Introduction
وجود قيود على HIV-1 العلاجات الحالية هو أنها يجب أن تدار بشكل مزمن لمنع تطور المرض. زرع HIV-1 مقاومة T اللمفاوية، أو الخلايا الجذعية المكونة للدم، لديه القدرة على توفير مراقبة طويلة المدى من فيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها في غياب العلاج بالعقاقير 1،2 و قد يكون أيضا نهج فعال لتحقيق لعلاج HIV-1 3. طريقة واحدة لجعل خلايا مقاومة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها هي لادخال واحد أو أكثر من الجينات الترميز لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا أو الببتيدات إلى خلايا الفرد المصاب خلال زرع ذاتي 4. وقد صممت مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الجينات العديد من مرشح مع بعض التجارب السريرية التي تدخل في مجموعات من اثنين أو ثلاثة 5 6، لمنع تطور HIV-1 مقاومة أي جين واحد.
مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا هي من بين أكبر المرشحين للالجمع بين العلاج الجيني نظرا لقدرة منخفضة على الحصول على ردود المناعة ولأنهموكتب من تسلسل الجينات قصيرة جدا. وقد صممت بعض مضادات HIV-1 الرنا لاستهداف دخول الفيروس والتكامل. ومع ذلك، فإن معظم لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا تستهدف خطوات ما بعد التكامل في دورة حياة الفيروس (الشكل 1). وتشمل مثبطات بعد التكامل الرنا شرك، واستهداف HIV-1 البروتينات التنظيمية تات أو القس 1، والرنا القائم على العقاقير استهدفت مواقع مختلفة في HIV-1 الحمض النووي الريبي، مثل الريبوزيمات 7، 8 shRNAs وU1i الرنا 9. وتشمل الأساليب التي استخدمت لمقارنة فعالية مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1-الرنا رصد تكاثر الفيروس في الخلايا transduced مع جينات ترميز لالرنا مرشح وقياس الانتاج الفيروسية في الخلايا transfected عابر مع البلازميدات التعبير عن الرنا مرشح والتعبير البلازميد HIV-1 10 -13. لقد كانت تستخدم في السابق لإنتاج فحص HIV-1 لفحص HIV-1 الحمض النووي الريبي للمواقع المستهدفة إنزيم الحمض النووي الريبوزي جديد 13-15. ومنذ ذلك الحين تم تنقيح هذه الأساليب لتحسين شكل من RNAتدخل جزيء أعرب عن البلازميد باعتبارها shRNA أو تسليمها باعتبارها سيرنا الاصطناعية (16). الفحص يقيس إنتاج الفيروسات الناضجة من خلايا 293T الإنسان الكلى الجنينية (كلوة)، ويمكن استخدامها لمقارنة آثار مثبطات التي تستهدف الخطوات في مرحلة ما بعد الاندماج في دورة النسخ المتماثل HIV-1 (الشكل 1). لمثبطات التي تستهدف خطوات ما قبل الاندماج، وهناك حاجة إلى فحوصات بديلة مثل-تزم BL خلية العدوى فحص 17 لتقييم فعالية المضادة للفيروسات.
وتشمل مخاوف تتعلق بالسلامة الرئيسية لإيصال مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا في العيادة المحتملة الآثار بعيدا عن الهدف على الرنا أو البروتينات الإنسان، وتفعيل أجهزة الاستشعار المناعية الفطرية. لتقييم سمية مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرناوات siRNAs، وقد استخدمنا مقايسة بقاء الخلية في خطوط مختلفة من الخلايا 16. نحن أيضا قياس تفعيل مزدوجة أجهزة الاستشعار المناعة الحمض النووي الريبي RNA، RNA تنشيط بروتين كيناز R (PKR) وتول مثل مستقبلات 3 (TLR3)، فضلا عن السابقالضغط وللفيروسات تحفيز الجينات، P150 ADAR1. هذه المقايسات يمكن استخدامها للتأكد من فعالية لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا لا يرجع إلى الآثار غير المباشرة على بقاء الخلية أو تفعيل جهاز الاستشعار المناعي. كما أنها مفيدة في استبعاد الرنا مرشح مع سمية محتملة من مزيد من التطوير.
في البروتوكولات التالية، الإجراءات الخاصة بتحديد الرنا علاجية جديدة وتحسين توصف شكل القائمة. طرق مفيدة لفحص الحمض النووي الريبي تستند مثبطات بعد دمج HIV-1 تكرارها ويمكن تكييفها لفحص مثبطات بعد التكامل الأخرى، مثل الجزيئات الصغيرة التي تستهدف القس تصدير بوساطة من الحمض النووي الريبي الفيروسي 18 أو كريسبر / نظم كاس مصممة لاستهداف متكامل HIV-1 الحمض النووي (19).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خلايا وتعداء
- ثقافة خلايا كلوة 293T في المتوسط النسر تعديل Dulbecco و(DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. إعداد تعليق 2 × 10 5 خلية / مل في مستنبت الخلية. إضافة 500 و 100 و 1000 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل بئر من 24-جيدا، 96-جيدا و12-جيدا لوحات، لإنتاج الفيروسي، وبقاء الخلية والمقايسات تفعيل جهاز المناعة، على التوالي (الشكل 2A).
