Summary
Мы описываем быстрый, молекулярный основе гриппа A и B анализа. Гриппа тест определяет каждую мишень в течение 15 мин с использованием изотермического амплификации с гриппом специфических праймеров с последующим обнаружения цели с зондами молекулярных радиомаяка. И В анализе гриппа А удобно и требует минимальных практического времени для выполнения.
Abstract
Грипп является респираторное заболевание, вызываемое вирусами гриппа А и В в организме человека и вызывает значительное количество заболеваемости и смертности ежегодно. Гриппа A и B для анализа был первый тест молекулярного быстрого гриппа ОРСУ-отказ от имеющихся. Испытание гриппа A и B работает с использованием изотермического амплификации с гриппом специфических праймеров с последующим обнаружения цели с зондами молекулярных радиомаяка. При этом производительность гриппа A и B для анализа на замороженное, архивируются носоглотки тампон (NPS) образцов, хранящийся в вирусной транспортной среде (VTM) сравнивали с анализом респираторного панели.
Производительность А и В анализе гриппа оценивали путем сравнения результатов с эталонной панели методом респираторной. Чувствительность к общей вируса гриппа А составила 67,5% (95% ДИ (ДИ), 56.6-78.5) и специфичность 86,9% (CI, 71.0-100). Для тестирования вируса гриппа B, чувствительность и специфичность составили 90,2% (ДИ 68.5-100) И 98,8% (ДИ 68.5-100), соответственно.
Эта система имеет преимущество значительно более короткого времени испытания, чем любой другой доступный в настоящее время молекулярного анализа и простой, пипеткой свободной процедуры работает на полностью интегрированной, закрытая, система малой площади. В целом, гриппа A и B оценивали анализ в данном исследовании, имеет потенциал, чтобы служить в качестве диагностического теста быстрого гриппа точки оказания медицинской помощи.
Introduction
Вирус гриппа инфекции приводят к значительному количеству заболеваемости и смертности каждый год 1, 2, 3. Несложный гриппа характеризуется конституционными и респираторные симптомы , такие как лихорадка, миалгии, головная боль и непродуктивный кашель 4, 5. Люди старшего возраста, детей младшего возраста, пациентов с ослабленным иммунитетом, а также у пациентов с сопутствующими заболеваниями , лежащих в основе находятся на более высоком риске для серьезных осложнений , таких как пневмония, миокардит, заболевания центральной нервной системы, или смерти 6, 7.
Инфекция гриппа является уникальным от других респираторных вирусов в том , что быстрое введения противовирусной терапии в течение 48 часов после появления симптомов может уменьшить тяжесть заболевания и длину 8. Быстрая идентификация гриппа также былапоказано , чтобы уменьшить использование ненужных антибиотиков 9, 10. Кроме того, госпитализированных пациентов с инфекцией гриппа должны быть размещены в изолированных помещениях с соответствующими мер инфекционного контроля. Тем не менее, респираторные заболевания, вызванные вирусами гриппа, не может быть трудно клинически отличить от гриппа. По этой причине, быстрого и точного диагностического тестирования на грипп является очень важным для клинического лечения пациента.
Некоторые анализы доступны для обнаружения и идентификации вирусов гриппа. Экспресс - тесты для выявления антигенов гриппа (RIDTs) широко используются в клинической практике в качестве точки оказания медицинской помощи тестов , потому что они просты в использовании и обеспечивают результаты в течение от 15 до 30 мин 11, 12; Тем не менее, их чувствительность широко (10-80%) в зависимости от производителя и населения испытывается различаются, и типа гриппа и subtyре 13, 14, 15. Прямые анализы флуоресценции (ДКА) обеспечивают превосходные чувствительность над RIDTs, но время обработки больше (~ 3 ч) и должны быть завершены квалифицированными технологами 16, 17. Вирусная культура была золотым стандартом для диагностики гриппа и улучшилась чувствительность в отношении обоих RIDTs и ДКА 18. Тем не менее, грипп вирусная культура может занять от 2-14 г до завершения, уменьшая его полезность в помощи лечения пациента 19. И, наконец, тесты амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) заменили методы культуры в качестве нового золотого стандарта в диагностике гриппа. NAAT считаются имеющими наибольшую чувствительность для обнаружения гриппа в течение нескольких часов. Однако NAAT самые дорогие анализы и требуют специализированного оборудования и технологов для выполнения 5
Анализ гриппа А и В, описанный здесь первый ОРСУ-отказ от молекулярного экспресс-тест гриппа, который легко доступен. Этот анализ работает с использованием реакция перекреста Эндонуклеаза Amplification (Near), который использует изотермический амплификации с гриппом специфических праймеров с последующим обнаружения цели с зондами молекулярных радиомаяка. Этот анализ отличает гриппа A от B, требуется 2 минуты, чтобы установить и обработать один образец, и требует в общей сложности 15 минут, чтобы закончить.
