Summary
Vi beskriver ett snabbt, molekylbaserade Influensa A och B-analysen. Influensa analys detekterar varje mål inom 15 minuter genom att använda isotermisk förstärkning med influensaspecifika primers följt av ekopresentation med molekylära beacon-prober. Influensa A och B-analysen är användarvänligt och kräver minimal praktisk tid att utföra.
Abstract
Influensa är en smittsam respiratorisk sjukdom orsakad av influensavirus A och B hos människor och orsakar en betydande mängd av sjuklighet och dödlighet för varje år. Influensa A och B-analysen var den första CLIA-frångås molekyl snabba influensatest tillgängligt. Influensa A och B-test fungerar genom att använda isotermisk förstärkning med influensaspecifika primers följt av ekopresentation med molekylära beacon-prober. Här, utförandet av influensa A och B-analys på frusen, arkiveras nasofarynxpinne (NPS) prover lagras i virustransportmedium (VTM) jämfördes med en andnings panel analys.
Utförandet av influensa A och B-analysen utvärderades genom att jämföra resultaten för andningspanelen referensmetoden. Känsligheten för total influensavirus A var 67,5% (95% CI (CI), 56,6-78,5) och specificiteten var 86,9% (CI, 71,0-100). För influensavirus B-testning, känsligheten och specificiteten var 90,2% (CI, 68,5-100) Och 98,8% (CI, 68,5-100), respektive.
Detta system har fördelen av en betydligt kortare testtid än någon annan tillgänglig molekylär analys och enkel, pipett fritt förfarande körs på en helt integrerad, stängd, små fotavtryck systemet. Sammantaget influensa A och B-analysen utvärderades i denna studie har potential att fungera som en point-of-care snabb influensa diagnostiskt test.
Introduction
Influensavirusinfektioner resultera i en betydande mängd morbiditet och mortalitet varje år ett, två, tre. Okomplicerad influensa kännetecknas av konstitutionella och luftvägssymtom som feber, myalgi, huvudvärk, och icke-produktiv hosta fyra, fem. Äldre personer, barn, patienter med nedsatt immunförsvar och patienter med underliggande sjukdomstillstånd löper större risk för allvarliga komplikationer såsom lunginflammation, myokardit, centrala nervsystemet sjukdom eller död 6, 7.
Influensainfektion är unik från andra luftvägsvirus i att snabbt administrering av antiviral terapi inom 48 timmar från symtomdebut kan minska sjukdomens svårighetsgrad och längd 8. Snabb identifiering av influensa har också varitvisat att minska användningen av onödiga antibiotika 9, 10. Vidare måste inneliggande patienter med influensainfektioner placeras i isolerade rum med lämpliga försiktighetsåtgärder för infektionskontroll. Emellertid kan luftvägssjukdomar orsakade av virus icke-influensa vara svårt att kliniskt skilja från influensa. Av denna anledning är det mycket viktigt för klinisk behandling av patienten snabb och noggrann diagnostiska tester för influensa.
Flera analyser finns tillgängliga för detektion och identifiering av influensavirus. Snabba influensaantigen detektionstester (RIDTs) används allmänt i klinisk praxis som point-of-care test, därför att de är enkla att använda och ger resultat inom 15 till 30 min 11, 12; Men deras känslighet varierar kraftigt (10-80%) beroende på tillverkaren och befolkningen som testas, och influensa typ och subtype 13, 14, 15. Direkt fluorescensanalyser (DFAS) ger överlägsna känslighet över RIDTs, men bearbetningstiden är större (~ 3 h) och måste kompletteras med skickliga tekniker 16, 17. Viral kultur har varit den gyllene standarden för diagnostik influensa och har förbättrad känslighet över både RIDTs och DFAs 18. Däremot kan influensa virusodling ta allt från 2 till 14 d för att slutföra, vilket minskar dess användbarhet i medhjälp patienthantering 19. Slutligen har nukleinsyraamplifikationsteknik tester (NAAT) ersattes odlingstekniker som den nya guldstandarden i diagnostik influensa. NAAT anses ha störst känslighet för detektering av influensa i ett par timmar. Men NAAT är de dyraste analyserna och kräver specialutrustning och tekniker för att utföra 5
Influensa A och B-analysen som beskrivs här är den första CLIA-avstått molekylär snabbinfluensatest som är lätt tillgängliga. Denna analys fungerar genom att använda en hack endonukleas amplifieringsreaktion (nära) som använder isotermisk förstärkning med influensaspecifika primers följt av ekopresentation med molekylära beacon-prober. Denna analys skiljer influensa A från B, kräver två minuter för att ställa upp och bearbeta ett prov, och kräver totalt 15 minuter att slutföra.
