Celler, der vokser i en tredimensional (3-D) miljø repræsenterer en markant forbedring i forhold til celledyrkning i 2-D miljøer (f.eks kolber eller retter). Her beskriver vi udviklingen af en flercellet 3-D organotypiske model af den humane intestinale mucosa dyrket under vægtløshed billede ved at dreje-væg-beholder (RWV) bioreaktorer.
Fordi celler, der voksede i en tredimensional (3-D) miljø har potentiale til at slå bro mange huller af celledyrkning i 2-D miljøer (f.eks., Kolber eller retter). Faktisk er det almindeligt anerkendt, at celler dyrket i kolber eller retter tendens til at de-differentiere og miste specialiserede funktioner i vævene, hvorfra de blev afledt. I øjeblikket er der hovedsagelig to typer af 3-D dyrkningssystemer hvor cellerne podes i stilladser efterligner den native ekstracellulære matrix (ECM): (a) statiske modeller og (b) modeller ved hjælp bioreaktorer. Det første gennembrud var de statiske 3-D-modeller. 3-D-modeller under anvendelse af bioreaktorer, såsom den roterende væg-fartøj (RWV) bioreaktorer er en nyere udvikling. Det oprindelige koncept af RWV bioreaktorer blev udviklet ved NASAs Johnson Space Center i begyndelsen af 1990'erne og menes at overvinde de begrænsninger af statiske modeller såsom udvikling af hypoxiske, nekrotiske kerner. De RWV bioreaktorer kan omgå ther problem ved at tilvejebringe fluid dynamik, der tillader effektiv diffusion af næringsstoffer og ilt. Disse bioreaktorer består af en rotator base, der tjener til at understøtte og rotere to forskellige formater af dyrkningsbeholdere, der adskiller sig ved deres beluftning kilde seværdighed: (1) Langsom Turning Laterale Fartøjer (STLVs) med en koaksial oxygenator i midten, eller (2 ) High Aspect Ratio Fartøjer (HARVs) med iltning via en flad, silikonegummi gas transfer-membran. Disse skibe tillader effektiv gas overførsel samtidig undgå bobledannelse og deraf følgende turbulens. Disse betingelser resulterer i laminar strømning og minimal forskydningskraft at modeller reduceret tyngdekraft (mikrogravitet) inden i dyrkningsbeholderen. Her beskriver vi udviklingen af en flercellet 3-D organotypiske model af den humane tarmslimhinde sammensat af en intestinal epitelcelle linje og primære humane lymfocytter, endotelceller og fibroblaster dyrket under vægtløshed tilvejebragt af RWV bioreaktoren. </ P>
Det første gennembrud i opbygningen af en 3-D model blev rapporteret i de tidlige af 1980'erne, hvor forskere begyndt at undersøge forskellige typer af stilladset (eg., Laminin, collagen type I, collagen IV, og fibronectin) og cocktails af vækstfaktorer at forbedre celle-til-celle og ECM interaktioner af "statiske" 3-D-modeller 1-7. Siden da har det største problem med disse modeller været begrænsninger i overførslen af næringsstoffer og ilt inden for de mellemstore og væv konstruktioner 8. I modsætning til celler i in vivo miljø, der modtager en jævn strøm af næringsstoffer og oxygen fra omgivende netværk af blodkar, den statiske natur af disse modeller hindrer effektiv fordeling af dem til cellerne. For eksempel vil celleaggregater genereret ved in vitro statiske modeller, der overstiger nogle få millimeter i størrelse uvægerligt udvikle hypoxiske, nekrotiske kerner 9. De RWV bioreaktorer kan omgå dette problemved at tilvejebringe fluid dynamik, der tillader effektiv diffusion af næringsstoffer og ilt 10-12. Men til dato, arbejde ved hjælp RWV bioreaktorer er blevet begrænset til optagelse af en eller to celletyper 13-17. I stedet for en rumlig orientering ligner native væv, de celler dannet celleaggregater. Den væsentligste årsag til disse begrænsninger har været manglen på et stillads i stand til at indarbejde celler på en integreret måde. Stilladserne anvendes i RWV bioreaktorer til dato består, med få undtagelser 16-18, hovedsagelig af syntetiske mikroperler, rørformede cylindre eller små plader 13-15,19-23. Disse er stive materialer, hvis sammensætning og fleksibilitet ikke kan manipuleres, og hvortil cellerne er bundet til deres overflade. Således er det usandsynligt, at disse modeller vil tilvejebringe et system til at vurdere, på en integreret måde, de forskellige cellekomponenter såsom stromale celler (f.eks., Fibroblaster, immun- og endotheliale celler) at should blive dispergeret i stilladset til nøje efterligner humant væv.
Her beskriver vi udviklingen af en flercellet 3-D organotypiske model af den humane tarmslimhinde sammensat af en intestinal epitelcelle linje og primære humane lymfocytter, endotelceller, og fibroblaster 24. Disse celler blev dyrket under vægtløshed giver ved RWV bioreaktor 13,25-30. I vores 3-D model, ECM'en har mange forskellige egenskaber, såsom en osmolalitet svarende til dyrkningsmediet (f.eks., Ubetydelige diffusionssystemer begrænsninger under kultur) og evnen til at optage celler og andre relevante ekstracellulære matrixproteiner, samt passende stivhed til anvendelse i bioreaktorer 24. Biologiske systemer er meget komplekse, og i de seneste par år har der været et skift i fokus i slimhinde forskning mod undersøgelse af celle interaktioner med deres omgivelser i stedet for at studere dem i isolation. Især er betydningen af celle-celle-interaktioner i at påvirke intestinal celle overlevelse og differentiering veldokumenteret 31-34. Konkret kommunikationen mellem epitelceller og deres niche har en stor indflydelse på den epitelcelle ekspansion og differentiering 35. Faktisk er det almindeligt anerkendt, at ikke kun celle-til-celle, men også celle-til-ECM-interaktioner er afgørende for opretholdelsen og differentiering af epitelceller i 3-D kulturmodeller. Tidligere undersøgelser har vist, at tarmen ECM-proteiner, såsom kollagen I 24,36,37, laminin 38 og fibronectin 39 er medvirkende til at påvirke intestinale epitelceller til at erhverve rumlige orientering svarende til det native slimhinde. Således er udviklingen af nye teknologier, ligesom vores 3-D model 24, der kan efterligne den fænotypiske mangfoldighed tarmen er påkrævet, hvis forskere agter at genskabe den komplekse cellulære og strukturel arkitekturog funktion af tarmen mikromiljø. Disse modeller er et vigtigt redskab i udviklingen og evalueringen af nye orale lægemidler og vaccinekandidater.
I dette manuskript, beskriver vi udviklingen af af en biologisk model for den humane intestinale mucosa består af multipla celletyper, herunder primære humane lymfocytter, fibroblaster, og endotelceller samt intestinale epiteliale cellelinier 24. I denne 3-D-model, er cellerne dyrket i et collagen-rige ekstracellulære matrix under vægtløshed betingelser 24.
Som tidligere beskrevet, de væsentligste træk ved denne model er: (i) evnen til at efterli…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
Adenine | Sigma | A2786 | |
Insulin | Sigma | I-6634 | |
3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
Heparin | Sigma | H3149 | |
Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |