Summary
We beschrijven een snelle, moleculair-gebaseerde Influenza A en B assay. De Influenza test detecteert elk doel binnen 15 minuten door het gebruik van isotherme amplificatie met influenza-specifieke primers, gevolgd door detectie van targets met moleculaire beacon sondes. De Influenza A en B test is gebruiksvriendelijk en vereist een minimale hands-on tijd om te presteren.
Abstract
Is een besmettelijke ziekte van de luchtwegen veroorzaakt door influenzavirussen A en B bij mensen en veroorzaakt een aanzienlijke hoeveelheid van morbiditeit en mortaliteit jaarlijks. De Influenza A en B-test was de eerste-CLIA afgezien moleculaire snelle grieptest beschikbaar. Het Influenza A en B test werkt door toepassing van isotherme amplificatie met influenza-specifieke primers gevolgd door target detectie met moleculaire beacon probes. Hier zijn de prestaties van het Influenza A en B assay op bevroren, gearchiveerd nasofaryngeaal uitstrijkje (NPS) specimens opgeslagen viraal transportmedium (VTM) werden vergeleken met een respiratoire panel-assay.
De prestatie van het Influenza A en B test werd geëvalueerd door de resultaten van de luchtwegen referentiepanel methode. De gevoeligheid voor de totale influenzavirus A was 67,5% (95% CI (CI), 56,6-78,5) en de specificiteit was 86,9% (CI, 71,0-100). Voor influenzavirus B-testen, de gevoeligheid en specificiteit was 90,2% (CI, 68,5-100) En 98,8% (CI, 68,5-100), respectievelijk.
Dit heeft het voordeel van een aanzienlijk kortere testtijd dan enige andere momenteel beschikbare moleculaire assay en eenvoudige, pipet-vrije procedure uitgevoerd op een volledig geïntegreerde gesloten, kleine footprint systeem. Kortom, het Influenza A en B assay geëvalueerd in dit onderzoek heeft het potentieel om te dienen als een point-of-care influenza snelle diagnostische test.
Introduction
Influenzavirusinfecties resulteren in een significante hoeveelheid van morbiditeit en mortaliteit jaarlijks 1, 2, 3. Ongecompliceerde influenza wordt gekenmerkt door constitutionele en respiratoire symptomen zoals koorts, myalgie, hoofdpijn en niet-productieve hoest 4, 5. Oudere mensen, jonge kinderen, immuungecompromitteerde patiënten en patiënten met onderliggende comorbiditeit zijn op een hoger risico op ernstige complicaties zoals longontsteking, myocarditis, het centrale zenuwstelsel en vaatziekten, of de dood 6, 7.
Influenza-infectie is uniek ten opzichte van andere respiratoire virussen in die snelle toediening van antivirale therapie binnen 48 uur van het begin van de symptomen kan de ernst van de ziekte en de lengte 8 te verminderen. Snelle identificatie van influenza is ookaangetoond dat het gebruik van antibiotica onnodige 9, 10 te verminderen. Verder moet in het ziekenhuis opgenomen patiënten met influenza-infecties in geïsoleerde lokalen met passende infectie controle voorzorgsmaatregelen worden geplaatst. Echter, ademhalingsziekten veroorzaakt door niet-influenzavirussen moeilijk klinisch onderscheiden van influenza. Daarom, snelle en nauwkeurige diagnostische testen voor influenza van groot belang voor de klinische behandeling van de patiënt.
Verschillende assays zijn beschikbaar voor de detectie en identificatie van influenzavirussen. Rapid influenza-antigeen opsporingstests (RIDTs) worden veel gebruikt in de klinische praktijk als point-of-care testen, omdat ze zijn eenvoudig te gebruiken en zorgen voor resultaten binnen 15 tot 30 min 11, 12; echter, hun gevoeligheden variëren sterk (10-80%) afhankelijk van de fabrikant en de te testen populatie en het type influenza en subtype 13, 14, 15. Direct fluorescentie assays (DFA) bieden superieure gevoeligheden boven RIDTs, maar de doorlooptijd is groter (~ 3 uur) en moeten worden ingevuld door ervaren technici 16, 17. Viruskweek is de gouden standaard voor influenza diagnostiek en heeft gevoeligheid over zowel RIDTs en DFA 18 verbeterd. Echter, influenza viruskweek overal mee naartoe nemen 2-14 d te voltooien, het teruglopen van het nut ervan in het helpen behandeling van de patiënt 19. Tenslotte hebben nucleïnezuuramplificatie testen (NAAT) kweektechnieken vervangen als de nieuwe gouden standaard in influenza diagnostiek. NAAT worden beschouwd als de grootste gevoeligheid voor het detecteren van influenza in een paar uur te hebben. Echter, NAAT zijn de duurste assays en vereisen gespecialiseerde apparatuur en technologen uit te voeren 5
De influenza A en B-test hier beschreven is de eerste CLIA afgezien moleculaire snelle griep test die beschikbaar is. Deze test werkt door het gebruik van een knikken Endonuclease amplificatiereactie (NEAR) die isotherme amplificatie met influenza-specifieke primers, gevolgd door detectie van targets met moleculaire beacon sondes gebruikt. Deze test onderscheidt influenza A uit B, werkt op 2 minuten op te zetten en te verwerken één monster, en vereist een totaal van 15 minuten in beslag.