- دوامة بلطف لوحات واحتضان لهم O / N عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تنمو الخلايا إلى 50-70٪ confluency.
- وفقا لخطة ترنسفكأيشن، وإعداد التخفيفات من الرنا اختبار وضوابطها في 1.5 أنابيب متناهية الصغر مل (مثال، الشكل 2B).
- لفحص الانتاج الفيروسية، وإعداد 10 نانوغرام / ميكرولتر التخفيف من تعبير البلازميد HIV-1 وإضافة 10 ميكرولتر إلى كل أنبوب. بجانب إعداد 5 ميكرومتر التخفيفات من الرنا اختبار ومراقبة RN سلبيA. اضافة 2.5 أو 10 ميكرولتر من كل RNA اختبار ومراقبة تخفيف السلبي للأنابيب المقابلة لمدة 25 أو 100 تركيزات النهائي نانومتر.
- من أجل بقاء فحص الخلية، وإعداد 5 ميكرومتر التخفيفات من الرنا اختبار و 10 ملغ / مل تخفيف من الحمض النووي الريبي السيطرة إيجابي، وانخفاض الوزن الجزيئي بولي الأول: C. إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي اختبار أو إيجابية التخفيفات السيطرة RNA للأنابيب الموافق ل 100 نيوتن متر أو 200 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، على التوالي.
- لتفعيل الفحص المناعي، إضافة 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي اختبار أو التخفيفات RNA مراقبة إيجابية أعدت في الخطوة 1.3.2. للأنابيب الموافق ل 100 نيوتن متر أو 200 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، على التوالي.
ملاحظة: للحصول على البلازميدات التعبير اختبار الحمض النووي الريبي، وإعداد 10 نانوغرام / التخفيفات ميكرولتر بدلا من 5 ميكرومتر التخفيفات من الرنا اختبار، وإعطاء كميات النهائية بين 25 و 100 نانوغرام للخطوة 1.3.1. و 100 نانوغرام لخطوات 1.3.2. و1.3.3.
- إضافة 50، 25 أو 75 ميكرولتر من DMEM إلى كل أنبوب ترنسفكأيشن للهمز الفيروسيuction، بقاء الخلية والمقايسات تفعيل جهاز المناعة، على التوالي. لفحوصات الإنتاج الفيروسية، وجلب الخلايا وأنابيب ترنسفكأيشن مستعدة ل3 (BSL3) مختبر مستوى السلامة الحيوية قبل الخطوة التالية.
- إضافة 2 ميكرولتر من بالتتابع ترنسفكأيشن كاشف للأنابيب ترنسفكأيشن واحتضان 15-20 دقيقة للسماح المجمعات لتشكيل. انظر جدول المواد للكاشف ترنسفكأيشن محددة لاستخدامها.
- يضاف خليط ترنسفكأيشن كامل من كل أنبوب الصغير الإفلات من الحكمة أن المواقف المقابلة في لوحات ثقافة الخلية. دوامة بلطف واحتضان لوحات لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- قياس (القسم 2) HIV-1 الإنتاج، وبقاء الخلية (المادة 3)، وتنشيط جهاز المناعة (القسم 4) في لوحات ثقافة الخلية (الشكل 2C).
2. فحص الإنتاج الفيروسية
- إزالة 24 لوحات جيدا ثقافة خلية من الحاضنة ودوامة بلطف لوحات داخل خلية ثقافة BSL3الغطاء. نقل 150 ميكرولتر من طاف من كل بئر إلى المقابلة بشكل جيد في أسفل لوحة 96-جيدا مسطحة، والتي سوف تستخدم لقياس إنتاج HIV-1.
ملاحظة: وتشتمل هذه المقايسات الكمي الفيروسي قياس التعبير عن بروتين قفيصة HIV-1 (P24) بواسطة انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) 20، قياس RNA الفيروسي عن طريق النسخ العكسي تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-PCR) 21 وقياس النشاط الإنزيم RT HIV-1. الخطوات 2،2-2،5 شرح أساليب لقياس HIV-1 النشاط RT 13،15،16. - نقل 5 ميكرولتر من طاف إلى الآبار المقابلة في لوحة 96-جيدا، التي تحتوي على 25 ميكرولتر من تعطل الفيروسي كوكتيل 15 (الجدول 1). احتضان الخليط لمدة 5 دقائق على RT ونقل لوحة إلى محطة عمل النشاط الإشعاعي.
