Summary
Descreve-se um ensaio rápido, com base molecular da gripe A e B. O ensaio detecta Influenza cada alvo dentro de 15 min, utilizando amplificação isotérmica com iniciadores específicos de influenza, seguido de detecção do alvo com as sondas farol molecular. O ensaio de Influenza A e B é de fácil utilização e necessário hands-on tempo mínimo para executar.
Abstract
A gripe é uma doença respiratória contagiosa causada por vírus da gripe A e B em seres humanos e faz com que uma quantidade significativa de morbilidade e mortalidade a cada ano. A Influenza A e B do ensaio foi o primeiro teste molecular gripe rápida dispensada-CLIA disponível. O teste de Influenza A e B funciona através do emprego de amplificação isotérmica com iniciadores específicos de influenza, seguido de detecção do alvo com as sondas farol molecular. Aqui, o desempenho do ensaio de Influenza A e B em congelado, arquivado esfregaço nasofaríngeo (NPS) amostras armazenadas no meio de transporte viral (VTM) foram comparados com um ensaio de painel respiratório.
O desempenho do ensaio de Influenza A e B foi avaliada por comparação dos resultados com o método de referência do painel respiratório. A sensibilidade para o vírus total de influenza A foi 67,5% (CI de 95% (IC), 56,6-78,5) e a especificidade foi de 86,9% (Cl, 71,0-100). Para os testes de vírus da gripe B, a sensibilidade e a especificidade foram de 90,2% (Cl, 68,5-100) E 98,8% (Cl, 68,5-100), respectivamente.
Este sistema tem a vantagem de um tempo de teste significativamente mais curto do que qualquer outro ensaio molecular actualmente disponíveis e o processo simples, livre de pipeta é executado em um sistema totalmente integrado, fechada, de pequenas dimensões. No geral, a Influenza A e B ensaio avaliada neste estudo tem o potencial de servir como um teste de diagnóstico da gripe rápida point-of-care.
Introduction
Infecções de vírus da gripe resultar em uma quantidade significativa de morbidade e mortalidade em cada ano 1, 2, 3. Influenza não complicada é caracterizada por sintomas respiratórios e constitucionais, tais como febre, mialgia, dor de cabeça e tosse não produtiva 4, 5. Os indivíduos mais velhos, crianças, doentes imunocomprometidos e pacientes com comorbidades subjacentes correm um risco maior de complicações graves, como pneumonia, miocardite, doença do sistema nervoso central, ou morte 6, 7.
Infecção por influenza é original de outros vírus respiratórios em que a administração rápida de terapêutica antiviral dentro de 48 h do início dos sintomas pode reduzir a gravidade da doença e comprimento 8. A identificação rápida da gripe, também tem sidomostrado para reduzir o uso de antibióticos desnecessários 9, 10. Além disso, pacientes hospitalizados com infecções de gripe devem ser colocados em quartos isolados com precauções de controle de infecção apropriadas. No entanto, doenças respiratórias provocadas por vírus influenza não pode ser difícil distinguir clinicamente de gripe. Por esse motivo, os testes de diagnóstico rápidos e precisos para a gripe é muito importante para a gestão clínica do paciente.
Vários ensaios estão disponíveis para a detecção e identificação dos vírus da gripe. Os testes de detecção de antígeno da gripe rápidas (RIDTs) são amplamente utilizados na prática clínica como testes point-of-care, porque eles são simples de usar e fornecer resultados dentro de 15 a 30 min 11, 12; no entanto, as suas sensibilidades variam muito (10-80%), dependendo do fabricante e da população que está sendo testado, eo tipo de gripe e subtyPE 13, 14, 15. Ensaios de fluorescência direta (DFAS) fornecem sensibilidades superiores sobre RIDTs, mas o tempo de processamento é maior (~ 3 horas) e deve ser concluída por técnicos qualificados 16, 17. A cultura viral tem sido o padrão ouro para o diagnóstico da gripe e melhorou a sensibilidade sobre ambos os RIDTs e DFAs 18. No entanto, a cultura viral influenza pode levar de 2-14 d para completar, diminuindo sua utilidade em ajudar manejo do paciente 19. Por último, os testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAAT) substituíram as técnicas de cultura como o novo padrão ouro no diagnóstico da gripe. NASC são considerados como tendo a maior sensibilidade para a detecção de gripe em poucas horas. No entanto, NASC são os ensaios mais caros e exigem equipamentos e técnicos especializados para realizar 5
O ensaio de influenza A e B aqui descrito é o primeiro teste da gripe dispensada-CLIA molecular rápida que está prontamente disponível. Este ensaio trabalha utilizando uma Reacção nicking endonuclease de amplificação (NEAR) que utiliza amplificação isotérmica com iniciadores específicos de influenza, seguido de detecção do alvo com as sondas farol molecular. Este ensaio diferencia influenza A com B, requer dois minutos para configurar e processar uma amostra, e exige um total de 15 minutos para se completar.
