Summary
Se describe un ensayo rápido, a base de molecular Influenza A y B. El ensayo detecta la influenza cada objetivo en los 15 minutos mediante el empleo de amplificación isotérmica con cebadores específicos de la influenza, seguido de la detección de objetivos con sondas de baliza molecular. El ensayo de la gripe A y B es fácil de usar y requiere práctica en un mínimo de tiempo para llevar a cabo.
Abstract
La gripe es una enfermedad respiratoria contagiosa causada por el virus de la influenza A y B en los seres humanos y causa una cantidad significativa de la morbilidad y la mortalidad cada año. La influenza A y B del ensayo fue la primera prueba rápida de la gripe molecular CLIA renunciado disponible. La prueba de la gripe A y B funciona mediante el empleo de amplificación isotérmica con cebadores específicos de la influenza, seguido de la detección de objetivos con sondas de baliza molecular. Aquí, el rendimiento de la Influenza A y el ensayo B en congelado, archivadas hisopo nasofaríngeo (NPS) muestras almacenadas en medio de transporte viral (VTM) se compararon con un ensayo de panel de respiratoria.
El rendimiento del ensayo A y B de la gripe se evaluó mediante la comparación de los resultados con el método de referencia del panel respiratorio. La sensibilidad para el virus de la gripe A fue total de 67,5% (IC del 95% (IC), 56,6-78,5) y la especificidad fue del 86,9% (IC, 71,0 a 100). Para las pruebas de virus de la gripe B, la sensibilidad y la especificidad fueron del 90,2% (IC, 68,5-100) Y 98,8% (IC, 68,5 a 100), respectivamente.
Este sistema tiene la ventaja de un tiempo de prueba significativamente más corto que cualquier otro ensayo molecular actualmente disponibles y el procedimiento simple, libre de pipeta se ejecuta en un sistema totalmente integrado, cerrado, que ocupa poco espacio. En general, la influenza A y B de ensayo evaluados en este estudio tiene el potencial de servir como una prueba de diagnóstico rápido de la influenza en el punto de atención.
Introduction
Infecciones por virus de la influenza como resultado una cantidad significativa de la morbilidad y la mortalidad cada año 1, 2, 3. La gripe sin complicaciones se caracteriza por síntomas constitucionales y respiratorias, tales como fiebre, mialgia, dolor de cabeza y tos no productiva 4, 5. Las personas mayores, niños pequeños, pacientes inmunocomprometidos y pacientes con comorbilidades subyacentes están en un mayor riesgo de sufrir complicaciones graves como neumonía, miocarditis, enfermedad del sistema nervioso central, o la muerte 6, 7.
Infección de la gripe es único de otros virus respiratorios en ese pronta administración de la terapia antiviral dentro de las 48 h del inicio de los síntomas puede reducir la gravedad de la enfermedad y la longitud 8. La identificación rápida de la gripe también ha sidodemostrado reducir el uso de antibióticos innecesarios 9, 10. Además, los pacientes hospitalizados con infecciones por influenza deben ser colocados en habitaciones aisladas con las precauciones de control de infecciones. Sin embargo, las enfermedades respiratorias causadas por virus de la gripe no pueden ser difíciles de distinguir clínicamente de la gripe. Por esta razón, las pruebas de diagnóstico rápido y preciso para la influenza es muy importante para el manejo clínico del paciente.
Varios ensayos están disponibles para la detección e identificación de virus de influenza. Pruebas de detección de antígenos de la gripe rápido (RIDT) son ampliamente utilizados en la práctica clínica como pruebas de punto de atención, ya que son fáciles de usar y proporcionan resultados dentro de 15 a 30 minutos 11, 12; Sin embargo, sus sensibilidades varían ampliamente (10-80%), dependiendo del fabricante y de la población que se está probando, y el tipo influenza y subtyPE 13, 14, 15. Ensayos de fluorescencia directa (DFA) proporcionan sensibilidades superiores sobre RIDTs, pero el tiempo de procesamiento es mayor (~ 3 h) y deben ser completado por técnicos cualificados 16, 17. El cultivo del virus ha sido el estándar de oro para el diagnóstico de la gripe y ha mejorado la sensibilidad sobre ambos RIDTs y DFA 18. Sin embargo, el cultivo del virus de la gripe puede tomar de 2-14 d para completar, lo que disminuye su utilidad en la ayuda a la gestión de pacientes 19. Por último, las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) han reemplazado a las técnicas de cultivo como el nuevo estándar de oro en el diagnóstico de la gripe. NAAT se considera que tienen la mayor sensibilidad para la detección de la gripe en un par de horas. Sin embargo, AEAC son los ensayos más caras y requieren equipos especializados y técnicos para llevar a cabo 5
El ensayo de la influenza A y B se describe aquí es la primera prueba rápida de la gripe molecular CLIA renunciado a que está fácilmente disponible. Este ensayo funciona mediante el empleo de una reacción nicking endonucleasa de amplificación (NEAR) que utiliza la amplificación isotérmica con cebadores específicos de la influenza, seguido de la detección de objetivos con sondas de baliza molecular. Este ensayo se diferencia de la gripe A de B, requiere 2 minutos para configurar y procesar una muestra, y requiere un total de 15 minutos para completar.