ملاحظة: الخطوة 2.2. هو ضروري فقط إذا كان محطة العمل الإشعاعي غير متوفر في المختبر BSL3. إذا كانت لوحات لا بد من إزالتها منBSL3 المختبر، انتقل إلى الخطوة 2.3. وإضافة 50 ميكرولتر من الإشعاعي / الفيروسية اختلال كوكتيل (الجدول 1) بدلا من 25 ميكرولتر من الكوكتيل المشعة. - إعداد المشع كوكتيل 15 (الجدول 1)، وإضافة 25 ميكرولتر من كل بئر من طاف الفيروسي وكوكتيل انقطاع. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- بقعة 5 ميكرولتر من خليط التفاعل على الساحات المقابلة في الألياف الزجاجية دي الأثيل الأمينية الإيثيلي (DEAE) ورقة filtermat والسماح للبقع لتجف لمدة 10 دقيقة. بقعة خليط التفاعل على كل مربع آخر بحيث لا العينتين الحدود مباشرة بعضها البعض. وهذا يساعد على تجنب انتقال أكثر من بين العينات عند تحديد التهم لكل دقيقة (CPM) في الخطوة 2.6.
- غسل أوراق 5X لمدة 5 دقائق مع العازلة 2X المالحة سيترات الصوديوم (SSC) (الجدول 1)، تليها اثنين 1 يغسل دقيقة مع 95٪ من الإيثانول. السماح للأوراق حتى يجف وختم لهم في أكياس عينة.
- كليب أكياس عينة التعاونntaining ورقة filtermat إلى الكاسيت وإدراج الكاسيت في عداد صفيحة التلألؤ. تعيين العداد لقراءة نسخة في الدقيقة 32 P مع التاريخ المرجعي ينص على دفعة من [32 ف] dTTP المستخدمة في التجربة. تحديد أي عينات لقراءة باستخدام خريطة لوحة وبدء العداد.
- للحصول على أي طريقة القياس الكمي الفيروسي، وتقسيم القيم التي تم الحصول عليها عن كل RNA اختبار بواسطة جهاز التحكم السلبية المجاورة وتتضاعف هذه القيمة 100 للحصول على تثبيط في المئة من إنتاج HIV-1 عن كل تكرار من الرنا الاختبار. وتقدم مثالا على النتائج مقارنة الرنا اختبار مختلفة بتركيزات مختلفة في الشكل (3).
3. خلية الجدوى الفحص
- إزالة لوحات 96-جيدا من الحاضنة وإضافة 20 ميكرولتر من 5 ملغ / مل الإنتقالي العسكري (3- [4.5-ثنائي ميثيل-2-thiazolyl] بروميد -2،5-ثنائي-2H-نتروبلو) المخفف في الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco و( DPBS) إلى كل بئر. احتضان لوحات وأو 3 ساعة على 37 درجة مئوية.
- إضافة 150 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المحمضة مع المنظفات (1٪ NP-40، 4 ملم حمض الهيدروكلوريك في الأيسوبروبانول) إلى كل بئر واحتضان لوحات لمدة 2 ساعة على RT.
- تحديد الامتصاصية في 570 نانومتر في معمل صفيحة.
- حساب التمثيل الغذائي الإنتقالي العسكري النسبي لكل عنصر تحكم واختبار الحمض النووي الريبي إيجابي بقسمة القيمة التي تم الحصول عليها لكل عينة من سيطرتها ترنسفكأيشن المجاورة. وقدمت مثالا على النتائج مقارنة الرنا الاختبار المختلفة، ومراقبة إيجابية في الشكل (4).
4. المناعي تفعيل الفحص
- إزالة لوحات 12-جيدا من الحاضنة ونضح وسائل الإعلام الثقافة. يغسل بلطف الخلايا مرتين مع DPBS وإضافة 70 ميكرولتر من العازلة تحلل الباردة 22 (بما في ذلك البروتيني والفوسفاتيز مثبطات، الجدول 1) إلى كل بئر. احتضان لوحات لمدة 10 دقيقة على الجليد.
- نقل لست] الخلية لأنابيب متناهية الصغر وتجميدها بسرعة بغمرالأنابيب في النيتروجين السائل. السماح للعينات لذوبان الجليد وكرر لمدة 2 دورات تجميد ذوبان الجليد ليصبح المجموع 3.
- الطرد المركزي لست] لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، 15700 x ج، لتكوير الحطام الخلية. طاف لنقل أنابيب متناهية الصغر جديدة وتحديد تركيز البروتين باستخدام طريقة Coomassie الأزرق (برادفورد) 23،24.
- حل 75 ميكروغرام من البروتين من كل عينة في 10٪ تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد ونقل إلى غشاء النيتروسليلوز كما هو موضح سابقا 25،26.
- بعد الكهربائي ونقل إلى غشاء، تكشف عن عصابات بروتين التي يحتضنها الغشاء في الشقائقية S (الجدول 1) لمدة 1 دقيقة تليها الغسيل في الماء المقطر مزدوجة. استخدام الموجات وسلم البروتين كدليل لقطع الغشاء في 80 و 55 كيلو دالتون.