Aqui, apresentamos o protocolo para o ensaio Influenza A & B. Além disso, nós fornecemos um conjunto de dados de amostra definida comparando o desempenho da Influenza A e B do ensaio de swab nasofaríngeo arquivado (NPS) amostras armazenadas em meio de transporte viral (VTM) para outro ensaio painel patógeno respiratório.
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Protocol
ÉTICA DECLARAÇÃO: A utilização de sobras de amostras clínicas é aprovado e segue as diretrizes da Cancer Center Institutional Review Board Memorial Sloan Kettering.
1. Antes de realizar o teste
NOTA: O Influenza A e B do ensaio é aprovado para espécimens de esfregaço nasofaríngeo e das zaragatoas nasofaríngeas armazenados no meio de transporte viral. As mechas são incluídos no kit e deve ser usado para um desempenho óptimo. No entanto, rayon, espuma, reuniram-se cotonetes ou swab nasal de poliéster também pode ser usado para coletar amostras de swab nasal.
- Para a coleta de uma amostra de swab nasal, insira o cotonete na narina que tem a drenagem mais visível ou que é mais congestionado. Com a rotação suave, empurre a zaragatoa na narina até encontrar resistência e rodar várias vezes contra a parede nasal antes de lentamente retirar da narina. Armazenar os cotonetes e transportá-los em frascos contendo 3 ml de meio de transporte viral (VTM).
NOTA: A atenção cuidadosa para aproprcoleta de amostras iate deve ser tomado como coleta de amostra inadequada pode produzir resultados errados.
NOTA: As amostras de zaragatoa deve ser testado o mais rapidamente possível após a colheita. No entanto, elas podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante até 2 horas ou refrigerada a 2-8 ° C durante até 24 horas, se o teste não está imediatamente disponível. amostras recolhidas recentemente são ideais para o desempenho no teste ideal. O manuseio inadequado da amostra, armazenamento e / ou transporte podem produzir resultados errados.
NOTA: Como medida de precaução, os indivíduos que executam este teste deve tratar todas as amostras como potencialmente infecciosas, seguindo as precauções universais ao manusear amostras. - Trazer todas as amostras à temperatura ambiente antes do teste.
NOTA: Todos os componentes de ensaio são de uma única utilização e não deve ser utilizado para executar vários testes. Não misturar os componentes do kit de lotes diferentes. Não usar reagentes após a data de expiração. - Traga o receptor amostra azul para rootemperatura m antes do teste. A base de teste de laranja pode ser testada, sem a necessidade de aquecer até à temperatura ambiente.
- Deixe todas as peças de teste no embrulho folha até imediatamente antes da utilização. Ligue o instrumento pressionando o botão de energia no lado do instrumento. Digite o user-ID e pressione "OK".
2. A execução do teste
- Para iniciar o processo de teste, toque em "Run Test" na tela do instrumento. Digite o ID do paciente usando o teclado na tela ou scanner de código de barras e pressione "OK". Abra a tampa e insira a base de teste laranja no suporte base de teste da Orange.
- Confirmar que o teste correto é exibido na tela e pressione "OK". Insira o receptor amostra azul no suporte do receptor amostra azul.
NOTA: Não abra o receptor da amostra antes de colocar no instrumento, pois isso vai impedir que o tampão de eluição de atingir a temperatura de funcionamento correto e pode afetar o desempenho do teste. Aguarde até que o receptor de exemplo para aquecer. Quando solicitado pelo instrumento, remover o selo de alumínio e coloque o cotonete doente a ser testado para o receptor da amostra.
NOTA: Quando retirar o papel alumínio, coloque dois dedos sobre a borda do Receptor de exemplo para garantir que ele permanece no lugar. - Misture vigorosamente o cotonete no líquido durante 10 segundos, pressionando a cabeça cotonete contra a parede do receptor da amostra como você misturá-lo para ajudar a desalojar a amostra do cotonete. Pressione "OK" para prosseguir. Se o teste compressas armazenados em meio de transporte viral, vortex da VTM por 10 segundos, em seguida, adicione 200 mL para o receptor da amostra.