Här presenterar vi protokollet för influensa A och B-analys. Dessutom ger vi ett prov datauppsättning jämföra prestandan hos influensa A och B analys på arkiverade nasofarynxpinne (NPS) exemplar lagras i virustransportmedium (VTM) till en annan andnings patogen panel analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ETIK ANALYS: Användningen av överblivna kliniska prover är godkänd och följer riktlinjerna i Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Review Board.
1. innan du kör analys
OBS: Influensa A och B-analysen är godkänd för nasofaryngeala pinnprover och för nasofarynxpinnar lagras i virustransportmedia. Kompresser ingår i satsen och bör användas för optimal prestanda. Emellertid, rayon, skum, flockade bomullstoppar eller polyesternasalprovtagningspinnar kan också användas för att samla nasala pinnprover.
- För att samla en nasal bomullstopp prov, sätt in pinnen i näsborren som har den mest synliga dränering eller som är mest överbelastade. Med varsam rotation trycker pinnen i näsborren tills motståndet är uppfyllt och rotera flera gånger mot nasal väggen innan sakta tar bort från näsborren. Förvara kompresser och transportera dem i ampuller innehållande 3 ml viral transportmedia (VTM).
OBS: Noggrann uppmärksamhet på approprIate provtagning måste tas som otillräcklig provtagning kan ge felaktiga resultat.
OBS: Pinnprover ska testas så snart som möjligt efter provtagningen. De kan dock förvaras i rumstemperatur i upp till två timmar eller i kylskåp vid 2-8 ° C i upp till 24 timmar om testning inte är omedelbart tillgänglig. Nyligen insamlade prover är idealiska för optimal testa prestanda. Felaktig provhantering, lagring och / eller transport kan ge felaktiga resultat.
OBS: Som en försiktighetsåtgärd, bör enskilda som utför detta test behandla alla prover som potentiellt smittsamma genom att följa universella försiktighetsåtgärder vid hantering av prover. - Ta alla prover till rumstemperatur före testning.
OBS: Alla testkomponenter är för en enda användning och bör inte användas för att utföra flera tester. Blanda inte kit komponenter från olika lotnummer. Använd inte reagenser förbi deras utgångsdatum. - Ta den blå provmottagaren att Room temperatur före testning. Den orange testbas kan testas utan att behöva värmas upp till rumstemperatur.
- Låt alla provbitar i folieomslaget förrän omedelbart före användning. Slå på instrumentet genom att trycka på strömbrytaren på sidan av instrumentet. Ange användar-id och tryck på "OK".
2. Köra testet
- Till att börja testprocessen trycker "Kör test" på instrumentskärmen. Ange patient-ID med hjälp av tangentbordet eller streckkodsläsaren och tryck på skärmen "OK". Öppna locket och sätt i Orange testbas i Orange testbas hållare.
- Kontrollera att rätt testet visas på skärmen och tryck på "OK". Sätt den blå provmottagaren i det blå provmottagaren hållaren.
OBS: Öppna inte provmottagaren innan de placeras i instrumentet, eftersom detta kommer att förhindra elueringsbufferten från att nå rätt arbetstemperatur och kan påverka testa prestanda. Vänta tills provmottagaren för att värma upp. När du uppmanas av instrumentet, ta bort folien sigill och placera patienten pinnen som ska testas i provmottagaren.
OBS: När du tar bort folien, placera två fingrar på kanten av provmottagaren för att säkerställa att det sitter på plats. - Kraftfullt blanda pinnen i vätskan under 10 sekunder, trycker på pinnen huvudet mot sidan provmottagaren som du blandar det att hjälpa rubba provet från pinnen. Tryck på "OK" för att fortsätta. Om testpinnar som lagras i virustransportmedium, virvel VTM under 10 sekunder sedan lägga till 200 l till provmottagaren.