ملاحظة: في خطوة يمكن تشغيل 4.4 العينات على 16 × 18 سم 2 المواد الهلامية وصولا إلى 34 كيلو دالتون، بحيث يكون من السهل قطع الغشاء في مواقف محددة، وليس من خلال خفضعصابات من الفائدة. بدلا من ذلك، يمكن تشغيل عدة المواد الهلامية مع نفس العينات لتجنب قطع الغشاء. - تغسل تلطيخ الشقائقية S مع مخزنة المالحة تريس التي تحتوي على 0.05٪ توين 20 (TBST، الجدول 1). إضافة TBST مع 5٪ الحليب الخالي من الدسم لتغطية كامل الأغشية. احتضان الأغشية في RT مع الانفعالات لمدة 1 ساعة.
- احتضان الأغشية O / N في TBST مع 3٪ زلال المصل البقري (BSA) والأجسام المضادة المخفف إلى 1 في 1000 ضد ADAR1 (110 و 150 كيلو دالتون)، الفوسفات، PKR (62 كيلو دالتون)، والفوسفات، IRF3 (47 كيلو دالتون)، لقطع رأس والمتوسطة والسفلية للغشاء، على التوالي.
- غسل الأغشية 5X لمدة 5 دقائق مع TBST واحتضان في TBST مع 5٪ الحليب الخالي من الدسم والماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية المسمى البيروكسيديز (المخفف إلى 1 في 5000) لمدة 1 ساعة.
- غسل الأغشية 5X لمدة 5 دقائق مع TBST وتطبيق electrochemiluminescence (ECL) حل لتصور العصابات على الأفلام وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- بعد تصور العصابات البروتين على الأفلام، وغسل القطع المتوسطة والسفلية من الغشاء لمدة 10 دقيقة مع الحل الضد تجريد. احتضان الأغشية O / N في TBST مع 3٪ BSA والأجسام المضادة ضد مجموع PKR (في 1 في 500) وIRF3 (في 1 في 1000)، للوسط وقطع أسفل، على التوالي. كرر الخطوات من 4.8. و 4.9. باستخدام المسمى البيروكسيديز الماعز المضادة للماوس في مكان الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرنب لغشاء PKR (وسط).
- غسل أسفل قطعة من 5X غشاء لمدة 5 دقائق مع TBST واحتضان الغشاء في TBST مع 3٪ BSA لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة ضد الأكتين (المخفف إلى 1 في 5000). كرر الخطوات من 4.8. و 4.9. باستخدام المسمى البيروكسيديز الماعز المضادة للماوس في مكان الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرنب. وتقدم مثالا على النتائج مقارنة الرنا الاختبار المختلفة، ومراقبة إيجابية في الشكل (5) انظر جدول المواد للأجسام مضادة محددة لاستخدامها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد التخطيطي العام للإجراءات في الشكل 2 مع خطة ترنسفكأيشن سبيل المثال لمدة ثلاثة الرنا اختبار والحمض النووي الريبي الرقابة المنصوص في الشكل 2B. لفحوصات الإنتاج وبقاء الخلية الفيروسية، والتدريجي قراءة لكل بناء الاختبار هو تطبيع للسيطرة سلبية. و transfected مكررات في مجموعات، بحيث يتم تطبيع كل RNA اختبار لسيطرتها السلبية المجاورة. ويتم ذلك لتجنب عدم دقة البيانات المتعلقة الوقت بين كومبليكسينج وترنسفكأيشن، مما قد يؤدي إذا، على سبيل المثال، كافة عناصر التحكم السلبية و transfected أولا. منذ HIV-1 يمكن أن تؤثر على الاستجابات المناعية 27،28، تتم على بقاء الخلية والمقايسات تفعيل المناعة بدون إضافة أي HIV-1 معربا عن البلازميد.
لتحديد طول الأمثل للجزيئات تدخل الحمض النووي الريبي استهداف موقع المحفوظة في HIV-1 الحمض النووي الريبي (موقف 1498-141519 في HIV-1 سلالة NL4-3) 13، وقد صممت مجموعة من الرناوات siRNAs (الشكل 3A). عن طريق إنتاج فحص HIV-1، (خطايا) تم حساب في المئة من النشاط RT مقارنة مع خلايا transfected مع المقامر طويلة الركيزة هراء سيرنا للخلايا transfected مع كل سيرنا اختبار في كميات مختلفة من شارك في ترنسفكأيشن مع 100 نانوغرام من البلازميد معربا عن HIV-1 سلالة NL4-3 (الشكل 3B).
