Summary
Vi beskriver en hurtig, molekylær-baserede Influenza A og B-assay. Den Influenza-analysen registrerer hvert mål inden for 15 minutter ved at ansætte isoterm forstærkning med influenza-specifikke primere efterfulgt af måldetektering med molekylære beaconprober. Den Influenza A og B-analysen er brugervenlig og krævede minimale hands-on tid til at udføre.
Abstract
Influenza er en smitsom luftvejssygdom forårsaget af influenzavirus A og B hos mennesker og forårsager en betydelig mængde af sygelighed og dødelighed hvert år. Influenza A og B assay var den første CLIA-frafaldes molekylær hurtige influenza test til rådighed. Den Influenza A og B-test virker ved at ansætte isoterm forstærkning med influenza-specifikke primere efterfulgt af måldetektering med molekylære beaconprober. Her, udførelsen af influenza A og B assay på frosne, arkiverede nasopharyngeal podepind (NPS) prøver opbevaret i viral transportmedium (VTM) blev sammenlignet med en respiratorisk panel assay.
Udførelsen af Influenza A og B-assay blev evalueret ved sammenligning af resultaterne for luftvejene panel referencemetoden. Følsomheden for total influenzavirus A var 67,5% (95% CI (CI), 56,6-78,5), og specificiteten var 86,9% (CI, 71,0-100). For influenzavirus B-test, sensitivitet og specificitet var 90,2% (CI, 68,5-100) Og 98,8% (CI, 68,5-100), hhv.
Dette system har den fordel, at en væsentlig kortere test tid end nogen anden i øjeblikket tilgængelige molekylære assay og den enkle, pipette-free procedure kører på en fuldt integreret, lukkede, små-fodaftryk system. Samlet, influenza A og B-assay evalueret i denne undersøgelse har potentiale til at tjene som en point-of-care hurtige influenza diagnostisk test.
Introduction
Influenzavirusinfektioner resultere i en betydelig mængde af sygelighed og dødelighed hvert år 1, 2, 3. Ukompliceret influenza er præget af forfatningsmæssige og respiratoriske symptomer som feber, muskelsmerter, hovedpine, og ikke-produktiv hoste 4, 5. Ældre individer, unge børn, immunsvækkede patienter og patienter med underliggende co-morbiditet er på et højere risiko for alvorlige komplikationer som lungebetændelse, myocarditis, sygdom i centralnervesystemet, eller død 6, 7.
Influenza-infektion er unik fra andre respiratoriske virus i at hurtig administration af antiviral behandling inden for 48 timer fra symptomdebut kan reducere sygdommens sværhedsgrad og længde 8. Hurtig identifikation af influenza har også væretvist sig at reducere brugen af unødvendige antibiotika 9, 10. Endvidere skal hospitalsindlagte patienter med influenza-infektioner placeres i isolerede rum med passende infektionskontrol forholdsregler. respiratoriske sygdomme forårsaget af ikke-influenzavirus, kan dog være svært at klinisk skelne fra influenza. Af denne grund, hurtig og nøjagtig diagnostisk test for influenza er meget vigtigt for den kliniske behandling patient.
Flere analyser er tilgængelige til påvisning og identifikation af influenzavirus. Rapid influenza antigen test til påvisning (RIDTs) er meget udbredt i klinisk praksis som point-of-care test, fordi de er enkle at bruge og giver resultater inden for 15 til 30 minutter 11, 12; Men deres følsomheder varierer meget (10-80%), afhængigt af producenten, og befolkningen bliver testet, og den type influenza og subtype 13, 14, 15. Direkte fluorescens assays (DFAs) giver overlegne følsomhed end RIDTs, men behandlingstiden er større (~ 3 timer), og skal være afsluttet af dygtige teknologer 16, 17. Viral kultur har været den gyldne standard for diagnostik influenza og har forbedret følsomhed over begge RIDTs og DFAs 18. Dog kan influenza viral kultur tage alt fra 2-14 d til at fuldføre, faldende dens anvendelighed i medvirken patientbehandlingen 19. Endelig har nukleinsyreamplifikationsmetoder tests (NAAT) erstattet dyrkningsteknikker som den nye guldstandard i diagnostik influenza. NAAT anses for at have den største sensitivitet til detektering influenza i et par timer. Imidlertid NAAT er de dyreste assays og kræver specialiseret udstyr og teknikere til at udføre 5
Influenza A og B assayet beskrevet her er den første CLIA-frafaldes molekylær hurtige influenza test, der er let tilgængelige. Denne analyse fungerer ved at ansætte en nicking endonuklease Amplification Reaktion (NÆR), der bruger isoterm forstærkning med influenza-specifikke primere efterfulgt af måldetektering med molekylære beaconprober. Dette assay skelner influenza A fra B, kræver 2 min at oprette og behandle en prøve, og kræver i alt 15 min at fuldføre.