- Tryck på den vita överföringskassetten i blå provmottagaren. Fortsätt att trycka på prov mottagaren tills den orange indikatorn stiger.
- Lyft och anslut sedan överföringskassetten till testbasen. Observera den orange indikatorn ner när patronen överföringen är korrekt ansluten. Stäng locket och öppnar inte förrän "Test Complete"visas på skärmen.
3. Kvalitetskontroll
- Tryck på "Kör QC-test" på startskärmen. Välj QC-test som ska köras. Bekräfta testtyp att matcha QC prov som är avsett för testning genom att trycka på "OK" och efter på skärmen för att slutföra tester.
4. Resultat Tolkning
- Efter testkörningen är klar, observera resultatet av testet visas på skärmen med tolkningar för förekomst av influensa A, B, okända subtyper. För ogiltiga resultat upprepa testet.
5. Underhåll och rengöring
- Rengör instrumentet och det omgivande bänken området dagligen med 70% etanol eller 10% blekmedel. Spraya rengöringslösning på en fuktig, luddfri trasa för att rengöra. Häll inte lösningarna direkt på instrumentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie arkiverade NPS prover som samlats in från inneliggande patienter som uppvisar influensaliknande symtom vid Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) under ett influensautbrott mellan December 15, 2012 och den 1 mars 2013. NPS proverna lämnats i 3 ml av VTM och testas som en del av rutinmässig klinisk praxis med en molekylär analys som detekterar en panel av respiratoriska virus (RP), inklusive influensa A, A-1, A-3, och B. Under studieperioden var 3,675 NPS prover lämnats till MSKCC kliniska laboratoriet för undersökning. Av dessa prover, 45, 425, 37, och 77 testade positivt för Influensavirus A-1, A-3, A-un-subtypable (Au), och B, respektive med RP. Totalt 360 positiva prover, 40 prover från var och en av undertyperna influensa, och 37 Au. Dessutom har 1-2 negativa prover som kom till laboratoriet omedelbart före eller efter varje positiva prover som valts för efterföljande testing med influensa A och B-analysen.
Totalt influensa A och B-analysen detekterades 79 influensavirus A, 37 influensavirus B, 240 negativ, och 4 ogiltiga resultat (fel i den interna kontrollen) (tabell 1). Det fanns 46 avvikande resultat med 44 prover positivt på bara RP och två positiva om influensa A och B-analysen bara. En tredje influenza assay molekylbaserade utfördes på de 44 disharmoniska exemplar som upptäckts 33/43 (8 influensavirus A, 21 Au, och två influensavirus B) som var positiva genom RP och 0/1 positiva (influensavirus A) av influensa A och B-analysen. Ett avtal mellan två eller flera analyser ansågs en noggrann identifiering.
Den totala Influensa A och B analyskänslighet för total influensavirus A var 67,5% (95% CI (CI), 56,6-78,5). Känsligheten för influensa A-subtyperna var A-1, 84,6% (Cl, 58,5-100), A- 3, 90,2% (CI, 62,8-100) och Au, 21,9% (CI, 19,6-24,1). Den totala specificiteten för influensavirus A var 86,9% (Cl, 71,0-100). För influensavirus B-testning, känsligheten och specificiteten var 90,2% (CI, 68,5-100) och 98,8% (CI, 68,5-100), respektive.
Sammantaget de genomsnittliga CT-värdena i prover med överensstämmande resultat var betydligt högre än de som erhölls för samstämmiga resultat (16,4 ± 0,48 vs. 25,7 ± 0,51; p> 0,000) (Figur 1).