باستخدام مقايسة بقاء الخلية، تم تحديد عملية التمثيل الغذائي في المئة من الإنتقالي العسكري للخلايا transfected مع الرناوات siRNAs الأكثر فعالية التي تم تحديدها في الشكل 3B. تم تطبيع البيانات لعملية التمثيل الغذائي الإنتقالي العسكري في الخلايا تعامل مع كاشف ترنسفكأيشن وحدها (الشكل 4). وطويلة RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (بولي الأول: C) تخفيض بقاء الخلية. ومع ذلك، كان تأثير كبير فقط على أعلى جرعة تقييمها. وقد لوحظ حدوث انخفاض كبير في بقاء الخلية لالرناوات siRNAs استهداف سي 1498 الشركة المصرية للاتصالات في HIV-1 الحمض النووي الريبي، بغض النظر عن طولها. باستخدام الفحص تنشيط جهاز المناعة، وجرى تقييم لنفس المجموعة من الرنا لقدرتها على تحريك الاستجابات المناعية (الشكل 5). في الظروف التي يكون فيها بولي الأول: C المنشط التعبير عن P150 ADAR1 والفسفرة التي يسببها روبية وIRF3، أي تأثير كبير على علامات تنشيط جهاز المناعة ويمكن ملاحظة لأي من الرنا الاختبار.
يتم عرض الشكل 1. رسم تخطيطي للخطوات السابقة واللاحقة لالتكامل في دورة النسخ المتماثل HIV-1. قبل التكامل (1-3) وبعد التكامل (4-7) خطوات في دورة النسخ المتماثل HIV-1 في صناديق المبين . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54486 / 54486fig2.jpg "/>
الشكل 2. تخطيطي الانتاج الفيروسية، بقاء الخلية والمقايسات تفعيل جهاز المناعة. (A) لوحة الخلايا الملتصقة والثقافة لمدة 24 ساعة. ومطلي الخلايا في 24-، 96- و12- لوحات جيدة في 500 و 100 و 1000 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية لإنتاج الفيروسي، وبقاء الخلية والمقايسات تفعيل جهاز المناعة، على التوالي. (ب) إعداد أنابيب ترنسفكأيشن، وخلايا transfect، والثقافة لمدة 48 ساعة. ويرد خطة المثال ترنسفكأيشن لمجموعة من ثلاثة الرنا اختبار (RNA1-3) مع الضوابط المناسبة. ويتضح أيضا إجراء ترنسفكأيشن. (C) للقراءة بها. والتدريجي قراءة لإنتاج الفيروسي، وبقاء الخلية والمقايسات تفعيل المناعة مكتوبة وشرح بالتفصيل في الفروع 2 و 3 و 4 على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </ P>
الشكل 3. تأثير الرناوات siRNAs اختبار على إنتاج HIV-1. (A) تصميم الرناوات siRNAs مع أطوال والتماثلات مختلفة. تم استخدام تسلسل المحفوظة في HIV-1 الحمض النووي الريبي (1498 الموقع المستهدف) لتصميم الرناوات siRNAs متناظرة وغير متناظرة (si1498-) بأطوال مختلفة (17-29 مسارات النوكليوتيدات معنى). بمعنى المتوقع (أعلى، الأسود) والعقاقير (القاع والأحمر) يشار إلى فروع. (ب) تثبيط إنتاج HIV-1 من المتغيرات طول si1498. وأظهرت تثبيط النسبة المئوية (٪) من HIV-1 النشاط RT في طاف من الخلايا HEK293T transfected مع المتغيرات طول si1498 متناظرة أو غير متناظرة النسبي لفترة طويلة المقامر الركيزة هراء سيرنا (الخطايا). وتمت مقارنة كل RNA اختبار لخطايا بجرعات مختلفة في اثنين على الأقل تعداء مستقل مع 2-3 مكررات. البيانات هي EXPRإسيد القيم المتوسطة كما ± الوسائل الخطأ القياسية (محترفو التسويق عبر محركات). تم تعديل هذا الرقم من 16، الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. تأثير طول si1498 المتغيرات على بقاء الخلية و transfected الخلايا HEK293T مع بولي الأول: ج في 50 و 200 ميكروغرام / مل (PIC50 وPIC200) وأطوال مختلفة وأشكال si1498 في 100 نانومتر. تم تحديد عملية الأيض٪ من الإنتقالي العسكري النسبي إلى الخلايا تعامل مع كاشف ترنسفكأيشن وحدها (موك، M) في ثلاثة تعداء مستقل مع 2-3 مكررات. يتم التعبير عن البيانات كما القيم يعني ± محترفو التسويق عبر محركات. واستخدمت تي اختبارات الطلاب أونبايريد لتحديد ما إذا كان تعداء significantl مختلفةص (*، P <0.05) انخفاض بقاء الخلية بالنسبة للخلايا وهمية