Her præsenteres protokollen for Influenza A & B-analysen. Derudover giver vi en prøve datasæt sammenligner ydeevnen af influenza A og B assay på arkiveret nasopharyngeal vatpind (NPS) enheder, lagret i viral transportmedium (VTM) til en anden respiratorisk patogen panel assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ETIK ERKLÆRING: Brugen af venstre-over kliniske prøver er godkendt og følger retningslinjerne fra Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Review Board.
1. Før Kørsel af Assay
BEMÆRK: Influenza A og B-analysen er godkendt til nasopharyngeale podninger og nasopharyngeale podninger gemt i virustransportmediet. Svaberprøver er inkluderet i sættet og bør anvendes til optimal ydeevne. Men rayon, skum, strømmede, podninger eller polyester næseskrab kan også anvendes til at indsamle prøver næsepodning.
- At indsamle en vatpind prøve nasal, indsætte vatpinden ind i næseboret, der har den mest synlige dræning, eller som er mest overbelastet. Med blid rotation, skub vatpinden ind i næseboret, indtil der mødes modstand og rotere flere gange mod den nasale væggen, før langsomt fjerner fra næsebor. Opbevar podninger og transportere dem i hætteglas indeholdende 3 ml virustransportmediet (VTM).
BEMÆRK: Omhyggelig opmærksomhed approprIATE prøvetagning skal tages som utilstrækkelig prøvetagning kan give fejlagtige resultater.
BEMÆRK: podninger skal testes så hurtigt som muligt efter indsamlingen. Imidlertid kan de opbevares ved stuetemperatur i op til 2 timer eller i køleskab ved 2-8 ° C i op til 24 timer, hvis test er ikke umiddelbart tilgængelige. Frisk indsamlede prøver er ideelle for optimal test ydeevne. Forkert prøvehåndtering, opbevaring og / eller transport kan give fejlagtige resultater.
BEMÆRK: Som en forholdsregel bør personer, der udfører denne test behandle alle prøver som potentielt smittefarlige ved at følge universelle forholdsregler ved håndtering af prøver. - Bring alle prøver opnå stuetemperatur før testning.
Bemærk: Alle testkomponenter er kun en enkelt anvendelse og bør ikke anvendes til at udføre flere tests. Bland ikke kit komponenter fra forskellige lotnumre. Brug ikke reagenser efter udløbsdatoen. - Bring blå prøve modtageren til Room temperatur før testning. Den orange test basen kan testes uden behov for at varme op til stuetemperatur.
- Lad alle prøveemner i folien indpakning indtil umiddelbart før brug. Tænd for instrumentet ved at trykke på afbryderknappen på siden af instrumentet. Indtast bruger-id, og tryk på 'OK'.
2. Kørsel Test
- Til at begynde testprocessen, skal du trykke "Kør Test" på instrumentet skærmen. Indtast patientens ID ved hjælp af tastaturet på skærmen eller stregkode scanner og tryk på 'OK'. Åbn låget, og sæt den orange test basen i test bunden holderen Orange.
- Bekræft, at det korrekte test vises på skærmen, og tryk på 'OK'. Sæt den blå prøve modtageren i prøve-modtager indehaveren af det blå.
BEMÆRK: Åbn ikke prøven modtageren, før anbringelse i instrumentet, da dette vil forhindre elueringsbufferen i at nå den rette driftstemperatur og kan påvirke test ydeevne. Vent på prøven modtageren at varme op. Når du bliver bedt af instrumentet, fjern folien sæl og placere patienten vatpind, der skal testes i prøven modtager.
BEMÆRK: Når du fjerner folien, placere to fingre på kanten af Sample Receiver at sikre, at det forbliver på plads. - Kraftigt blande podepinden i væsken i 10 sekunder, tryk podepinden hoved mod siden prøven receiveren som du blande den til at hjælpe løsne prøven fra podepinden. Tryk på 'OK' for at fortsætte. Hvis testning podninger gemt i viral transportmedium, vortex VTM i 10 sekunder og derefter tilsættes 200 pi til prøven modtager.
