Summary
我々は、迅速な分子ベースのインフルエンザAおよびBアッセイを説明します。インフルエンザアッセイは分子ビーコンプローブで標的検出したインフルエンザ特異的プライマーを用いて等温増幅を用いることにより、15分以内に各ターゲットを検出します。インフルエンザAおよびBアッセイは、ユーザーフレンドリーで、実行するために最小限のハンズオン時間を必要としました。
Abstract
インフルエンザはヒトにおけるインフルエンザウイルスAおよびBに起因する伝染性の呼吸器疾患であり、毎年の罹患率および死亡率の有意な量を生じさせます。インフルエンザAおよびBアッセイは、最初CLIA-放棄分子の迅速なインフルエンザ検査が利用可能でした。インフルエンザAおよびBテストでは、分子ビーコンプローブを使用してターゲット検出したインフルエンザ特異的プライマーを用いて等温増幅を使用することによって動作します。ここでは、凍結した上でインフルエンザAの性能およびBアッセイは、呼吸器パネルアッセイと比較した試験片のウイルス輸送培地(VTM)に格納された鼻咽頭スワブ(NPS)をアーカイブしました。
インフルエンザAおよびBアッセイの性能は、呼吸パネル基準方法の結果を比較することによって評価しました。総インフルエンザウイルスAのための感度は67.5パーセント(95%CI(CI)、56.6から78.5)だった、特異度は86.9パーセント(CI、71.0から100)でした。インフルエンザウイルスBテストの場合は、感度と特異度は90.2パーセントであった(CI、68.5から100)と、それぞれ98.8パーセント(CI、68.5から100)、。
このシステムは、完全に統合された、閉じた、小さなフットプリントシステム上で実行される任意の他の現在利用可能な分子アッセイと、単純な、ピペット無手順よりも大幅に短い試験時間の利点を有しています。全体として、本研究で評価インフルエンザAおよびBアッセイは、ポイントオブケア迅速インフルエンザ診断検査として機能する可能性を有します。
Introduction
インフルエンザウイルス感染症は、罹患率および死亡率は毎年1、2、3の有意な量を生じさせます。合併症のないインフルエンザは、発熱、筋肉痛、頭痛、および非生産的な咳4、5として憲法と呼吸器症状によって特徴付けられます。高齢者、幼児、免疫不全患者、および基礎となる併存疾患を持つ患者は、肺炎、心筋炎、中枢神経系疾患、または死亡6、7などの重篤な合併症のリスクが高いです。
インフルエンザ感染は、疾患の重症度と長さ8を減らすことができ、症状の発症の48時間以内に抗ウイルス療法の迅速な投与の他の呼吸器ウイルスからユニークです。インフルエンザの迅速な同定もされています不必要な抗生物質9、10の使用を低減することが示さ。また、インフルエンザ感染症の入院患者は、適切な感染制御予防策と孤立した部屋に配置する必要があります。しかし、非インフルエンザウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患は、臨床的にインフルエンザと区別するのが困難な場合があります。この理由のため、インフルエンザのための迅速かつ正確な診断試験は、臨床患者管理のために非常に重要です。
いくつかのアッセイは、インフルエンザウイルスの検出および同定のために利用可能です。彼らは15〜30分11 12内の結果を使用して提供することが簡単であるため、迅速なインフルエンザ抗原検出試験(RIDTs)が広くポイント・オブ・ケア検査として臨床で使用されています。しかし、その感度は、製造業者およびテストされている人口、およびインフルエンザの種類とsubtyに応じて広く(百分の10から80)を変化させますPE 13、14、15。直接蛍光アッセイ(DFAS)はRIDTsよりも優れた感度を提供しますが、処理時間は大きい(〜3時間)であり、熟練した技術者16、17までに完了する必要があります。ウイルス培養は、インフルエンザ診断のゴールドスタンダードとなっており、両方RIDTsとDFAS 18以上の感度が向上しています。しかし、インフルエンザウイルス培養は、患者管理19を助けるには、その有用性を減少させる、完了するために2-14 Dからどこでも取ることができます。最後に、核酸増幅検査(NAAT)がインフルエンザ診断における新たなゴールドスタンダードとして培養技術を交換しました。 NAATは、数時間でインフルエンザを検出するための最大感度を有すると考えられます。しかし、NAATは、最も高価なアッセイであると5を実行するための特殊な装置や技術を必要とします>、20、21、22、23、24、25。
ここで説明するインフルエンザAおよびBアッセイは、容易に入手可能である第一CLIA-放棄分子の迅速なインフルエンザ検査です。このアッセイは、分子ビーコンプローブを使用してターゲット検出したインフルエンザ特異的プライマーを用いた等温増幅を使用していますニッキングエンドヌクレアーゼ増幅反応(NEAR)を使用することによって動作します。このアッセイは、BからA型インフルエンザを区別設定し、一つのサンプルを処理するために2分を必要とし、完了するまでに15分の合計が必要です。
ここでは、インフルエンザA&Bアッセイのためのプロトコルを提示します。また、我々はアーカイブされた鼻咽頭スワブにインフルエンザAの性能およびBアッセイを比較するサンプルデータセット(NPS)を提供するウイルス輸送培地(VTに格納された試験片他の呼吸器病原体パネルアッセイとM)。
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Protocol
