリガーゼ酵素は共有結合ER膜に局在異常なタンパク質に小さなタンパク質のユビキチン鎖を取り付けます。このようなポリユビキチン化タンパク質は、その後、大きな細胞質ゾルプロテアーゼ45 ERから除去され、プロテアソームにより分解されます。それは永続的に及び異常トランスロコン、ER内腔または膜43へのタンパク質の移行を促進するチャネルに係合後Deg1 -Sec62タンパク質が分解の標的とされています。同様に、哺乳類のアポリポタンパク質B、低密度リポタンパク質のタンパク質成分は、持続的ERトランスロコンと係合し、その後ときにリップ関連機構による分解を受けイド結合パートナー46-48存在しません。 （トランスロコン関連用）43を基質したがって、持続的にまたは異常にトランスロコンに係合タンパク質の分解への洞察をもたらすことができる酵母細胞においてDeg1 -Sec62劣 化の解析、仮ERAD-Tと呼ばれます。
以前の研究では、Deg1 -Sec62 16,42-44の分解を触媒するユビキチン結合酵素UBC7とERに存在するユビキチンリガーゼHRD1機能することが示されています。貫 通タンパク質CUE1は、ER膜にUBC7を固定し、酵素49-51を活性化させます。しかし、Deg1 -Sec62の劣化でCUE1ための要件は、直接調査されていません。 CUE1は、HRD1とUBC7のように、Deg1 -Sec62の効率的な分解のために必要であるという仮説をテストするには、Deg1 -Sec62を発現している野生型および変異酵母細胞は、シクロヘキシミドチェイスとウェスに供しましたターンブロット分析（ 図2A）。 Deg1 -Sec62タンパク質は、複数の種のようにSDS-PAGEに移行します。これは、タンパク質の43,44,52の広範な翻訳後修飾を示す以前の研究と一致しています。野生型酵母細胞において、Deg1 -Sec62は容易に分解されました。以前に観察されたように、HRD1またはUBC7のいずれかの損失は、実質的にDeg1 -Sec62タンパク質42-44を安定化。予測したように、Deg1 -Sec62はERAD-TでUBC7相互作用タンパク質の役割を確認し、（UBC7の不在と同様の程度まで）CUE1の不在下で安定化させました。
各時点で残っているDeg1 -Sec62タンパク質の割合を定量し、 図2Bにプロットされています。我々は、野生型細胞におけるDeg1 -Sec62の消失の見かけの速度は、新生Deg1 -Sec62の分解速度を過小評価することができることに注意してください（ すなわち、最も直接的にパルスチェイス分析43により決定することができるタンパク質の半減期）。野生型酵母が活発シクロヘキシミドの添加前Deg1 -Sec62タンパク質を分解するので、Deg1 -Sec62の定常状態の存在量は、実質的に（劣化が損なわれた細胞と比較して）これらの細胞において低減されます。これは、 図2Aの各株のための初期の時点でDeg1 -Sec62の存在量を比較することによって理解することができます。さらに、任意の基質タンパク質の分解耐性亜集団（ 例えば、タンパク質が分解が防止された細胞内プールに蓄積している場合）は、実験の時間経過にわたって野生型細胞では比較的安定した表示される場合があります。
Deg1 の分解図1.モデル トランスロコンの > -Sec62以下の異常なエンゲージ （A）Deg1 -Sec62の概略図Deg1 -Sec62がシーケンスの次の要素で構成されています。。Deg1（酵母転写抑制MATα2からアミノ末端67アミノ酸）、旗（F）エピトープ、2回膜貫通型タンパク質Sec62、および小胞体（ER）膜へのその2つの膜貫通セグメントの通常の同時翻訳の挿入に続いて、黄色ブドウ球菌プロテイン A（PRA）。（B）の2つのコピー、永続的な関連付けロコンとDeg1 -Sec62の異常、Deg1依存性、翻訳後のトランスロコンの関与をトリガします。細胞質ゾルのアミノ末端の部分異常に入り、そしておそらく内-トランスロコンのまま。（C）トランスロコンの婚約後は、HRD1ユビキチンリガーゼはDeg1 -Sec62をubiquitylates。 HRD1は、ユビキチン結合酵素Uによって支援されていますCUE1によってER膜に固定されているBC7、。 