transfected. تم تعديل هذا الرقم من 16، الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تأثير طول si1498 المتغيرات على الاستجابات المناعية الفطرية. و transfected الخلايا HEK293T مع PIC50، PIC200 وأطوال وأشكال si1498 في 100 نانومتر مختلفة. تم تقييم تفعيل PKR وTLR3 عن طريق قياس PKR فسفرته وIRF3، على التوالي. تم تقييم التعبير عن الإنترفيرون حفز الجين (ISG) عن طريق قياس P150 ISG ADAR1 المستويات النسبية للمتغير أعرب جوهري، P110 ADAR1. تم استخدام تعبير عن الأكتين كعنصر تحكم التحميل. هذه شملت رقمتم تعديل البريد من 16، الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم العازلة / الكاشف | تركيب |
| الفيروسي كوكتيل انقطاع | 60 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.8)، 75 ملي بوكل، 5 ملي MgCl 2، 1.04 ملي EDTA، 1٪ NP-40. |
| كوكتيل المشعة | 60 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.8)، 75 ملي بوكل، 5 ملي MgCl 2، 1.04 ملي EDTA، 10 ميكروغرام / مل بولي (A)، 0.33 ميكروغرام / مل بنسبة ضئيلة DT. وأضاف مباشرة قبل الاستعمال: 8 ملي dithiothreitol (DTT، C 4 H 10 O 2 S 2) و 5 ميكرولتر [32 ف] dTTP (3000 تسى / مليمول) لكل 500 ميكرولتر من الكوكتيل. |
| المشع / الفيروسي كوكتيل انقطاع | 60 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.8)، 75 ملي بوكل، 5 ملي MgCl 2، 1.04 ملي EDTA، 0.1٪ NP-40، 5 ميكروغرام / مل بولي (A)، 0.16 ميكروغرام / بنسبة ضئيلة مل DT. وأضاف مباشرة قبل الاستعمال: 8 ملي dithiothreitol (DTT، C 4 H 10 O 2 S 2) و 5 ميكرولتر [32 ف] dTTP (3000 تسى / ملمول) لكل 1 مل من الكوكتيل. |
| 2X SSC | 17.53 غرام من كلوريد الصوديوم و 8.82 جم سترات الصوديوم - 2H 2 O في 1 LH 2 O. |
| تحلل العازلة | 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4)، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي EDTA (من 0.5 م، ودرجة الحموضة 8.0)، و 10٪ الجلسرين ت / ت، 1٪ ت / ت NP-40. |
| الشقائقية S | 2.5 غرام الشقائقية S و 5 مل حمض الخليك في 500 مل H 2 O. |
| TBST 6.05 ز تريس، 8.76 جم كلوريد الصوديوم و 1 مل توين 20 في 1 LH 2 O. |
يتم توفير مكونات المخازن المؤقتة غير التجارية والكواشف وصفات لجميع المخازن غير التجارية والكواشف: الجدول 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تنفيذ إنتاج فحص HIV-1 صفها باستخدام خلايا HEK293T (الشكل 2) ومشابه لفحوصات المستخدمة لفحص HIV-1 الحمض النووي الريبي لإنزيم الحمض النووي الريبوزي فعال 13، shRNA 10،29، سيرنا 30، وU1i RNA مواقع 11،31 الهدف. باستخدام أساليب مختلفة لتحديد إنتاج HIV-1، وقياس معظم الدراسات الانتاج الفيروسية 48 ساعة بعد شارك في ترنسفكأيشن تعبير البلازميد HIV-1 مع الرنا مرشح. بعد إنتاج HIV-1، virions غير الناضجة تخضع انشقاق بروتين من polyproteins من قبل البروتيني HIV-1 لتصبح virions ناضجة، القادرة على إصابة خلايا جديدة. لHIV-1 فحص RT نشاط انزيم هو موضح في الخطوات 2.2. 2.5.، يتم تقييم كل من الإنتاج والخطوات النضج، منذ إنزيم RT نشطا فقط في virions ناضجة. في المقابل، فإن البروتين قفيصة وRNA الفيروسي قد تكون موجودة في كل virions ناضجة وغير ناضجة. لذلك، قياس إنتاج HIV-1 من قبل P24 ELISA أو RT-PCR معبد المنعم يوسف يغيب عن آثار الرنا العلاجية التي تعمل على خطوة نضوج دورة النسخ المتماثل HIV-1، مثل الريبوزيمات أن توطين إلى HIV-1 virions 32 والجزيئات القائم على العقاقير التي تحول دون معالجة الكمامة بالإضافة إلى HIV-1 بروتين التعبير 13، 31. وجود قيود على فحوصات الإنتاج الفيروسية هو أن الخلايا المستخدمة لا تعبر عن مستقبلات المناسبة لدخول HIV-1 والتي لا يمكن استخدامها لتقييم آثار الرنا العلاجية على HIV-1 دخول أو الاندماج.