倫理声明:左オーバー臨床検体の使用が承認され、メモリアル・スローンケタリングがんセンター施設内倫理委員会のガイドラインに準拠しています。
1.アッセイを実行する前に、
注:インフルエンザAおよびBアッセイは、鼻咽頭スワブ検体のためおよびウイルス輸送媒体に格納された鼻咽頭スワブのために承認されています。スワブは、キットに含まれており、最適なパフォーマンスを得るために使用されるべきです。しかし、レーヨン、発泡体、スワブまたはポリエステル鼻スワブは、鼻スワブサンプルを採取するために使用することができる植毛。
- 鼻腔スワブサンプルを収集するには、最も目に見える排水を持っているか、それが最も混雑している鼻孔に綿棒を挿入します。抵抗が満たされるまで穏やかに回転すると、鼻孔の中に綿棒を押し、ゆっくりと鼻孔から取り外す前に、鼻腔壁に数回回転させます。綿棒を保管し、ウイルス輸送培地(VTM)の3ミリリットルを含むバイアルでそれらを運びます。
注:approprに注意iate検体採取は、誤った結果を生じ得る不十分な検体収集として払わなければなりません。
注:スワブ検体は、採取後できるだけ早くテストする必要があります。ただし、最大2時間室温で保存するか、または検査が利用可能でない場合、最大24時間、2〜8℃で冷蔵してもよいです。採取直後の標本は、最適な試験性能に最適です。不適切な試料の取り扱い、保管、および/または輸送は、誤った結果をもたらすことができます。
注:予防措置として、このテストを実行する個人が検体を処理するときに普遍的予防策に従うことによって、潜在的に感染性として全ての検体を扱う必要があります。 - 試験前に室温にすべてのサンプルを持参してください。
注:すべての試験成分は、単一の使用のためのものであり、複数のテストを実行するために使用すべきではありません。異なるロット番号のキットの成分を混合しないでください。その有効期限を過ぎキット試薬を使用しないでください。 - カンガルーに青色のサンプル受信機を持参試験前メートル温度。オレンジテストベースを室温に温めすることなくテストすることができます。
- 使用直前まで、箔包装内のすべての試験片を残します。機器の側面にある電源ボタンを押して、機器の電源をオンにします。ユーザーIDと入力し、Enterキーを押します '[OK]を。」
2.テストの実行
- テストプロセスを開始するには、機器の画面上に「テストの実行」をタッチします。 「OK。」オンスクリーンキーボードまたはバーコードスキャナとプレスを使用して患者IDを入力してくださいふたを開けて、オレンジのテストベースホルダーにオレンジのテストベースを挿入します。
- 正しいテストが画面に表示されていることを確認し、キーを押し、「OK」。青サンプルレシーバーホルダーにブルーサンプルレシーバーを挿入します。
注:これは正しい動作温度に達するの溶出バッファーを防ぐことができますし、テストのパフォーマンスに影響を与える可能性があるとして、機器に配置する前にサンプル受信機を開けないでください。 サンプル受信機がウォームアップするのを待ちます。機器によってプロンプトが表示されたら、ホイルシールを取り外し、サンプルレシーバーに試験されるべき患者綿棒を配置します。 - 積極的にあなたは綿棒から試料を取り除く手助けするためにそれを混ぜた側面サンプル受信機に対する綿棒ヘッドを押すと、10秒間液体に綿棒を混ぜます。続行するには押して「OK」。ウイルス輸送媒体に格納された綿棒をテストする場合は、サンプルの受信機に200μlを添加する10秒間VTMをボルテックス。
- 青サンプルレシーバーに白転送カートリッジを押します。オレンジ色のインジケーターが上昇するまでサンプルレシーバーを押し続けます。
- 持ち上げ、テストベースに転送カートリッジを接続します。カートリッジ転送が正しく接続されると、オレンジ色のインジケーターを守って下ります。蓋を閉じて、「テストの完了」まで開きません画面にメッセージが表示されます。
注:ホイルを取り外すとき、それは場所にとどまることを確実にするためにサンプルレシーバーの端に2本の指を置きます。
3.品質管理
- ホーム画面上の「ファイル名を指定して実行QCテスト」をタッチします。 QCテストを選択し実行します。 「OK」をタッチすると、画面上でのテストを完了するために、プロンプトに従うだけで、テストのために意図されたQCサンプルと一致するようにテストの種類を確認してください。
4.結果の解釈
- テストの実行が完了したら、インフルエンザA、B、未知のサブタイプの存在についての解釈で画面上に表示されたテストの結果を観察。無効な結果を得るためにテストを繰り返します。
5.メンテナンスとクリーニング
- 70%エタノールまたは10%の漂白剤溶液で毎日楽器と周囲のベンチエリアを清掃してください。きれいに湿った、糸くずの出ない布に洗浄液をスプレーします。楽器に直接ソリューションをかけないでください。
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Representative Results
本研究では、NPS片をNPS片を3mlに提出された2012年12月15日と3月1日、2013年の間にインフルエンザ流行時のメモリアル・スローン・ケタリングがんセンター(MSKCC)でインフルエンザ様症状を呈した入院患者から採取したアーカイブVTMのと研究期間中にインフルエンザA、A-1、A-3、およびBを含む呼吸器ウイルス(RP)のパネルを検出する分子アッセイとの日常的な臨床実習の一環として試験、3675 NPS標本が提出されましたテストのためMSKCC臨床検査へ。これらの試験片、45、425、37、および77のそれぞれのRPで、-1、A-3、A--未subtypable金(Au)、およびBをインフルエンザ陽性と判定されたウィルス。 360陽性検体、インフルエンザサブタイプのそれぞれからの40サンプル、および37金の合計。また、直前または陽性検体のそれぞれの後に研究室に到着した1-2陰性サンプルは、その後のTESTIのために選択しましたインフルエンザAおよびBアッセイを用いてngの。