Ubが、ユビキチンタンパク質単量体（D）ユビキチン化Deg1 -Sec62は、ER膜から抽出され、プロテアソームによって分解、トランスロコンの閉塞を緩和される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ウェスタンブロッティングに続いて、図2シクロヘキシミドチェイスはCUE1が効率的 Deg1 -Sec62分解 のために必要であることを示しています 。示された遺伝子型の（A）酵母細胞をDeg1 -Sec62（pRS416-P MET25 - Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA; AMPR / URA3 43）をコードする酵母セントロメアプラスミドで形質転換し、シクロヘキシミドチェイス分析を行いました。タンパク質（0.125 OD 600単位に相当）を各時点からの8％SDS-PAGEゲル上で分離し、直接Deg1のC末端プロテインAのエピトープに結合ウサギ抗マウス二次抗体を用いてウェスタンブロッティングにより検出されました- Sec62融合タンパク質。ローディング対照として、メンブレンをその後PGK1に特異的な抗体と共にインキュベートしました。この実験は3回反復されました。代表的な結果を、（B）に描かれている（A）におけるデータの定量化は、イメージングソフトウェア（ 材料の表を参照）を用いて行きました。 Deg1 -Sec62タンパク質を包含する領域の全蛍光強度は、各試料について測定しました。各サンプルのバックグラウンド蛍光強度をDeg1 -Sec62タンパク質近傍の画素の平均蛍光強度から推定しました。この外挿され、バックグラウンドの蛍光強度は、調整fluorescを生成する総蛍光強度から差し引きました各サンプルのレンス強度。類似の合計数量化、背景、及び調整された蛍光強度は、PGK1、その存在量をアッセイ条件下で変化しない負荷制御タンパク質について実施しました。サンプル間Deg1 -Sec62タンパク質の存在量を比較するために、PGK1にDeg1 -Sec62の調整された信号強度の比を各サンプルについて決定しました。 Deg1 -Sec62 / PGK1比は、分析中の各株のために（ すなわち 、即時シクロヘキシミド添加後）最初の時点で100％と定義しました。その後の時点（ すなわち 、Deg1 -Sec62 / PGK1比）で、残りのDeg1 -Sec62の量は、最初の時点でDeg1 -Sec62 / PGK1比の割合として算出した。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
| 合成定義（SD）最小酵母培地 | 2％のブドウ糖、アミノ酸のない0.67％酵母窒素ベース、0.002％アデニン、0.004パーセントのウラシル、0.002％のアルギニン、0.001％ヒスチジン、0.006パーセントのイソロイシン、0.006パーセントのロイシン、0.004パーセントのリジン、0.001％メチオニン、0.006パーセントのフェニルアラニン、0.005 ％のスレオニン、0.004パーセントのトリプトファン。固体（プレート）の媒体については、2％寒天を含みます。 | 1.選択培地は、適切なアミノ酸（S）または窒素含有塩基を省略することにより調製されます。 |
| 2.次のように便宜上、これらの成分は、濃縮ストック溶液として維持することができます。アミノ酸は、全ての所望のアミノ酸を含有する100倍ストック溶液として維持することができます。酵母窒素塩基は、20×ストック溶液（13.4％）に維持することができます。デキストロースは、40％のストック溶液中に維持することができます。アデニンおよびウラシルは0.1 M NaOH中の1％ストック溶液として維持することができます。 | ||
| 3。オートクレーブにより培地を滅菌します。 | ||
| 酵母エキス、ペプトンデキストロース（YPD）リッチ酵母中 | 1％酵母エキス、2％ペプトン、2％デキストロース（オプション：0.002％アデニン）。固体（プレート）の媒体については、2％寒天を含みます。 | アデニンの不在（または少量）中にゆっくり成長し、特定の実験室酵母株の赤色着色特性を防止するために1、アデニンは、YPD増殖培地に添加してもよいです。 |
| 2.次のように便宜上、いくつかの成分は、濃縮ストック溶液として維持することができます。デキストロースは、40％のストック溶液中に維持することができます。アデニンは0.1 M NaOH中の1％ストック溶液として維持することができます。 | ||
| 3.オートクレーブにより培地を滅菌します。 | ||
