Introduction
En begrensning ved nåværende HIV-1-behandling er at de må være kronisk administreres for å forebygge sykdomsprogresjon. Transplantasjon av HIV-1-resistent T-lymfocytt, eller hematopoetiske stamceller, har potensial til å gi langvarig kontroll av HIV-1-replikasjon i fravær av medikamentbehandling 1,2, og kan også være en effektiv metode for å oppnå en HIV-1-kur 3. En måte å gjøre cellene resistente mot HIV-1-replikasjon, er å sette inn ett eller flere gener som koder for anti-HIV-1-RNA eller peptider til en infisert individuelle celler i løpet av en autolog transplantasjon 4. Flere kandidat anti-HIV-1-gener er blitt utformet med noen påbegynner kliniske forsøk i kombinasjoner av to 5 eller tre 6, for å forebygge utviklingen av HIV-1 resistens mot et enkelt gen.
Anti-HIV-1 RNA er blant de beste kandidatene for kombinasjon genterapi på grunn av deres lave potensial til å utløse immunrespons og fordi deer transkribert fra svært korte gensekvenser. Noen anti-HIV-1 RNA har blitt designet for å målrette viral oppføring og integrering. Men de fleste anti-HIV-1-RNA target post-integrasjonstrinn i den virale livssyklus (figur 1). Post-integrasjon hemmere inkluderer lokkefugl RNA, rettet mot HIV-1 regulatoriske proteiner Tat eller Rev 1, og antisense-baserte RNA, målretting ulike steder i HIV-1 RNA, som ribozymer 7, shRNAs 8 og U1i RNA 9. Fremgangsmåter som har blitt brukt for å sammenligne effektiviteten av anti-HIV-1-RNA omfatter overvåking av virusreplikasjon i celler transdusert med gener som koder for kandidat RNA-er og måling av virusproduksjon i celler forbigående transfektert med plasmider som uttrykker kandidat RNA-er og en HIV-1-ekspresjonsplasmid 10 -13. Vi har tidligere benyttet en HIV-1-produksjon assay for å screene HIV-1 RNA for ny ribozym målse 13-15. Disse metodene har siden blitt raffinert for å optimalisere formatet til en RNAinnblanding molekyl uttrykt fra plasmid-DNA som en shRNA eller leveres som et syntetisk siRNA 16. Analysen måler produksjon av modne virus fra humane embryoniske nyre (HEK) 293T-celler, og kan brukes for å sammenligne effektene av inhibitorer som er rettet mot etterintegrasjons trinn i HIV-1-replikasjonssyklus (figur 1). For hemmere som er rettet mot pre-integrasjon trinn, er alternative analyser som en TZM-bl celle smittsomhet analysen 17 for å vurdere antiviral effekt.
Store sikkerhetsproblemer for levering av anti-HIV-1 RNA i klinikken inkluderer potensielle off-target effekter på humane RNA eller proteiner, og aktivering av medfødte immun sensorer. For å evaluere toksisitet av anti-HIV-1 sirnas har vi benyttet en cellelevedyktighet analyse i forskjellige cellelinjer 16. Vi har også målt aktivering av de dobbelt-trådede RNA immun sensorer, RNA-aktivert protein kinase R (PKR) og Toll like receptor 3 (TLR3), samt expression av interferonet stimulert genet, ADAR1 p150. Disse analyser kan anvendes for å bekrefte at effekten av anti-HIV-1 RNA er ikke på grunn av indirekte effekter på celle-levedyktighet eller immun sensor aktivering. De er også nyttige i eksklusiv kandidat RNA-er med potensielle toksisitet fra videre utvikling.
I de følgende protokoller for å identifisere nye terapeutiske prosedyrer RNA og optimalisere formatet av eksisterende, er beskrevet. Metodene er nyttige for screening RNA baserte post-integrasjon hemmere av HIV-1-replikasjon og kan tilpasses til skjermen andre post-integrasjon hemmere, for eksempel små molekyler rettet mot Rev mediert eksport av viral RNA 18 eller CRISPR / Cas systemer designet for å målrette integrert HIV-1 DNA 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celler og transfections
- Kultur HEK 293T celler i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin. Fremstille en 2 x 10 5 celler / ml suspensjon i cellekulturmediet. Legg 500, 100 og 1000 ul cellesuspensjon til hver brønn i 24-brønners, 96-brønners og 12-brønners plater, for viral produksjon, celleviabilitet og immunaktivering assays, henholdsvis (figur 2A).
- Virvle platene og inkuber dem O / N ved 37 ° C med 5% CO2. Grow cellene til 50-70% konfluens.
- Ifølge en transfeksjon plan, forberede fortynninger av test RNA og deres kontroller i 1,5 ml mikrorør (eksempel, figur 2B).
- For viral produksjon assay fremstille en 10 ng / ul fortynning av en HIV-1-ekspresjonsplasmid og tilsett 10 pl til hvert rør. Neste fremstille 5 um fortynninger av test-RNA og en negativ kontroll RNA. Tilsett 2,5 eller 10 ul av hver test RNA og negative kontroll fortynning til de tilsvarende rør i 25 eller 100 nM sluttkonsentrasjoner.
- For celleviabilitet analysen fremstille 5 um fortynninger av test-RNA og et 10 mg / ml fortynning av den positive kontroll RNA, lav molekylvekt Poly I: C. Tilsett 2 pl av prøve RNA eller positiv kontroll RNA-fortynninger til de tilsvarende rør for 100 nM eller 200 ug / ml sluttkonsentrasjoner på hhv.