A continuación, presentamos el protocolo para el ensayo de influenza A y B. Además, proporcionamos un conjunto de datos de muestra comparando el rendimiento de la influenza A y B en el ensayo de frotis nasofaríngeo archivado (NPS) los especímenes almacenados en un medio de transporte viral (VTM) a otro panel de ensayo de patógenos respiratorios.
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Protocol
DECLARACIÓN DE ÉTICA: El uso de muestras clínicas está aprobado y sigue las directrices del Centro de Cáncer Junta de Revisión Institucional Kettering Memorial Sloan-por delante del izquierdo.
1. Antes de empezar el ensayo
NOTA: La influenza A y B de ensayo está aprobado para muestras de frotis nasofaríngeos y de frotis nasofaríngeo almacenados en medios de transporte viral. Los hisopos se incluyen en el kit y deben ser utilizados para un rendimiento óptimo. Sin embargo, rayón, espuma, acudieron hisopos o hisopos nasales de poliéster también se pueden utilizar para recoger muestras de hisopos nasales.
- Para recoger una muestra de exudado nasal, inserte el hisopo en la fosa nasal que tiene el drenaje más visible, o que es más congestionada. Con una rotación suave, empuje el hisopo en la fosa nasal hasta que encuentre resistencia y girar varias veces contra la pared nasal antes de retirar lentamente de la fosa nasal. Almacenar los hisopos y transportarlos en viales que contienen 3 ml de medio de transporte viral (VTM).
NOTA: La atención cuidadosa a correspondIATE recogida de muestras debe ser tomado como la recogida de muestras inadecuada puede producir resultados erróneos.
NOTA: Las muestras de torunda deben analizarse lo antes posible después de la recogida. Sin embargo, pueden ser almacenados a temperatura ambiente durante un máximo de 2 horas o refrigeradas a 2-8 ° C durante un máximo de 24 horas si la prueba no está disponible inmediatamente. muestras recién recogidas son ideales para un rendimiento óptimo del análisis. La manipulación inadecuada de la muestra, almacenamiento y / o transporte pueden dar resultados erróneos.
NOTA: Como medida de precaución, las personas que realizan esta prueba deben tratar todas las muestras como potencialmente infecciosas siguiendo las precauciones universales al manipular las muestras. - Trae todas las muestras a temperatura ambiente antes de la prueba.
NOTA: Todos los componentes de la prueba son para un solo uso y no se deben utilizar para llevar a cabo múltiples pruebas. No mezclar los componentes del kit de distintos lotes. No utilice los reactivos del kit después de la fecha de caducidad. - Llevar el receptor de la muestra azul para ROOla temperatura m antes de la prueba. La base de la prueba de naranja puede ser probado sin la necesidad de calentar a temperatura ambiente.
- Deje todas las piezas de ensayo en el envoltorio de aluminio hasta inmediatamente antes de su uso. Encienda el instrumento presionando el botón de encendido en el lateral del instrumento. Introduzca el identificador de usuario y pulse 'Aceptar'.
2. Ejecución de la prueba
- Para comenzar el proceso de prueba, toque 'Test Run' en la pantalla del instrumento. Introduzca la identificación del paciente mediante el uso de un teclado en pantalla o un escáner de código de barras y pulse 'Aceptar'. Abra la tapa e inserte la base de pruebas de Orange en el soporte de base de prueba de Orange.
- Confirmar que la prueba correcto se muestra en la pantalla y pulse 'Aceptar'. Inserte el receptor muestra azul en el soporte receptor de la muestra azul.
NOTA: No abra el receptor de la muestra antes de colocar en el instrumento ya que esto evitará que el tampón de elución de alcanzar la temperatura de funcionamiento correcto y puede afectar al rendimiento de la prueba. Espere a que el receptor de la muestra se caliente. Cuando se lo indique el instrumento, retire el sello de papel de aluminio y colocar el hisopo del paciente para ser probado en el receptor de la muestra.