- Pressionar o cartucho de transferência de branco para o receptor da amostra azul. Continue pressionando no receptor da amostra até que o indicador laranja sobe.
- Levante e depois ligar o cartucho de transferência para a base de teste. Observe o indicador de laranja descer assim que a transferência cartucho está ligado corretamente. Feche a tampa e não abra até que o "Teste completo"mensagem aparece na tela.
3. Controlo de Qualidade
- Toque 'Run QC Test' na tela inicial. Selecione o teste QC a ser executado. Confirme o tipo de teste para coincidir com a amostra QC destinado a testes tocando 'OK' e seguir as instruções na tela para completar o teste.
4. Resultado Interpretação
- Após a execução do teste é completa, observar os resultados do teste apresentado no ecrã com as interpretações para a presença de Influenza A, B, subtipos desconhecidos. Para resultados inválidos repetir o teste.
5. Manutenção e Limpeza
- Limpar o aparelho e da área de banco circundante diariamente com 70% de etanol ou uma solução de lixívia a 10%. Pulverizar a solução de limpeza em um pano úmido, sem fiapos para limpar. Não deite as soluções diretamente no aparelho.
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Representative Results
Neste estudo, os espécimes NPS arquivados foram coletadas de pacientes internados com sintomas semelhantes aos da gripe no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC), durante um surto de gripe entre 15 de dezembro de 2012 e 1º de março de 2013. Os espécimes NPS foram apresentados em 3 ml da VTM e testado como parte da prática clínica de rotina com um ensaio molecular que detecta um painel de vírus respiratórios (PR), incluindo a gripe a, a-1, a-3 e B. Durante o período do estudo, 3.675 espécimes NPS foram submetidas MSKCC ao laboratório clínico para testes. Dessas amostras, 45, 425, 37, e 77 deram positivo para gripe vírus A-1, A-3, A-un-subtypable (Au), e B, respectivamente, com a RP. Um total de 360 amostras positivas, 40 amostras de cada um dos subtipos de gripe, e 37 UA. Além disso, 1-2 amostras negativas que chegaram ao laboratório imediatamente antes ou depois de cada um dos espécimes positivos foram escolhidos para posteriores testing com o influenza A e B do ensaio.
No total, a Influenza A e B ensaio detectados 79 vírus influenza A, 37 vírus influenza B, 240 negativos e 4 resultados inválidos (falha dos controles internos) (Tabela 1). Havia 46 resultados discrepantes com 44 amostras positivas em RP somente e dois positivos sobre a Influenza A e só ensaio B. Um ensaio de gripe com base molecular terceira foi realizada em 44 amostras discordantes que detectaram 33/43 (8 vírus influenza A, Au 21, e dois vírus de influenza B) que eram positivos pelo PR e 0/1 positivo (vírus da gripe A) pela Influenza a e B do ensaio. Um acordo entre duas ou mais ensaios foi considerada uma identificação precisa.
A sensibilidade global de Influenza A e B para o vírus de ensaio total de influenza A foi de 67,5% (IC de 95% (IC), 56,6-78,5). A sensibilidade para os subtipos de influenza A foi a-1, 84,6% (Cl, 58,5-100), A- 3, 90,2% (IC, 62,8-100) e Au, 21,9% (CI, 19,6-24,1). A especificidade global para o vírus influenza A foi de 86,9% (Cl, 71,0-100). Para os testes de vírus da gripe B, a sensibilidade e a especificidade foram de 90,2% (Cl, 68,5-100) e 98,8% (Cl, 68,5-100), respectivamente.
No geral, os valores médios de CT em espécimes com resultados discordantes foram significativamente maiores que os obtidos para resultados concordantes (16,4 ± 0,48 vs 25,7 ± 0,51; p> 0,000) (Figura 1).
Figura 1: Os valores médios de CT determinado por ensaio de RP para amostras que foram positivas e negativas, respectivamente, pelo ensaio para cada subtipo de influenza. As barras de erro representam o desvio padrão. **, P <0,01; ***, P <0,001.1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Desempenho da Influenza A & B na VTM espécimes comparados com os resultados de referência.