Здесь мы представляем протокол для анализа гриппа A & B. Кроме того, мы предлагаем образец набора данных сравнения характеристик вируса гриппа A и B анализа на архивизированных носоглотки тампон (NPS) экземпляры хранятся в вирусной транспортной среде (VTМ) к другому респираторного анализа возбудитель панели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Использование левой более клинических образцов одобрен и соответствует рекомендациям Совета по Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Review.
1. Перед запуском Пробирной
ПРИМЕЧАНИЕ: Грипп A и B анализ одобрен для носоглотки образцов мазков и носоглотки мазков, хранящихся в вирусных транспортных средств массовой информации. Тампоны включены в комплект и должны быть использованы для обеспечения оптимальной производительности. Тем не менее, искусственный шелк, пена, стекались тампоны или полиэфирной назальные мазки также могут быть использованы для сбора носовых мазков.
- Для того, чтобы собрать образец тампон из носа, вставьте тампон в ноздрю, которая имеет наиболее видимый дренаж или, что является наиболее перегруженным. С легким вращением, толкать тампон в ноздрю, пока сопротивление не будет выполнено и повернуть несколько раз против носовой стенки перед медленным удалением из ноздрей. Храните тампоны и транспортировать их в пробирки, содержащие 3 мл вирусной транспортной среды (VTM).
Примечание: Внимательное отношение к approprIate сбор проб должны быть приняты в качестве неадекватного сбора образцов может привести к ошибочным результатам.
Примечание: образцы мазков должны быть проверены как можно скорее после сбора. Тем не менее, они могут храниться при комнатной температуре в течение до 2 часов или в холодильнике при температуре 2-8 ° С в течение до 24 часов, если тестирование не доступна немедленно. Свежесобранные образцы идеально подходят для оптимальной производительности тестирования. Неправильное обращение образца, хранения и / или транспортировки может привести к ошибочным результатам.
Примечание: В качестве меры предосторожности, лица, выполняющие этот тест должен рассматривать все образцы как потенциально инфекционные, следуя универсальных мер предосторожности при работе с образцами. - Доведите все образцы до комнатной температуры перед тестированием.
Примечание: Все компоненты теста предназначены только для одноразового использования и не должны использоваться для выполнения нескольких тестов. Не следует смешивать компоненты набора из разных партий. Не используйте реагенты с истекшим сроком годности. - Принесите синий приемник образца в РООм Температура до тестирования. Оранжевый тест база может быть проверена без необходимости нагреться до комнатной температуры.
- Оставьте все испытательные образцы в упаковке из фольги непосредственно перед использованием. Включите прибор, нажав на кнопку питания на боковой панели прибора. Введите идентификатор пользователя и нажмите "OK".
2. Запуск теста
- Для того, чтобы начать процесс тестирования, нажмите "Run Test" на экране прибора. Введите идентификатор пациента с помощью экранной клавиатуры или сканера штрих-кода и нажмите "OK". Откройте крышку и вставьте испытательную базу Orange в держатель испытательной базы Orange.
- Убедитесь, что корректный тест отображается на экране и нажмите "OK". Вставьте синий образец приемника в держатель образца синего приемника.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не открывайте приемник образца перед размещением в приборе, так как это позволит предотвратить элюирующего буфера от достижения правильной рабочей температуры и может повлиять на результаты теста. Подождите, пока образец приемника, чтобы разогреть. При появлении прибора, снимите уплотнение из фольги и поместить тампон тестируемых пациентов в приемник образца.
Примечание: При удалении фольги, поместите два пальца на краю образца приемника для того чтобы убедиться, что он остается на месте. - Энергично смешать тампон в жидкости в течение 10 сек, нажав на головку тампоном против стороны образца приемника, как вы смешиваете его, чтобы помочь сместить образец от тампона. Нажмите 'OK' для продолжения. Если тестирование тампоны, хранящиеся в вирусной транспортной среде, вихрь VTM в течение 10 сек затем добавить 200 мкл к приемнику образца.