NOTA: Al retirar el papel de aluminio, colocar dos dedos en el borde del receptor de ejemplo para asegurar que se mantenga en su lugar. - Mezclar vigorosamente el hisopo en el líquido durante 10 segundos, presionando la torunda contra el lado del receptor muestra, tal como lo mezclas para ayudar a desalojar la muestra de la torunda. Pulse 'OK' para proceder. Si hisopos de pruebas almacenados en medio de transporte viral, vórtice del VTM durante 10 segundos a continuación, añadir 200 l para el receptor de la muestra.
- Presione el cartucho de transferencia blanca en el receptor de la muestra azul. Continúe presionando en el receptor de la muestra hasta que el indicador naranja se eleva.
- Levantar y luego conectar el cartucho traslado a la zona de pruebas. Observe el indicador naranja descender una vez que la transferencia de cartucho está instalado correctamente. Cierre la tapa y no abra hasta que la "Prueba completa"Aparece un mensaje en la pantalla.
3. Control de Calidad
- Toque 'análisis cc Run' en la pantalla principal. Seleccione la prueba de control de calidad para ser ejecutado. Para confirmar el tipo de prueba para que coincida con la muestra de control de calidad destinada al ensayo tocando 'OK' y siguiendo las instrucciones en pantalla para completar la prueba.
Interpretación 4. Resultado
- Después de la realización de la prueba se ha completado, observar los resultados de la prueba se muestra en la pantalla con las interpretaciones de la presencia de la influenza A, B, subtipos desconocidos. Para obtener resultados válidos repita la prueba.
5. Mantenimiento y limpieza
- Limpiar el equipo, la zona de banquillo que rodea todos los días con un 70% de etanol o solución de lejía al 10%. Pulverizar la solución de limpieza en un paño sin pelusa humedecido para limpiar. No vierta las soluciones directamente en el instrumento.
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Representative Results
En este estudio, las muestras de NPS archivados se obtuvieron de pacientes que se presentan con síntomas similares a la gripe en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) durante un brote de influenza entre el 15 de diciembre de 2012 y el 1 de marzo de 2013. Las muestras de NPS se presentaron en 3 ml de VTM y probado como parte de la práctica clínica habitual con un ensayo molecular que detecta un panel de virus respiratorios (RP), incluyendo la gripe a, a-1, a-3, a y B. Durante el período de estudio, se presentaron 3.675 muestras de NPS para el laboratorio clínico MSKCC para la prueba. De esas muestras, 45, 425, 37, y 77 dieron positivo para el virus de la influenza A-1, A-3, A-un-subtypable (Au), y B, respectivamente, con el RP. Un total de 360 muestras positivas, 40 muestras de cada uno de los subtipos de gripe, y 37 UA. Además, 1-2 muestras negativas que llegaron al laboratorio inmediatamente antes o después de cada una de las muestras positivas fueron elegidos para testi posterioresng con la gripe A y B de ensayo.
En total, la influenza A y B detectan ensayo de 79 virus de Influenza A, 37 B del virus de la influenza, 240 negativos y 4 resultados no válidos (insuficiencia de los controles internos) (Tabla 1). Había 46 resultados discrepantes con 44 muestras positivas sólo en RP y dos positivos sobre la Gripe A y B solamente ensayo. Un ensayo de la gripe tercera base molecular se realizó en las 44 muestras discordantes que detectaron 33/43 (virus de la gripe A 8, 21 Au, y el virus de la gripe B 2) que fueron positivos por el RP y 0/1 positivo (virus de la gripe A) por la influenza A y B de ensayo. Un acuerdo entre dos o más ensayos se consideró una identificación precisa.
La sensibilidad global de la influenza A y B de ensayo para el virus de la gripe A fue total de 67,5% (IC del 95% (IC), 56,6-78,5). La sensibilidad para los subtipos de influenza A era A-1, 84,6% (IC, 58,5-100), A- 3, el 90,2% (IC, 62,8 a 100) y Au, el 21,9% (IC, 19,6-24,1). La especificidad general para el virus de la gripe A fue de 86,9% (CI, 71,0-100). Para la prueba de virus de la gripe B, la sensibilidad y especificidad fueron del 90,2% (IC, 68,5 a 100) y 98,8% (IC, 68,5 a 100), respectivamente.
En general, los valores medios de CT en muestras con resultados discordantes fueron significativamente mayores que los obtenidos para resultados concordantes (16,4 ± 0,48 vs. 25,7 ± 0,51; p> 0,000) (Figura 1).
Figura 1: Los valores medios de CT determinados por ensayo de RP para las muestras que fueron positivas y negativas, respectivamente mediante el ensayo para cada subtipo de influenza. Las barras de error representan la desviación estándar. **, P <0,01; *** P <0,001.1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Rendimiento de la influenza A y B en VTM especímenes en comparación con los resultados de referencia.
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Discussion
Los virus de influenza son importantes causas mundiales de morbilidad y mortalidad. El diagnóstico rápido y preciso de la gripe es una de las principales claves para manejar los brotes de gripe durante la temporada respiratoria. Otras pruebas basados en antígenos son rápidos y fáciles de realizar; sin embargo, tienen bajas sensibilidades 13. Por otra parte, las pruebas moleculares tradicionales han mejorado la sensibilidad, pero requieren técnicos de laboratorio más experimentados de realizar y son más costosos. El ensayo de la gripe A y B se describe en este estudio y el protocolo es una prueba molecular CLIA renunciado, rápida para la gripe A y B. La tecnología se basa en un isotérmica-amplificación para la detección y diferenciación de los virus de la gripe A y B. Se demuestra los resultados representativos para demostrar el rendimiento de la influenza a y B de ensayo en un panel de muestras congeladas, NPS VTM archivados se evaluó en comparación con otro ensayo del panel respiratorio base molecular.
T en ensayos de RP, lo que sugiere que la tasa de detección inferior en el ensayo se asoció con los títulos virales inferiores. El ensayo tuvo un rendimiento mejorado para la detección de virus de la gripe B en el virus de la gripe A de detección con una sensibilidad 90,2% y 98,1% de especificidad. Los resultados aquí son consistentes con la literatura publicada previamente 26, 27, 28.
Este estudio tiene dos limitaciones importantes. En primer lugar, las muestras se almacenaron en VTM para probar en la plataforma. Sin embargo, en el momento se ensayaron las muestras, la plataforma no tiene aprobación de la FDA para este tipo de muestra. Por lo tanto, la dilución en VTM, puede haber reducidola detección de muestras VTM de título bajo. En segundo lugar, las muestras que se probaron con la influenza A y B de ensayo se habían almacenado a -70 ° C durante 6 a 9 meses antes de la prueba, mientras que la prueba de RP se realizó en muestras frescas inmediatamente después de que fueron recibidos. Es posible que la congelación de las muestras reduce aún más la detección de influenza en las muestras.
La gripe A y B ensayo tiene unos pasos y es fácil de realizar. Sin embargo, hay dos pasos clave que se deben completar de manera adecuada y que los usuarios pueden solucionar si experimentan errores. En primer lugar, durante la configuración inicial del ensayo, el cartucho de transferencia debe estar conectado a la base de prueba hasta que encajen en su lugar. Si estas dos piezas no están asegurados adecuadamente, la carrera va a fallar y tendrá que repetirse desde el principio. En segundo lugar, el instrumento necesita calentarse durante 2 min antes de añadir la muestra. Después de este tiempo de calentamiento, los usuarios tienen 30 segundos para agregar la muestra, conecte la transferencia cartridge a la base de pruebas, y cierre la tapa. Si pasa el tiempo antes de que se haya completado este paso, el instrumento fallará la carrera y la muestra establecido tendrá que repetirse desde el principio.
Las limitaciones del ensayo incluyen el aumento ligeramente manos a tiempo y menor sensibilidad en comparación con el panel respiratorio y no subtipo de influenza A. Además, los únicos tipos de muestras que se pueden utilizar con el ensayo son muestras nasofaríngeas o de las fuentes de energía nuclear que se almacenan en medios de transporte viral; el rendimiento del ensayo para cualquier otro tipo de muestra, tales como muestras respiratorias inferiores, no se ha evaluado. Es importante tener en cuenta que todos los pasos de este protocolo son críticos. Cualquier modificación o desviación del protocolo tal como está escrito puede resultar en un rendimiento inferior o del ensayo y deben ser evaluados por el usuario. La ventaja de esta tecnología es que el instrumento tiene un tamaño reducido, sólo se tarda 15 minutos para llevar a cabo y, a pesar de que la tecnologíase basa en métodos moleculares, no requiere formación o cualificación especial para llevar a cabo. El ensayo de la gripe A y B evaluado en este estudio tiene el potencial de servir como una alternativa a RIDTs para el diagnóstico de la gripe. El sistema tiene la ventaja de un corto período de tiempo total de la prueba, tiene un tamaño pequeño y es fácil de usar. En general, el diseño del instrumento es adecuado para la prueba de punto de atención.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alere i Instrument | Alere | NAT-000 (Global), NAT-024 (US) | |
| Alere i Influenza A & B 24 Test Kit | Alere | 425-000 (Global), 425-024 (US) | |
| Alere i Barcode Scanner | Alere | EQ001001 | |
| Alere Universal Printer | Alere | 55115 (Global), alereiprinter (US) | |
| 200 µl precision pipette | |||
| 200 µl disposable pipette tips | |||
| Viral transport medium | Remel | M4-RT |
References
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