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Discussion
Os vírus da gripe são causas mundiais de morbidade e mortalidade. diagnóstico rápido e preciso da gripe é uma das principais chaves para gerir surtos de gripe durante a temporada respiratória. Outros testes à base de antigene é rápido e fácil de realizar; no entanto, eles têm baixa sensibilidade 13. Por outro lado, os testes moleculares tradicionais têm melhorado a sensibilidade, mas requerem técnicos de laboratório mais experientes para realizar e são mais dispendiosas. O ensaio de Influenza A e B descritos no presente estudo e o protocolo é um ensaio molecular dispensada-CLIA, rápido para Influenza A e B. A tecnologia baseia-se numa amplificação isotérmica-para a detecção e diferenciação dos vírus Influenza A e B. Mostramos os resultados representativos para demonstrar o desempenho da gripe a e B no ensaio de um painel de amostras de NPS VTM arquivados, congelados foi avaliada em comparação com um outro ensaio de painel respiratório de base molecular.
T em ensaios de RP, o que sugere que a taxa de detecção mais baixo pelo ensaio foi associado com os títulos virais baixos. O ensaio teve um desempenho melhorado para a detecção de vírus da gripe B ao longo de vírus da gripe A detecção com uma sensibilidade de 90,2% e especificidade de 98,1%. Os resultados aqui são consistentes com a literatura publicada previamente 26, 27, 28.
Este estudo tem duas limitações importantes. Em primeiro lugar, as amostras foram armazenadas em VTM para testar na plataforma. No entanto, no momento em que as amostras foram testadas, a plataforma não tem a aprovação da FDA para este tipo de amostra. Portanto, a diluição em VTM, pode ter reduzidoa detecção de amostras VTM de título baixo. Em segundo lugar, os espécimes que foram testados com o ensaio de Influenza A e B tinham sido armazenadas a -70 ° C durante 6 a 9 meses antes do ensaio, ao passo que o teste de RP foi feita em amostras frescas imediatamente depois de serem recebidas. É possível que o congelamento as amostras ainda mais reduzida detecção da gripe nas amostras.
O ensaio de influenza A & B tem alguns passos e é simples de executar. No entanto, existem duas principais etapas que devem ser concluídas de forma adequada e que os usuários podem solucionar problemas se ocorrer erros. Primeiro, quando configurar inicialmente o ensaio, o cartucho de transferência deve ser conectado à base de teste até que eles se encaixem no lugar. Se estas duas peças não são protegidos de forma adequada, a corrida vai falhar e terá de ser repetido desde o início. Em segundo lugar, o instrumento deve aquecer-se durante 2 min antes da adição da amostra. Após este tempo aquecer, os usuários têm 30 segundos para adicionar a amostra, conecte a transferência cartridge à base de teste, e feche a tampa. Se o tempo passa antes desta etapa é concluída, o instrumento irá falhar a execução e a amostra configurar terá que ser repetido desde o início.
As limitações do ensaio incluem um ligeiro aumento mãos no tempo e menor sensibilidade em comparação com o painel respiratório e não subtipo de influenza A. Além disso, os únicos tipos de amostras que podem ser utilizadas com o ensaio são zaragatoas da nasofaringe ou os NPS que são armazenados em meio de transporte viral; o desempenho do ensaio para qualquer outro tipo de amostra, tais como espécimes do tracto respiratório inferior, não foi avaliada. É importante observar que todos os passos descritos neste protocolo são críticos. Quaisquer modificações ou desvio do protocolo de escrita pode resultar em menor desempenho ou do ensaio e deve ser avaliado pelo usuário. A vantagem da tecnologia é que o instrumento tem uma pequena pegada, leva apenas 15 minutos para executar e, mesmo que a tecnologiaé baseado em métodos moleculares, não requer treinamento especial ou qualificações para executar. O ensaio de Influenza A e B avaliadas neste estudo tem o potencial de servir como uma alternativa à RIDTs para o diagnóstico da gripe. O sistema tem a vantagem de um tempo total de ensaio curto, tem uma pequena pegada e é fácil de usar. Em geral, o desenho do aparelho é apropriado para testes de ponto-de-cuidados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alere i Instrument | Alere | NAT-000 (Global), NAT-024 (US) | |
| Alere i Influenza A & B 24 Test Kit | Alere | 425-000 (Global), 425-024 (US) | |
| Alere i Barcode Scanner | Alere | EQ001001 | |
| Alere Universal Printer | Alere | 55115 (Global), alereiprinter (US) | |
| 200 µl precision pipette | |||
| 200 µl disposable pipette tips | |||
| Viral transport medium | Remel | M4-RT |
References
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