Figur 1: Genomsnittlig CT-värden bestäms genom RP-analys för prover som var positiva och negativa, respektive av analysen för varje influensa subtyp. Felstaplar representerar standardavvikelsen. **, P <0,01; ***, P <0,001.1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Prestanda för influensa A och B på VTM exemplar jämfört med referens resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Influensavirus är betydande globala orsaker till sjuklighet och dödlighet. Snabb och korrekt diagnos av influensa är en av de viktigaste nycklarna till att hantera influensautbrott under andnings säsong. Andra antigenbaserade tester är snabba och lätta att utföra; Men, de har låga känsligheter 13. Å andra sidan har de traditionella molecular test förbättrad känslighet, men kräver mer erfarna laboratorie tekniker att utföra och är dyrare. Influensa A och B-analys som beskrivs i denna studie och protokoll är en CLIA-frångås, snabb molekylär test för influensa A och B. Tekniken bygger på en isotermisk-förstärkning för detektering och differentiering av influensavirus A och B. Vi visar representativa resultat för att demonstrera prestanda hos influensa A och B-analys på en panel av arkiverade, frysta NPS VTM prover utvärderades jämfört med en annan respiratorisk panel assay molekylbaserade.
T-värden i RP-analyser, vilket tyder på att den lägre detektionshastigheten av analysen var associerad med de lägre virala titrar. Analysen hade en förbättrad prestanda för detektering på influensavirus B över influensavirus A detektion med en 90,2% sensitivitet och 98,1% specificitet. Resultaten här överensstämmer med tidigare publicerade litteratur 26, 27, 28.
Denna studie har två viktiga begränsningar. Först togs prover lagrades i VTM för att testa på plattformen. Men vid tiden proverna testades, plattformen hade inte FDA-godkännande för denna provtyp. Därför utspädning i VTM har kan minskasdetektion av låg titer VTM prover. För det andra hade de prover som testades med influensa A och B analys lagrats vid -70 ° C under 6 till 9 månader före testning medan RP testning gjordes på färska prover direkt efter att de togs emot. Det är möjligt att frysa proverna reduceras ytterligare detekterings influensa i proverna.
Influensa A & B-analysen har några steg och är enkel att utföra. Det finns dock två viktiga steg som måste slutföras på lämpligt sätt och att användare kan felsöka om de upplever fel. Först när först inrätta analysen överföringskassetten måste anslutas till testbasen tills de klickar på plats. Om dessa två bitar som inte är säkrade på lämpligt sätt, kommer körningen att misslyckas och kommer att behöva tas om från början. För det andra måste instrumentet värmas upp i två minuter före tillsats av provet. Efter denna uppvärmningstid, användare har 30 sekunder att lägga provet ansluter överförings cartridge till testbasen, och stäng locket. Om tiden före detta steg är klar kommer instrumentet misslyckas körningen och provet inrättas måste tas om från början.
Begränsningarna i analysen inkluderar ökat något hands-on tid och lägre känslighet jämfört med andnings panelen och inte subtyp influensa A. Vidare är de enda provtyper som kan användas med analysen är nasofarynxpinnar eller NPS som är lagrade i virustransportmedia; utförandet av analysen för varje annan provtyp, såsom lägre luftvägsprover, har inte utvärderats. Det är viktigt att notera att alla steg i detta protokoll är kritiska. Eventuella ändringar eller avvikelser från protokollet som skrivet kan resultera i lägre prestanda eller analysen och skall bedömas av användaren. Fördelen med tekniken är att instrumentet har ett litet fotavtryck, tar bara 15 minuter att utföra, och även om teknikengrundar sig på molekylära metoder, inte kräver särskild utbildning eller kompetens att utföra. Influensa A och B-analysen utvärderades i denna studie har potential att tjäna som ett alternativ till RIDTs för diagnos av influensa. Systemet har fördelen av en kort total provtid, har ett litet fotavtryck och är lätt att använda. Totalt sett är lämplig för point-of-care testning utformningen av instrumentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alere i Instrument | Alere | NAT-000 (Global), NAT-024 (US) | |
| Alere i Influenza A & B 24 Test Kit | Alere | 425-000 (Global), 425-024 (US) | |
| Alere i Barcode Scanner | Alere | EQ001001 | |
| Alere Universal Printer | Alere | 55115 (Global), alereiprinter (US) | |
| 200 µl precision pipette | |||
| 200 µl disposable pipette tips | |||
| Viral transport medium | Remel | M4-RT |
References
- Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
- Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
- Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
- Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
- Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
- Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
- Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
- Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
- Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
- Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
- Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
- van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
- Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
- Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
- Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
- Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
- Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
- Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
- Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244 (2010).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
- Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
- Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
- Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
- Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
- Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
- Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
- Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
- Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).