لتقييم تأثيراته المضادة HIV-1-الرنا على دورة النسخ المتماثل بأكملها، وقد استخدمت نماذج مختلفة HIV-1 العدوى في مختلف خطوط الخلايا التائية اللمفاوية أو خلايا الدم الأولية 5،33. وبما أن هذه خطوط الخلايا صعبة ل transfect، المزيد من العمل أساليب مكثفة مثل الإدراج الجين ناقلات lentiviral أو أبتمر / الاقتران الببتيد ضرورية لتوفير كميات كافية من مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا لمراقبة التأثيرات على HIV-1 النسخ المتماثل. هذا التحديد يجعل من ديfficult مقارنة بسرعة العلاقة بين الهيكل والنشاط بين المتغيرات من معين لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الحمض النووي الريبي أو إجراء فحص على نطاق واسع لتحديد موقع الهدف الأمثل لفئات جديدة من العداء للHIV-1 الرنا. في حين فحوصات الإنتاج الفيروسية كانت مفيدة لتحديد الجزيئات المضادة للفيروس نقص المناعة البشرية-1 الحمض النووي الريبي جديدة، ونماذج الخلوية بديلة في خطوط الخلايا transfected بسهولة أن دعم HIV-1 تكرار مثل تزم-BL الخلايا، ستكون مفيدة لفحص مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا تستهدف خطوات أخرى في دورة النسخ المتماثل، مثل الدخول والتكامل.
اعتمادا على فئة من مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الحمض النووي الريبي، وقد وصفت العديد من الآليات المحتملة السمية. على سبيل المثال، قد يكون الرنا القائم على العقاقير بعيدا عن الهدف التأثيرات على الرنا الخلوية التي تحتوي على نفسه أو تسلسل مشابه لموقع الهدف المقصود في HIV-1 الحمض النووي الريبي. وبالمثل، الأبتامرات RNA، على غرار عنصر استجابة عبر تفعيل (القطران) أو عنصر استجابة القس (RRE)، يمكن أن تؤثر على وظيفة العلاقات العامة الخلويةoteins، مثل البروتين ملزمة تقرير التقييم الثالث الحمض النووي الريبي (TRBP) 34. shRNAs والرناوات siRNAs لديها القدرة وأضاف أن تؤثر على مسار تدخل الحمض النووي الريبي عزل البروتينات رني 35 وبعض الجزيئات U1i وقد ثبت أن تؤثر على الربط وتجهيز الرنا الخلوية عن طريق عزل البروتينات من U1 صغير النووي RNA-بروتين معقد 36. في حين أن بعض هذه الآثار يمكن التقليل من تصميم دقيق، قياسات سمية الخلوية في الشاشات لجزيئات جديدة لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الحمض النووي الريبي مفيدة في استبعاد الجزيئات مع احتمال الآثار بعيدا عن الهدف من مزيد من التطوير. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الآثار بعيدا عن الهدف تمنع بشكل غير مباشر إنتاج HIV-1، مما يجعل سمية الخلوية معيار مهم في التحقق من فعالية جديدة لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1-الجزيئات التي تم تحديدها من شاشات HIV-1 الإنتاج.
مقايسة بقاء الخلية هو موضح في الخطوات 3.1. 3.4. هو الاختلاف من فحص القياسية التي استخدمت لفحص جزيء مضاد للفيروسات متنوعة ق 37. الفحص يقيس نشاط NAD الإنزيمات الخلوية (P) H-تعتمد للحد من كاشف الإنتقالي العسكري لشكل الأرجواني غير قابلة للذوبان في، formazan. ويتم تكييف البروتوكول من الأساليب التي نشرت سابقا 38 والعديد من مجموعات متوفرة باستخدام الإنتقالي العسكري أو غيرها من المواد الكيميائية ترتبط ارتباطا وثيقا. في حين أنه من المهم لفحص سلامة الخلية في خط الخلية المستخدمة لفحص مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1-الرنا، وتجدر الإشارة إلى أن خطوط مختلفة من الخلايا تختلف في حساسيتها تجاه سمية الناجم عن الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال، رينولدز وآخرون أظهرت أن المقامر الرناوات siRNAs الركيزة لم يكن لها تأثير على بقاء الخلية في الخلايا HEK293T، ولكن انخفاض كبير في بقاء الخلية MCF7، DU145 وهيلا S3 خلايا 39. للمقايسة الموصوفة هنا، يتم استخدام خلايا HEK293T كمثال (الشكل 4). ومع ذلك، كما تم القيام به نفس الفحص في خلايا MCF7 لتقييم السمية المحتملة في خط الخلية التي هي أكثر حساسية للمشاريع الصغيرة التي يسببها RNA سمية 16.