| 20倍ストップ・ミックス | 200 mMのアジ化ナトリウム、5 mg / mlウシ血清アルブミン | アジ化ナトリウムは、経口摂取または皮膚接触を介して、有毒です。メーカーに従ってください、製造、保存、及びアジ化ナトリウムを取り扱う勧告。偶発的曝露の場合には、メーカーが提供する製品安全データシートを参照してください。 |
| 20mg / mlのシクロヘキシミド | 1.エタノール中で準備します。 -20℃で保管してください。 | |
| 2.シクロヘキシミドは、皮膚刺激性であり、経口摂取を介して、有毒です。 、準備、保存、およびシクロヘキシミドを取り扱う際、メーカーの推奨事項に従ってください。偶発的曝露の場合には、メーカーが提供する製品安全データシートを参照してください。 | ||
| 0.2 M水酸化ナトリウム | 水の中に準備します。水酸化ナトリウムは、ガラスと反応します。このため、長期保存のために、0.2 M水酸化ナトリウムをプラスチック容器内で維持されるべきです。 | |
| レムリ試料緩衝液 | 2％SDS、10％グリセロール、5％＆＃946; 0.008パーセントのブロモフェノールブルーメルカプトエタノール、60mMのトリスHCl pHは6.8、 | 1. Laemmliサンプル緩衝液は、多くの場合、より濃縮された（ 例えば、5×）ストックを希釈することによって調製されます。 |
| 2.色素ブロモフェノールブルーは、所望の強度に加えてもよいです。 「ピンチ」（スパチュラの縁からタップ微量）は、典型的には十分です。 | ||
| レムリランニング緩衝液（5×） | 125 mMトリス、960 mMグリシン、0.5％SDS | dH 2 Oで5：ランニングバッファー1×レムリの1 Lを準備するには、1を希釈 |
| トリスアセテート-SDS転送バッファ（5×） | 125 mMトリス酢酸（pHは8.8）、960 mMグリシン、0.05％SDS | 1×トリス酢酸-SDSの20 Lを準備するには、5倍の株式の4 L、メタノールの4 L、との dH 2 Oの12 Lを組み合わせて、バッファを転送します |
| 10倍トリス緩衝生理食塩水（TBS） | 500 mMトリス、1.5 MのNaCl; pH7.5に調整 | 1×TBSの1 Lを調製するためには、のdH 2 Oで1:10に希釈します1×TBS、適宜界面活性剤のTween-20及び脱脂粉乳を補充することができます。 |
本研究で用いた表1ソリューション。
| ひずみ名 | エイリアス | 関連する遺伝子型 | リファレンス |
| VJY42 | MHY501 | MATα | Chenら 、1993 |
| HIS3-Δ200 | |||
| leu2-3,112 | |||
| ura3-52 | |||
| lys2-801 | |||
| trp1-1 | |||
| GAL2 | |||
| VJY47 | YWO55; MHY507 | MATα | ユングマンら、1993。ルーベンスタインら 、2012 |
| HIS3-Δ200 | |||
| leu2-3,112 | |||
| ura3-52 | |||
| lys2-801 | |||
| trp1-1 | |||
| GAL2 | |||
| ubc7Δ:: LEU2 | |||
| VJY56 | YTX105; MHY1364 | MATα | Biederer ら、1997; Ravid ら 、2006 |
| HIS3-Δ200 | |||
| leu2-3,112 | |||
| ura3-52 | |||
| lys2-801 | |||
| trp1-1 | |||
| GAL2 | |||
| cue1Δ:: HIS3 | |||
| VJY172 | MHY6199 | MATα | この研究 |
| HIS3-Δ200 | |||
| leu2-3,112 | |||
| ura3-52 | |||
| lys2-801 | |||
| trp1-1 | |||
| GAL2 | |||
| hrd1Δ:: kanMX4 |
本研究で用いた表2酵母株。全ての株MHY500 53とコンジェニックです。 VJY42、VJY47、およびVJY56は、以前49,53,54説明しました。 （この研究のために調製した）VJY172の詳細な歪みの生成と確認戦略は、リクエストに応じて入手可能です。
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Discussion
この論文では、タンパク質分解の動態を分析するための方法が提供されます。この技術は、容易に様々なメカニズムにより分解タンパク質の範囲に適用することができます。シクロヘキシミドチェイス実験は、所定のタンパク質の定常状態プールの分解速度について報告することに留意することが重要です。他の技術は、タンパク質の特定の集団の分解速度を分析するために使用されてもよいです。例えば、新生ポリペプチドの分解の運命は、パルスチェイス分析55によって追跡することができます。このような実験では、新生タンパク質が短時間パルス標識（ 例えば 、放射性アミノ酸を有する）です。 （または定常状態のタンパク質存在量の変化をミラーリングしてもしなくてもよい）標識された新生タンパク質の存在量の変化は、時間をかけて追跡することができます。
シクロヘキシミドチェイス（ すなわち、最大2時間）、比較的短い時間にわたってタンパク質の安定性を分析するのに適しています。長い時間c以上ourses（ すなわち 、2日間時間）、シクロヘキシミド、翻訳の世界的な阻害剤は、原因ユビキチン56の枯渇に可能性が高い、細胞に対して毒性です。また、より長い時間のコース上でタンパク質の安定性の解析は、対象（ 例えば、タンパク質の分解に関与短命タンパク質の分解のタンパク質の分解に世界的に損なわれ、タンパク質合成の間接的な影響によって損なわれる可能性が高いです利息）。このようなパルスチェイス代謝標識実験のような他の技術は、従って適し長寿命タンパク質の分解を研究するためであり、シクロヘキシミドチェイス実験で得られた結果を裏付けるために行われてもよいです。
細胞のシクロヘキシミドし、コレクションの添加時期は、この手順の重要な考慮事項です。時間の小さな偏差は、シクロヘキシミドのaddiからの経過として精度は、非常に短命のタンパク質の分析では特に重要です細胞収穫へンは見かけ分解速度に大きな影響を持つことができます。さらに、これらの時間に敏感なステップを実行するための明確な計画なしに、実験は急速に混乱と欲求不満に委譲することができます。このため、計画された、一定の間隔で培養物にシクロヘキシミドを追加することをお勧めします。 30秒の間隔は、このプロトコルで提案されているが、タイミングは、研究者の快適さのレベルと器用さと一致するように調整されてもよいです。初心者の研究者は、それが有用な実験前を開始するサンプル収集時間のスケジュールを書き込むために、それが起こるようにスケジュールされた各コレクションをオフに交差するように見つけることができます。
ステップ1.7ここで説明されたプロトコルの1.8において、酵母細胞培養物は、その後のシクロヘキシミドチェイス手順の間に操作を容易にするために、増殖培地の減少容積に集中しています。しかし、酵母細胞の遠心分離は、急速に特定の細胞ストレス応答（ 例えば 、シグナル伝達経路を誘導することグルコース欠乏）57,58によって活性化されます。調べでは、したがって、遠心分離の長期間に警告を発しています。遠心分離に敏感であり、タンパク質の安定性を分析すると、研究者は、事前の遠心分離することなく、対数期中期培養物に直接シクロヘキシミドを追加したい場合があります。このような場合には、シクロヘキシミド、同じ最終濃度（250 / mlの）に添加されるべきであり、酵母細胞試料を最初の遠心分離工程（ 例えば 、急速濾過）57を必要としない方法により回収することができます。さらに、ステップ2.3 - 2.5、各時点で採取した試料は、アジ化ナトリウムを含有する溶液に移し、氷上に置きました。これらの条件は、チェイス期間中継続的タンパク質分解を阻害します。アジド、それによって特異的ATP依存性プロテアーゼの活性を阻害する、ATP 59の細胞内濃度を減少させることに留意すべきです。一方、低温べきLSO非ATP依存性タンパク質分解プロセス機能する速度を低下させる、そのようなメカニズムにより分解タンパク質を研究する研究者は、代わりにスナップ凍結する液体窒素中で細胞ペレットを、各サンプルが採取されているように選択することができます。
細胞溶解し、この原稿に含まウェスタンブロッティングのための代表的なプロトコル用のサンプルプロトコルは、以前の報告16,40から適応されています。ここに記載後、アルカリ溶解法においては、NaOHの前処理は、Laemmliサンプル緩衝液のその後の添加により酵母タンパク質の抽出を増強します。この機能拡張が起こるメカニズムは不完全に40を特徴としています。しかしながら、このような酵母細胞壁に見られる多糖類は、アルカリ条件60に溶解します。したがって、それらをよりsensitivレンダリング（ すなわち、細胞壁成分を除去）、部分的にまたは完全酵母細胞をスフェロプラストのNaOHの存在下でのそのインキュベーションを推測したくなりますLaemmliサンプル緩衝液中のSDSの洗浄剤に存在するE。タンパク質は高度に変性条件下で放出されるため、プロテアーゼ阻害剤は、Laemmliサンプル緩衝液中に含まれる必要はありません。細胞溶解の具体的な方法は、所定の実験のために適宜変更されてもよいです。例えば、ポストアルカリ溶解法では不十分ウェスタンブロットによって検出された低存在量タンパク質またはタンパク質に適していないかもしれません。このような場合に、タンパク質サンプルを濃縮するトリクロロ酢酸沈殿工程を含む方法が61最も適切であり得ます。また、抗体の選択に関するいくつかの重要な考慮事項、ロード制御の選択、および検出の代替手段（ 例えば、フィルムまたはデジタルイメージングシステムを用いて化学発光ウェスタンブロッティング）は最近、16を議論してきました。シクロヘキシミド処理後のタンパク質の存在量の定量を行ってもよいです。多くの撮像システムは、容易にソフトウェアパッケージで販売されていますこの分析。
シクロヘキシミドチェイスは、酵母タンパク質の種々の分解を分析するために実施されてもよいし、他の真核細胞におけるタンパク質の安定性を研究するために適合させることができます。このプロトコールに記載されているように、シクロヘキシミド処理は、細胞溶解およびウェスタンブロット分析によるタンパク質存在量の検出が続きます。用途に応じて、しかし、シクロヘキシミド処理後のタンパク質の存在量は、研究目的のための適切な技術の範囲によって評価することができます。タンパク質のサイズは、分析に関連する要因ではない場合、例えば、細胞溶解物は、タンパク質存在量について報告ドットブロットまたは酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）分析に供はなく見かけの分子量62もよいです。細胞表面上のタンパク質（または内部蛍光内部タンパク質をタグ付け）するために、フローサイトメトリーは、シクロヘキシミドの添加51後の異なる時間でのサンプルのタンパク質存在量を定量するために使用することができます。フルオシクロヘキシミド処理後rescence顕微鏡は、タンパク質の存在量およびローカライゼーション18の両方に関する情報を提供するであろう。基板、生物、およびシクロヘキシミドチェイスの影響を受けやすい下流の応用範囲は、技術タンパク質分解を研究する汎用性の高いかつ有益な手段になります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | |||
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | A tube roller is recommended to maintain overnight starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heaters | Fisher Scientific | 1172011AQ | It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins. |
| Heating block for 12 x 15 ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-473-70 | For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide. |
| Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-718-9Q | For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation. |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
References
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