- Нажмите белую передачи картридж в голубой приемник образца. Продолжайте нажимать на приемнике образца, пока оранжевый индикатор не поднимается.
- Поднимите, а затем подключить передаточный картридж к испытательной базы. Обратите внимание на оранжевый индикатор опускаются, как только передача картридж правильно установлен. Закройте крышку и не открываются, пока "Test Complete"на экране появится соответствующее сообщение.
3. Контроль качества
- Нажмите 'Run Test QC' на главном экране. Выберите Test QC для запуска. Подтвердите тип теста, чтобы соответствовать образец QC, предназначенный для тестирования, нажав «ОК» и следуя инструкциям на экране для завершения тестирования.
4. Результат Интерпретация
- После того, как тестовый прогон завершен, наблюдать результаты теста, отображаемого на экране с интерпретациями на наличие вируса гриппа А, В, неизвестных подтипов. Для получения неверных результатов повторите тест.
5. Обслуживание и чистка
- Прибор очистить и окружающее пространство скамейка ежедневно с помощью 70% этанола или 10% раствором хлорной извести. Спрей чистящий раствор на влажной тканью без ворса, чтобы очистить. Не выливать растворы непосредственно на приборе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании, заархивированные образцы NPS собирали из стационарных больных, представляющих с гриппоподобными симптомами в Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) во время вспышки гриппа в период с 15 декабря 2012 года и 1 марта 2013 г. Образцы NPS были представлены в 3 мл СУДС и проходят в рамках рутинной клинической практике с молекулярным анализом, который обнаруживает группу респираторных вирусов (RP), в том числе гриппа а, а-1, а-3, и В. за исследуемый период, 3,675 NPS образцы были представлены к MSKCC клинической лаборатории для тестирования. Из этих образцов, 45, 425, 37 и 77 дали положительный результат на вирусы гриппа А-1, А-3, А-ун-subtypable (Au), и B, соответственно с RP. В общей сложности 360 положительных образцов, 40 образцов из каждой из подтипов гриппа, а также 37 Au. Кроме того, 1-2 отрицательные образцы, которые прибыли в лабораторию непосредственно перед или после того, как каждый из положительных образцов были выбраны для последующих Тестинг с гриппом А и В анализе.
В общей сложности, гриппа А и В анализе обнаружено 79 вируса гриппа A, 37 вируса гриппа В, 240 отрицательными и 4 недопустимые результаты (выход из строя внутреннего контроля) (таблица 1). Были 46 Противоречивые результаты с 44 образцов положительных на RP только и два положительных на грипп А и В анализе только. Третий анализ молекулярно на основе гриппа проводили на 44-несогласованных образцов, обнаруженных 33/43 (8 вируса гриппа A, 21 Au, и 2 вируса гриппа В), которые были положительными на RP и 0/1 положительный (вирус гриппа А) от гриппа а и в анализе. Соглашение между двумя или более анализов считается точная идентификация.
В целом гриппа A и B чувствительность анализа для общей сложности вируса гриппа А составила 67,5% (95% ДИ (ДИ), 56.6-78.5). Чувствительность к подтипов гриппа А был A-1, 84,6% (ДИ 58.5-100), A- 3, 90,2% (ДИ 62.8-100) и Аи, 21,9% (CI, 19.6-24.1). Общая специфичность по отношению к вирусу гриппа А был 86,9% (CI, 71.0-100). Для тестирования вируса гриппа B, чувствительность и специфичность составили 90,2% (ДИ, 68.5-100) и 98,8% (CI, 68.5-100), соответственно.
В целом, средние значения КТ в образцах с разноголосых результатами были значительно выше , чем полученные для непротиворечивых результатов (16,4 ± 0,48 против 25,7 ± 0,51; р> 0,000) (рисунок 1).