- Tryk på hvide transfer patron i blå prøve modtager. Fortsæt med at trykke på prøven modtageren, indtil den orange indikator stiger.
- Løft og tilslut derefter overførslen patron på prøve base. Overhold den orange indikator ned når patronen overførslen er knyttet korrekt. Luk låget og ikke åbne indtil "Test Complete"vises på skærmen.
3. Kvalitetskontrol
- Tryk 'Kør QC test' på startskærmen. Vælg QC Test til at blive kørt. Bekræft test typen til at matche QC prøve til test ved at trykke på 'OK' og efter på skærmen for at fuldføre test.
4. Resultat Fortolkning
- Efter testkørslen er færdig, observere resultaterne af den vises på skærmen med fortolkninger for forekomsten af Influenza A, B, ukendte undertyper test. For ugyldige resultater gentage testen.
5. Vedligeholdelse og rengøring
- Rengør instrumentet og det omkringliggende bænk område dagligt med 70% ethanol eller 10% blegemiddel løsning. Spray rengøringsmiddel på en fugtig, fnugfri klud til at rengøre. Hæld ikke løsningerne direkte på instrumentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse blev arkiveret NPS prøver indsamlet fra indlagte præsenterer med influenzalignende symptomer på Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) under en influenza udbrud fra december 15, 2012 og 1. marts 2013. NPS prøver blev indgivet i 3 ml af VTM og testet som en del af rutinemæssig klinisk praksis med en molekylær analyse, som påviser et panel af respiratoriske vira (RP), herunder Influenza a, a-1, a-3, og B. i undersøgelsesperioden blev 3.675 NPS eksemplarer blev indleveret til MSKCC kliniske laboratorium til test. Af disse prøver, 45, 425, 37, og 77 testet positiv for influenza virus A-1, A-3, A-un-subtypable (Au), og B, henholdsvis med RP. I alt 360 positive prøver, 40 prøver fra hver af influenza-subtype, og 37 Au. Derudover blev 1-2 negative prøver, der ankom til laboratoriet umiddelbart før eller efter hvert af de positive prøver er valgt til efterfølgende testing med influenza A og B-assay.
I alt Influenza A og B assay opdaget 79 influenzavirus A, 37 influenzavirus B, 240 negativ, og 4 ugyldige resultater (manglende interne kontroller) (tabel 1). Der var 46 afvigende resultater med 44 prøver positive på RP kun og to positive på Influenza A og kun B-analysen. En tredje molekylær-baseret influenza assay blev udført på de 44 diskordante enheder, der har konstateret 33/43 (8 influenzavirus A, 21 Au, og 2 influenzavirus B), der var positive ved RP og 0/1 positive (influenzavirus A) af influenza A og B-assay. En aftale mellem to eller flere analyser blev betragtet som en præcis identifikation.
Den overordnede Influenza A og B-assay følsomhed for total influenzavirus A var 67,5% (95% CI (CI), 56,6-78,5). Følsomheden for influenza A subtyper var A-1, 84,6% (Cl, 58,5-100), A- 3, 90,2% (CI, 62,8-100), og Au, 21,9% (CI, 19,6-24,1). Den samlede specificitet for influenzavirus A var 86,9% (Cl, 71,0-100). For influenzavirus B-test, sensitivitet og specificitet var 90,2% (CI, 68,5-100) og 98,8% (CI, 68,5-100), hhv.
Samlet set var de gennemsnitlige Ct-værdier i prøver med uoverensstemmende resultater var signifikant højere end dem opnået for overensstemmende resultater (16,4 ± 0,48 versus 25,7 ± 0,51; p> 0,000) (figur 1).
Figur 1: Gennemsnitlig CT-værdier bestemt ved RP-assay for prøver, der var positive og negative, henholdsvis assayet for hver influenza subtype. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse. **, P <0,01; ***, P <0,001.1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Resultat af Influenza A & B på VTM eksemplarer i forhold til reference- resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Influenzavirus er betydelige verdensomspændende årsager til sygelighed og dødelighed. Hurtig og nøjagtig diagnose af influenza er en af de vigtigste nøgler til at styre influenza udbrud i løbet af respiratorisk sæson. Andre antigen-baserede tests er hurtige og lette at udføre; men de har lave følsomheder 13. På den anden side har de traditionelle molekylære test forbedret følsomhed, men kræver mere erfarne laboratorie teknologer at udføre og er dyrere. Influenza A og B-assay beskrevet i denne undersøgelse, og protokollen er en CLIA-frafaldes, hurtig molekylær test for influenza A og B. Teknologien er baseret på en isoterm-amplifikation til påvisning og differentiering af influenzavirus A og B. Vi viser repræsentative resultater for at demonstrere effektiviteten af influenza a og B assay på et panel af arkiveret, frosne NPS VTM prøver blev evalueret i forhold til en anden molekylær-baseret respiratorisk panel assay.
C-værdierne i RP-assays, hvilket antyder, at den lavere påvisningsrate af assayet var forbundet med de nederste virustitere. Analysen havde en forbedret ydeevne til påvisning på influenzavirus B over influenzavirus A detektion med en 90,2% følsomhed og 98,1% specificitet. Resultaterne her er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte litteratur 26, 27, 28.
Denne undersøgelse har to vigtige begrænsninger. Først blev prøverne opbevaret i VTM til afprøvning på platformen. Men på det tidspunkt prøverne blev testet, platformen afse FDA godkendelse for denne prøvetype. Derfor fortyndingen i VTM, kan have reduceretpåvisning af lav-titer VTM prøver. For det andet havde de enheder, som er testet med Influenza A og B assay været opbevaret ved -70 ° C i 6 til 9 måneder før testning mens RP test blev udført på friske prøver umiddelbart efter de blev modtaget. Det er muligt, at fryse prøverne yderligere reduceret påvisning influenza i prøverne.
Influenza A & B assay har få trin og er enkel at udføre. Men der er to vigtige skridt, der skal udfyldes korrekt og at brugerne kan foretage fejlfinding, hvis de oplever fejl. Først, når første opsætning af analysen, overførsel patron skal tilsluttes på prøve basen, indtil de klikker på plads. Hvis disse to stykker ikke er sikret korrekt, vil kørslen mislykkes og skal gentages fra begyndelsen. For det andet, at instrumentet skal varme op i 2 min før tilsætning af prøven. Efter denne varme op tid, brugerne har 30 sek for at tilføje prøven, tilslut overførslen cartridge på prøve base, og luk låget. Hvis tiden går, før dette trin er fuldført, vil instrumentet mislykkes kørslen og prøven oprettet skal gentages fra begyndelsen.
Begrænsningerne i assayet indbefatter let forøget hands-on tid og mindre følsomhed sammenlignet med den respiratoriske panel og ikke undertype influenza A. Endvidere er de eneste prøvetyper, der kan anvendes med assayet er nasopharyngeale podninger eller NPS der er gemt i virustransportmediet; udførelsen af assayet for enhver anden prøvetype, såsom lavere luftvejsprøver, er ikke blevet evalueret. Det er vigtigt at bemærke, at alle trin i denne protokol er kritiske. Eventuelle ændringer eller afvigelser fra protokollen som skrevet, kan resultere i lavere ydelse eller af analysen og skal vurderes af brugeren. Fordelen ved teknologien er, at instrumentet har en lille fodaftryk, tager kun 15 min at udføre og, selv om teknologiener baseret på molekylære metoder, der ikke kræver særlig uddannelse eller kvalifikationer til at udføre. Influenza A og B-assay evalueret i denne undersøgelse har potentiale til at tjene som et alternativ til RIDTs til diagnosticering af influenza. Systemet har den fordel, en kort samlet prøvetid, har et lille fodaftryk og er nem at bruge. Samlet er udformningen af instrumentet er egnet til point-of-care test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alere i Instrument | Alere | NAT-000 (Global), NAT-024 (US) | |
| Alere i Influenza A & B 24 Test Kit | Alere | 425-000 (Global), 425-024 (US) | |
| Alere i Barcode Scanner | Alere | EQ001001 | |
| Alere Universal Printer | Alere | 55115 (Global), alereiprinter (US) | |
| 200 µl precision pipette | |||
| 200 µl disposable pipette tips | |||
| Viral transport medium | Remel | M4-RT |
References
- Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
- Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
- Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
- Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
- Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
- Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
- Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
- Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
- Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
- Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
- Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
- van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
- Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
- Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
- Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
- Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
- Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
- Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
- Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244 (2010).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
- Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
- Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
- Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
- Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
- Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
- Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
- Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
- Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).