Hier presenteren we het protocol voor de Influenza A & B-test. Daarnaast bieden wij een sample dataset vergelijken van de prestaties van het Influenza A en B assay op gearchiveerde nasofaryngeale swab (NPS) specimens opgeslagen in viraal transportmedium (VTM) een ander respiratoir pathogeen panel-assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ETHIEK VERKLARING: Het gebruik van de linker-over klinische monsters wordt goedgekeurd en volgt de richtlijnen van het Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Review Board.
1. voordat u de Assay
Opmerking: Het Influenza A en B test is goedgekeurd voor nasofaryngeale uitstrijkjes en nasofaryngeale uitstrijkjes opgeslagen in virustransportmedia. Doekjes in de kit en moet worden gebruikt voor optimale prestaties. Echter, rayon, schuim, stroomden wattenstaafjes of polyester neusswabs kan ook worden gebruikt om monsters te neusuitstrijk.
- Om een neusuitstrijk monster te verzamelen, steek het wattenstaafje in het neusgat dat de meest zichtbare drainage heeft of dat het meest overvol. Met zachte rotatie, duw het staafje in het neusgat totdat weerstand wordt voldaan en draai een paar keer tegen de nasale muur voordat langzaam verwijderen uit het neusgat. Bewaar de swabs en vervoer ze in flacons met 3 ml virustransportmedia (VTM).
LET OP: Zorgvuldige aandacht voor KREDIETENiate specimen collectie moet worden genomen als onvoldoende specimeninzameling kan foutieve resultaten opleveren.
LET OP: Zwabber monsters moeten zo snel mogelijk worden getest nadat collectie. Zij kunnen echter worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende maximaal 2 uur en gekoeld bij 2-8 ° C gedurende maximaal 24 uur Als beproeving niet onmiddellijk beschikbaar is. Vers verzamelde exemplaren zijn ideaal voor een optimale testprestaties. Onjuiste behandeling monster, opslag en / of transport kan foutieve resultaten opleveren.
LET OP: Als voorzorgsmaatregel, moeten individuen het uitvoeren van deze test worden alle exemplaren als mogelijk infectieus door het volgen van universele voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van monsters te behandelen. - Breng alle monsters op kamertemperatuur voorafgaand aan het testen.
Opmerking: Alle testonderdelen zijn voor slechts eenmalig gebruik en dient niet te worden gebruikt om meerdere tests. Meng geen kit componenten van verschillende lotnummers. Gebruik geen kit reagentia voorbij hun vervaldatum. - Breng de blauwe monster ontvanger ROOm temperatuur voor de test. De oranje meettraject kan worden getest zonder de noodzaak opwarmen tot kamertemperatuur.
- Laat al proefstukken in de folie verpakken tot vlak voor gebruik. Zet het instrument door op de knop aan de zijkant van het instrument. Voer de gebruikers-ID in en druk op 'OK'.
2. Het uitvoeren van de test
- Om de test te starten, raakt u 'Run Test' op het scherm instrument. Geef de patiënt-ID met behulp van het toetsenbord op het scherm of barcode scanner en druk op 'OK'. Open het deksel en plaats de Oranje testbasis in de Orange testbasis houder.
- Controleer of de juiste test wordt weergegeven op het scherm en druk op 'OK'. Steek de blauwe monster ontvanger in de blauwe monster receiver houder.
NB: Laat het monster receiver niet open alvorens deze in het instrument omdat dit zal voorkomen dat de elutiebuffer van het bereiken van de juiste temperatuur en kunnen testprestaties beïnvloeden. Wacht tot het monster ontvanger om op te warmen. Wanneer u wordt gevraagd door het instrument, verwijder de folie afdichting en leg de patiënt uitstrijkje te testen in de sample-ontvanger.
LET OP: Bij het verwijderen van de folie, plaatst u twee vingers op de rand van het monster ontvanger om ervoor te zorgen dat het blijft op zijn plaats. - Krachtig mengen het staafje in de vloeistof gedurende 10 sec, het indrukken van het wattenstaafje hoofd tegen de zijkant van het monster ontvanger als het te mengen om te helpen los het monster uit het staafje. Druk op 'OK' om door te gaan. Als het testen van swabs opgeslagen in viraal transportmedium, vortex de VTM voor 10 sec voeg dan 200 ul om het monster receiver.
- Druk op de witte overdracht cartridge in de blauwe monster receiver. Blijf op op het monster ontvanger totdat de oranje indicator stijgt.
- Til en sluit vervolgens de overdracht cartridge om de test basis. Let op de oranje indicator dalen zodra de overdracht cartridge goed is bevestigd. Sluit het deksel en niet open totdat de "Test Complete"Het bericht verschijnt op het scherm.
3. Quality Control
- Raak 'Run QC Test' op het startscherm. Selecteer de QC-test worden uitgevoerd. Bevestig het type test om de QC-monster dat bestemd is voor het testen overeenkomen door op 'OK' en volg de aanwijzingen op het scherm om het testen te voltooien.
4. Resultaat Interpretatie
- Na de test is voltooid, acht de resultaten van de op het scherm met interpretaties op de aanwezigheid van Influenza A, B, onbekend subtypes testen. Voor ongeldige resultaten herhaal de test.
5. Onderhoud en reiniging
- Reinig het instrument en het omliggende gebied bank per dag met 70% ethanol of 10% bleekwater oplossing. Spuit het reinigingsmiddel op een vochtige, pluisvrije doek om schoon te maken. Niet de oplossingen direct giet op het instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie werden gearchiveerd NPS monsters verzameld van opgenomen patiënten presenteren met influenza-achtige symptomen bij Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) tijdens een influenza-uitbraak tussen 15 december 2012 en 1 maart 2013. De NPS monsters werden in 3 ml ingediend van VTM en getest als onderdeel van routinematige klinische praktijk met een moleculaire test die een panel van respiratoire virussen (RP), zoals Influenza a, a-1, a-3, en B. Gedurende de onderzoeksperiode detecteert, werden 3675 NFS monster ingediend de MSKCC klinisch laboratorium voor het testen. Van deze specimens, 45, 425, 37 en 77 positief voor influenza virussen A-1, A-3, A-un-subtypable (Au), en B, respectievelijk de RP. Een totaal van 360 positieve specimens, 40 monsters van elk van de influenza subtypes en 37 Au. Bovendien 1-2 negatieve monsters die kwamen naar het laboratorium direct voor of na elk van de positieve monsters werden gekozen voor verdere testing met influenza A en B assay.
In totaal heeft de Influenza A en B-test gedetecteerd 79 influenzavirus A, 37 influenzavirus B, 240 negatief, en 4 ongeldige resultaten (falen van interne controles) (tabel 1). Er waren 46 afwijkende resultaten met 44 positieve monsters bij slechts RP en twee positief over het Influenza A en alleen B-test. Een derde moleculaire influenza-assay werd uitgevoerd op de 44 monsters die tegenstrijdige 33/43 gedetecteerd (8 influenzavirus A, 21 Au en 2 influenzavirus B) dat door de RP 0/1 positieve (influenzavirus A) positief waren en van de A en B assay. Een overeenkomst tussen twee of meer assays werd beschouwd als een nauwkeurige identificatie.
De totale Influenza A en B assay gevoeligheid voor totale influenzavirus A was 67,5% (95% CI (CI), 56,6-78,5). De gevoeligheid voor het influenza A subtypen was A-1, 84,6% (CI, 58,5-100), A- 3, 90,2% (CI, 62,8-100), en Au, 21,9% (CI, 19,6-24,1). De algehele specificiteit van het influenzavirus A was 86,9% (BI 71,0-100). Voor influenzavirus B-testen, de gevoeligheid en specificiteit was 90,2% (CI, 68,5-100) en 98,8% (CI, 68,5-100), respectievelijk.
Kortom, de gemiddelde CT waarden exemplaren met strijdige resultaten waren significant hoger dan die verkregen voor overeenstemmende resultaten (16,4 ± 0,48 versus 25,7 ± 0,51; p> 0,000) (figuur 1).
Figuur 1: Gemiddelde CT waarden bepaald door middel van RP test voor monsters die positief en negatief waren, respectievelijk door de test voor elk subtype influenza. Fout balken geven standaarddeviatie. **, P <0,01; *** P <0,001.1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Uitvoering van de Influenza A & B op VTM specimens in vergelijking met referentie resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Influenzavirussen significante wereldwijd oorzaken van morbiditeit en mortaliteit. Snelle en nauwkeurige diagnose van influenza is een van de belangrijkste sleutels te beheren griep uitbraken tijdens respiratoire seizoen. Andere antigeen gebaseerde tests zijn snel en eenvoudig uit te voeren; echter zij lage gevoeligheden 13. Anderzijds hebben traditionele moleculaire tests verbeterde gevoeligheid, maar vereisen meer ervaren laboratoriumtechnologen te voeren en duurder. Het Influenza A en B assay in deze studie en protocol beschreven is een CLIA, snelle moleculaire test voor Influenza A en B. De technologie is gebaseerd op een isothermische amplificatie van de detectie en differentiatie van influenza virussen A en B. We tonen representatieve resultaten om de prestaties van het influenza a en B assay tonen op een paneel van gearchiveerd bevroren NPS VTM monsters werd geëvalueerd in vergelijking met andere moleculaire basis respiratoire panel-assay.
CT-waarden in RP assays, hetgeen suggereert dat de lagere detectie van de test werd geassocieerd met de lagere virale titers. De test was een verbeterde prestaties voor de detectie op influenzavirus B over influenzavirus A detectie met een gevoeligheid van 90,2% en 98,1% specificiteit. De resultaten hier zijn consistent met eerder gepubliceerde literatuur 26, 27, 28.
Deze studie heeft twee belangrijke beperkingen. Eerst werden monsters bewaard in VTM voor het testen op het platform. Echter, toen de monsters werden getest, het platform had geen FDA-goedkeuring voor dit type monster. Daarom is de verdunning in VTM, kunnen hierdoor beperktde detectie van lage titer VTM monsters. Ten tweede was de specimens getest met de Influenza A en B assay werden opgeslagen bij -70 ° C gedurende 6-9 maanden voorafgaand aan de test, terwijl de RP tests werden uitgevoerd op verse monsters onmiddellijk na ontvangst. Het is mogelijk dat het bevriezen van de specimens influenza detectie verder verminderd in de monsters.
De influenza A & B-test heeft paar stappen en is eenvoudig uit te voeren. Er zijn echter twee belangrijke stappen die op de juiste wijze moet worden ingevuld en dat gebruikers kunnen oplossen als ze last fouten. Ten eerste, als in eerste instantie het opzetten van de test, de overdracht cartridge moet worden aangesloten op de testbasis, totdat ze vastklikken. Als deze twee stukken niet op de juiste wijze zijn bevestigd, zal de run mislukken en zal moeten worden herhaald vanaf het begin. Ten tweede moet het instrument opwarmen 2 minuten voorafgaand aan het toevoegen van het monster. Na deze opwarmtijd, hebben gebruikers 30 sec aan het monster toe te voegen, sluit de overdracht cartridge om de test basis, en sluit het deksel. Als de tijd verstrijkt voordat deze stap is voltooid, zal het instrument de run mislukken en de set-up steekproef zal moeten worden herhaald vanaf het begin.
De beperkingen van de bepaling onder licht verhoogde hands-on en lagere gevoeligheid dan het paneel respiratoire en geen verdere subtype influenza A, het enige typen monsters die kunnen worden gebruikt bij de assay nasofaryngeale uitstrijkjes of NPS die worden opgeslagen virustransportmedia; de werking van de test voor een ander type specimen, zoals lagere respiratoire monsters, is niet onderzocht. Het is belangrijk op te merken dat alle stappen in dit protocol zijn van cruciaal belang. Eventuele wijzigingen of afwijking van het protocol zoals geschreven kan leiden tot lagere prestaties of van de test en moet worden beoordeeld door de gebruiker. Het voordeel van de technologie is dat het instrument heeft een kleine footprint, duurt slechts 15 minuten uit te voeren en, hoewel de technologiegebaseerd op moleculaire methoden, heeft speciale training of kwalificatie niet vereist voor de uitvoering. Het Influenza A en B assay geëvalueerd in dit onderzoek heeft het potentieel om te dienen als alternatief voor RIDTs voor de diagnose van griep. Het systeem heeft het voordeel van een korte totale testtijd, heeft een kleine voetafdruk en gemakkelijk te gebruiken. Kortom, het ontwerp van het instrument geschikt voor point of care test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alere i Instrument | Alere | NAT-000 (Global), NAT-024 (US) | |
| Alere i Influenza A & B 24 Test Kit | Alere | 425-000 (Global), 425-024 (US) | |
| Alere i Barcode Scanner | Alere | EQ001001 | |
| Alere Universal Printer | Alere | 55115 (Global), alereiprinter (US) | |
| 200 µl precision pipette | |||
| 200 µl disposable pipette tips | |||
| Viral transport medium | Remel | M4-RT |
References
- Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
- Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
- Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
- Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
- Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
- Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
- Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
- Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
- Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
- Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
- Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
- van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
- Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
- Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
- Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
- Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
- Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
- Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
- Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244 (2010).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
- Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
- Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
- Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
- Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
- Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
- Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
- Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
- Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).