Рисунок 1: Средние значения CT , определенные с помощью ОФ анализа для образцов , которые были положительными и отрицательными, соответственно с помощью анализа для каждого подтипа вируса гриппа. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение. **, Р <0,01; *** Р <0,001.1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Производительность вируса гриппа А и В на VTM образцы , по сравнению с эталонными результатами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вирусы гриппа значительные мировые причины заболеваемости и смертности. Быстрый и точный диагноз гриппа является одним из основных ключей к управлению во время вспышки гриппа респираторного сезона. Другие тесты антиген на основе являются быстрым и легким для выполнения; Тем не менее, они имеют низкую чувствительность 13. С другой стороны, традиционные молекулярные тесты улучшили чувствительность, но требуют более опытных лабораторных технологов для выполнения и являются более дорогостоящими. Анализ гриппа А и Б, описанную в данном исследовании, и протокол является ОРСУ-отказалось, быстро молекулярный тест на вирус гриппа А и В. Технология основана на изотермическом-амплификации для обнаружения и дифференциации вирусов гриппа А и В. Покажем, показательные результаты, чтобы продемонстрировать производительность гриппа а и в анализе на панели архивным, замороженные образцы NPS VTM оценивали по сравнению с другим анализом молекулярной основе дыхательной панели.
T в RP анализах, предполагая , что нижний уровень обнаружения с помощью анализа было связано с более низкими титрами вируса. Анализ имел повышенную производительность для обнаружения на вирус гриппа В в течение вируса гриппа обнаружения с чувствительностью 90,2% и 98,1% специфичности. Результаты здесь согласуются с ранее опубликованной литературе 26, 27, 28.
Это исследование имеет два важных ограничения. Во-первых, образцы хранили в VTM для тестирования на платформе. Тем не менее, в то время, были протестированы образцы, платформа не было одобрение ФДА для этого типа образца. Таким образом, разведение в VTM, возможно, сгладилисьобнаружение низкого титра образцов VTM. Во-вторых, образцы, которые были протестированы с гриппа А и Б анализа хранились при -70 ° С в течение от 6 до 9 месяцев до начала испытаний, тогда как тестирование RP проводили на свежих образцах сразу после того, как они были получены. Вполне возможно, что замораживание образцов дополнительно снижается обнаружение вируса гриппа в образцах.
Гриппа А & B анализ имеет несколько шагов и просто выполнить. Тем не менее, есть два ключевых шагов, которые должны быть завершены надлежащим образом и что пользователи могут устранить, если они испытывают ошибки. Во-первых, при начальной настройке анализа, передачи картридж должен быть подключен к испытательной базе, пока они не встанут на место. Если эти две части не закреплены надлежащим образом, бег потерпит неудачу и необходимо будет повторить с самого начала. Во-вторых, прибор должен прогреться в течение 2 мин до добавления образца. После этого время прогрева, пользователи имеют 30 секунд, чтобы добавить образец, соедините передачи Cartridge к испытательной базы, и закройте крышку. Если время проходит, прежде чем этот шаг будет завершен, прибор не сможет прогон и образец настройки придется повторить с самого начала.
Ограничения анализа включают несколько увеличилась практический времени и более низкой чувствительностью по сравнению с дыхательной панелью и не подтипы гриппа А. Кроме того, только типы образцов, которые могут быть использованы при анализе являются носоглотки тампоны или НПС, которые хранятся в вирусные транспортные средства массовой информации; выполнение анализа для любого другого типа образца, такого как нижних дыхательных образцов, не была оценена. Важно отметить, что все действия, описанные в этом протоколе имеют решающее значение. Любые изменения или отклонения от протокола, написанного может привести к снижению производительности или анализа и должны быть оценены пользователем. Преимущество технологии заключается в том, что прибор имеет небольшой размер, занимает всего 15 минут, чтобы выполнить и, несмотря на то, технологииоснована на молекулярных методов, не требует специальной подготовки или квалификации для выполнения. Анализ гриппа А и В, оценивали в данном исследовании, имеет потенциал, чтобы служить в качестве альтернативы RIDTs для диагностики гриппа. Система имеет преимущество короткого полного времени испытания, имеет небольшой размер и проста в использовании. В целом, конструкция прибора подходит для пункта оказания медицинской помощи тестирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alere i Instrument | Alere | NAT-000 (Global), NAT-024 (US) | |
| Alere i Influenza A & B 24 Test Kit | Alere | 425-000 (Global), 425-024 (US) | |
| Alere i Barcode Scanner | Alere | EQ001001 | |
| Alere Universal Printer | Alere | 55115 (Global), alereiprinter (US) | |
| 200 µl precision pipette | |||
| 200 µl disposable pipette tips | |||
| Viral transport medium | Remel | M4-RT |
References
- Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
- Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
- Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
- Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
- Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
- Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
- Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
- Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
- Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
- Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
- Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
- van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
- Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
- Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
- Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
- Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
- Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
- Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
- Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244 (2010).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
- Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
- Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
- Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
- Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
- Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
- Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
- Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
- Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).