合計では、インフルエンザAおよびBアッセイは、79インフルエンザウイルスA、37インフルエンザウイルスB、240陰性、および4無効な結果(内部統制の失敗)( 表1)を検出しました。インフルエンザAおよびBのみアッセイで唯一のRPと2つの正にプラスの44サンプルと46矛盾した結果がありました。第三の分子ベースのインフルエンザアッセイは、RP及び0/1陽性(インフルエンザウイルスA)で陽性であった43分の33(8インフルエンザウイルスA、21金、及び2インフルエンザウイルスB)を検出し44不一致検体で実施しましたインフルエンザAおよびBアッセイによる。 2以上のアッセイの間の合意は、正確な同定と考えられました。
全体的にインフルエンザAおよび総インフルエンザウイルスAのためにBアッセイ感度は67.5パーセント(95%CI(CI)、56.6から78.5)でした。インフルエンザAサブタイプに対する感度は-1、84.6パーセント(CI、58.5から100)、A-ました 3、90.2パーセント(CI、62.8から100)、及びAu、21.9%(CI、19.6から24.1)。インフルエンザウイルスAのための全体的な特異性は86.9パーセント(CI、71.0から100)でした。インフルエンザウイルスBテストの場合は、感度と特異度はそれぞれ90.2パーセント(CI、68.5から100)と98.8パーセント(CI、68.5から100)でした。
( 図1)。全体的に、不一致の結果と標本の平均CT値が一致した結果(P> 0.000 16.4±0.48対25.7±0.51)について得られたものより有意に高かったです。
図1: それぞれのインフルエンザ亜型についてのアッセイにより、陽性および陰性であったサンプルについてRPアッセイで測定した平均CT値。エラーバーは標準偏差を表します。 **、P <0.01。 ***はp <0.001。1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1:参照結果と比較して、VTM標本上のインフルエンザA&Bのパフォーマンス。
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Discussion
インフルエンザウイルスは、罹患率および死亡率の重要な世界的な原因です。インフルエンザの迅速かつ正確な診断は、呼吸シーズン中にインフルエンザの大流行を管理するための主要な鍵の一つです。他の抗原ベースのテストでは、迅速かつ実行するのは簡単です。しかしながら、それらは、低い感度13を有しています。一方、伝統的な分子検査は感度を改善したが、実行し、より多くの費用がかかるために、より経験豊富な研究室の技術者を必要としています。この研究およびプロトコルに記載インフルエンザAおよびBアッセイは、技術は我々が示しインフルエンザウイルスA、Bの検出および分化のための等温増幅に基づいているインフルエンザAとBのためのCLIA-放棄、迅速な分子検査でありますアーカイブ、凍結NPS VTM試料のパネルにインフルエンザAおよびBアッセイの性能を実証するための代表的な結果は、他の分子に基づく呼吸パネルアッセイと比較して評価しました。
T値を持つ標本のために、より頻繁に観察されました。このアッセイは、インフルエンザウイルスの90.2%の感度および98.1%の特異性で検出にわたるインフルエンザウイルスBの検出のための改善された性能を有していました。ここでの結果は、28以前に公表された文献26,27と一致しています。
この研究は、2つの重要な制限があります。まず、サンプルをプラットフォーム上でテストするためのVTMに保存しました。しかし、サンプルを試験した時に、プラットフォームはこのサンプルタイプのためのFDAの承認を持っていませんでした。したがって、VTMへの希釈は、減少している可能性があり低力価VTMサンプルの検出。 RP試験は、それらが受信された直後の新鮮な標本で行ったのに対し、第二に、インフルエンザAおよびBアッセイで試験した試験片は、試験前に6〜9ヶ月間-70℃で保存されていました。標本を凍結することは、さらに試料中のインフルエンザの検出を低減することが可能です。
インフルエンザA&Bアッセイは、いくつかの手順があり、実行するのは簡単です。しかし、そこに適切に完了しなければならない二つの重要なステップであり、彼らはエラーが発生した場合、ユーザーは、トラブルシューティングを行うことができます。最初にアッセイを設定するとき、彼らは、カチッと音がするまでまず、転送カートリッジは、テストベースに接続する必要があります。この2つが適切に確保されていない場合、実行は失敗し、最初から繰り返す必要があります。第二に、機器は、前にサンプルを追加する2分間のウォームアップする必要があります。このウォームアップ時間の後、ユーザは、サンプルを追加する転送cを接続するために30秒を持っていますテストベースにartridge、蓋を閉じます。このステップが完了するまでの時間が経過すると、機器は、実行に失敗すると、セットアップサンプルが最初から繰り返さなければなりません。