e_content "> منذ مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا لا يمكن معالجتها وعرضها على جهاز المناعة التكيفية، فهي تعتبر أقل مناعة مقارنة المضادة HIV-1-البروتينات أو الببتيدات. ومع ذلك، اعتمادا على تسلسل أو هيكل، فإنها يمكن أن تثير الفطرية وقد تم تحديد الاستجابات المناعية، وعدد من أجهزة الاستشعار المناعة ومسارات إشارات يمكن أن تستجيب لالرنا الصغيرة (التي استعرضت في 40). في مقايسة تنشيط جهاز المناعة وصفها هنا، وتمت مقارنة مستويات PKR فسفرته وIRF3 في الخلايا transfected مع الرنا الصغيرة باعتبارها مؤشر روبية أو TLR3 التنشيط، على التوالي. هي كل أجهزة الاستشعار RNA موجودة في مجموعة واسعة من خطوط الخلايا وتفعيلها يمكن أن تؤدي إلى إنتاج نوع 1 إنترفيرون، وذلك في حالة روبية، وهو الغلق في الترجمة. لتقييم القدرة على مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1-الرنا لتنشيط إنتاج نوع 1 إنترفيرون من خلال مسارات بديلة، وتمت مقارنة أيضا مستويات الجين ADAR1 حفز الانترفيرون (P150) في الخلايا transfected معمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا. كما يتبين من الآثار المترتبة على الرنا المزدوج الجديلة مراقبة إيجابية طويلة، بولي الأول: C، كل هذه الردود كانت نشطة في خلايا HEK293T (الشكل 5) وشوهدت آثار مماثلة في خلايا MCF7 16. وبما أن هذه الردود يمكن أن تمنع إنتاج HIV-1 في عدم وجود آثار على بقاء الخلية، ويوفر تفعيل الفحص المناعي التحقق من صحة إضافي لفعالية جديدة لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا. وتشمل القياسات الأخرى التي يمكن أن تضاف إلى هذا التقييم قياس إنتاج السيتوكينات الالتهابية واكتب 1 إنترفيرون في طاف ثقافة الخلية، وقياس التعبير عن المزيد من الجينات حفز مضاد للفيروسات. منذ الخلايا المستهدفة بفيروس نقص المناعة البشرية مثل CD4 + T الخلايا والضامة قد التعبير عن مستويات مختلفة من أجهزة الاستشعار المناعة الفطرية، والمرشحين التي تم تحديدها من المقايسات الموصوفة في هذا البروتوكول كما ينبغي تقييمها لتحفيز المناعة المحتملين في هذين النوعين من الخلايا.لجميع المقايسات وصفد، وخطوة حاسمة للحصول على نتائج يمكن استنساخه ودقيقة لإعداد أنابيب الحمض النووي الريبي أو ترنسفكأيشن (خطوة 1.3). يجب أن يكون DNA البلازميد أو RNA عالية النقاء مع تركيزات تحديدها بدقة. فمن الأهمية بمكان أن تشمل الضوابط المناسبة أيضا. لتقييم البلازميدات جديدة التعبير اختبار الحمض النووي الريبي في فحص الانتاج الفيروسية، ومراقبة سلبية المناسب هو التعبير البلازميد فارغة. لالرنا القائم على العقاقير، وينبغي أيضا إدراج البلازميد سيطرة سلبية إضافية تعبر عن الحمض النووي الريبي عدم استهداف. وتقدم متواليات لإنزيم الحمض النووي الريبوزي غير الاستهداف وshRNA التي لا تؤثر على إنتاج فيروس نقص المناعة البشرية في 13. لالرناوات siRNAs الاختبار، والسيطرة السلبية الوحيدة التي يمكن استخدامها هي RNA غير الاستهداف وعدم استهداف تسلسل سيرنا المناسب ليتم توفيرها في 16 فحص الانتاج الفيروسية. لبقاء الخلية والمقايسات تفعيل المناعة، سيطرة سلبية يجب خلايا تعامل مع كاشف ترنسفكأيشن وحده، وأنه هو جritical التي تحكم إيجابية مثل بولي الأول: C يتم تضمين للتأكد من أن الخلايا التي تستجيب لسمية الناجم عن الحمض النووي الريبي أو تنشيط جهاز المناعة. لالبلازميدات التعبير RNA، ينبغي أن تدرج البلازميد فارغة أيضا للتأكد من أن ناقلات نفسه هو عدم وجود آثار سامة على الخلايا.
وعموما، فإن المقايسات الموصوفة هنا تمثل خطوة أولى جيدة نحو تحديد العلاجات RNA آمنة وفعالة للاستخدام في HIV-1 الجينات أو العلاج بالعقاقير. لجزيئات تستهدف HIV-1 الحمض النووي الريبي، فمن المهم أيضا مراعاة الحفاظ على الموقع المستهدف في HIV-1 سلالات، وطرق مفصلة لحساب الحفاظ على تسلسل تم نشرها سابقا 15. لنقل جزيء قدما في التجارب السريرية، ويجب أن يتم تنفيذ سمية وفعالية دراسات طويلة الأجل في الخلايا البشرية الابتدائية وفي النماذج الحيوانية للتأكد من أن تحديد المرشحين ستكون آمنة وفعالة في العيادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد العمل المقدم هنا من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) (يمنح DCB-120266، PPP-133377 وHBF-348967 لAG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
- Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
- Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
- Scarborough, R. J., Gatignol, A.
- Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
- Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
- McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
- Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
- Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
- Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
- Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
- Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
- Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
- Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
- Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
- Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
- Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M.
- Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
- Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
- Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
- Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
- ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
- Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
- Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
- Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
- Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
- Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
- Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
- Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
- Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
- Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).