アッセイの制限は少し呼吸パネルに比べて、時間と感度が低い上、手を増加し、また、インフルエンザAのサブタイプはありません、アッセイで使用することができる唯一の標本タイプは鼻咽頭スワブまたはに格納されているNPSある含めますウイルス輸送媒体;このような下気道標本などの他の試料タイプについてのアッセイの性能は、評価されていません。このプロトコルのステップのすべてが重要であることに注意することが重要です。記述されたプロトコルからのいかなる変更や偏差は低い性能にまたはアッセイの結果ことができ、ユーザによって評価されなければなりません。技術の利点は、だけでも技術かかわらず、実行するために15分を要し、、器具が小さなフットプリントを持っているということです分子的方法に基づいて、実行するために特別な訓練や資格を必要としません。本研究で評価インフルエンザAおよびBアッセイは、インフルエンザの診断のためのRIDTsの代替として機能する可能性を秘めています。システムは、短い総試験時間の利点を有する小さなフットプリントを有しており、使いやすいです。全体的に、機器の設計は、ポイントオブケア検査に適しています。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alere i Instrument | Alere | NAT-000 (Global), NAT-024 (US) | |
Alere i Influenza A & B 24 Test Kit | Alere | 425-000 (Global), 425-024 (US) | |
Alere i Barcode Scanner | Alere | EQ001001 | |
Alere Universal Printer | Alere | 55115 (Global), alereiprinter (US) | |
200 µl precision pipette | |||
200 µl disposable pipette tips | |||
Viral transport medium | Remel | M4-RT |
References
- Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
- Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
- Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
- Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
- Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
- Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
- Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
- Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
- Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
- Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
- Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
- van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
- Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
- Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
- Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
- Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
- Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
- Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
- Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244 (2010).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
- Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
- Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
- Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
- Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
- Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
- Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
- Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
- Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).