- For aktivering av immunsystemet analysen, tilsett 20 ul test RNA eller positive kontroll RNA fortynninger utarbeidet i trinn 1.3.2. til de tilsvarende rør for 100 nM eller 200 ug / ml sluttkonsentrasjoner på hhv.
Merk: For testing RNA ekspresjonsplasmider, forberede 10 ng / mL fortynninger i stedet for de 5 mikrometer fortynninger av test RNA, noe som gir endelige mengder 25 og 100 ng for trinn 1.3.1. og 100 ng for trinn 1.3.2. og 1.3.3.
- Tilsett 50, 25 eller 75 ul av DMEM til hver transfeksjon rør for viral production, celle levedyktighet og immunaktiveringsanalyser, henholdsvis. For virusproduksjonsanalyser, ta celler og forberedt transfeksjonsteknologier rør til en bio-sikkerhet nivå 3 (BSL3) laboratorium før neste trinn.
- Tilsett 2 mL av transfeksjon reagens sekvensielt til transfeksjonsagensene rørene og inkuber 15 til 20 min for å tillate komplekser å dannes. Se Table of Materials for den spesifikke transfeksjon reagens som skal brukes.
- Legg hele transfeksjon blanding fra hver mikro rør dråpevis til de tilsvarende stillinger i cellekulturplater. Virvle og inkuber platene i 48 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Mål HIV-1 produksjon (§ 2), celleviabilitet (§ 3) og immunaktivering (§ 4) i cellekulturplater (Figur 2C).
2. Viral Produksjon analysen
- Fjern 24-brønnen cellekultur plater fra inkubatoren og virvle platene inne i BSL3 cellekulturhette. Overfør 150 ul av supernatanten fra hver brønn til en tilsvarende brønn i en 96-brønns flatbunnet plate, som vil bli brukt til å kvantifisere HIV-1-produksjon.
Merk: Vanlige virale kvantifisering analyser inkluderer måling av ekspresjonen av HIV-1 kapsid-proteinet (p24) ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) 20, kvantifisering viral RNA ved revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) 21 og å måle aktiviteten av HIV-1-RT-enzymet. Steps 02.02 til 02.05 forklare metoder for å kvantifisere HIV-1 RT aktivitet 13,15,16. - Transfer 5 ul supernatant til tilsvarende brønner i en 96-brønners plate inneholdende 25 ul av en viral forstyrrelse cocktail 15 (tabell 1). Inkuber blandingen i 5 min ved RT og overføre platen til en radioaktivitet arbeidsstasjon.
Merk: Trinn 2.2. er bare nødvendig hvis en radioaktivitet arbeidsstasjon er ikke tilgjengelig i BSL3 laboratoriet. Hvis platene ikke behøver å bli fjernet fraBSL3 laboratorium, fortsett til trinn 2.3. og tilsett 50 ul radioaktiv / viral forstyrrelse cocktail (tabell 1) i stedet for de 25 ul radioaktiv cocktail. - Forbered en radioaktiv cocktail 15 (tabell 1), og tilsett 25 mL til hver brønn av viral supernatant og avbrudd cocktail. Inkuber platene ved 37 ° C i 2 timer.
- Sted 5 pl av reaksjonsblandingen på tilsvarende kvadrater i et glassfiber Di etyl amino Etyl- (DEAE) filtermat papir og tillate flekkene tørke i 10 min. Spot reaksjonsblandingen på hver firkant slik at ingen to prøvene direkte boarder hverandre. Dette bidrar til å unngå kryss-over mellom prøvene ved fastsettelse tellinger per minutt (spm) i trinn 2.6.
- Vask papirene 5 ganger i 5 min med 2 x saltvann natriumcitrat (SSC) buffer (tabell 1), etterfulgt av to vaskinger med 1 min 95% etanol. Tillat papirene tørke og forsegle dem i prøveposer.
- Clip sample poser containing den filtermat papir i en kassett og sett kassetten inn en mikro scintillasjonsteller. Sette telleren til lese cpm for 32 P med referansetidspunktet gitt for baking av [32P] dTTP benyttet i forsøket. Velg hvilke prøver å lese ved bruk av kart platen og starte telleren.
- For enhver viral kvantifisering metode, dele verdiene oppnådd for hver test-RNA ved de tilstøtende negative kontrollen, og multiplisere denne verdien med 100 for å få prosent inhibering av HIV-1-produksjon for hvert replikat av test RNA. Et eksempel på resultatet som sammenligner forskjellige test RNA ved forskjellige konsentrasjoner er gitt i Figur 3.
3. celleviabilitet Assay
- Fjern de 96-brønners plater fra inkubatoren og tilsett 20 ul av 5 mg / ml MTT (3- [4,5-dimetyl-2-tiazolyl] -2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid) fortynnet i Dulbeccos fosfatbufret saltløsning ( DPBS) til hver brønn. Inkuber platene feller 3 timer ved 37 ° C.
- Legg 150 ul surgjort isopropanol med vaskemiddel (1% NP-40, 4 mM HCI i isopropanol) til hver brønn og inkuber platene i 2 timer ved RT.
- Bestem absorbansen ved 570 nm i en mikroplate-spektrofotometer.
- Beregn den relative MTT forbrenningen for hver positiv kontroll og test-RNA ved å dele den verdi som oppnås for hver prøve ved sin tilstøtende transfeksjon kontroll. Et eksempel på resultatet som sammenligner ulike test RNA og en positiv kontroll er gitt i figur 4.
4. Immune Activation-analyse
- Fjern 12-brønners plater fra inkubatoren og aspirer dyrkingsmedier. Forsiktig vaske cellene to ganger med DPBS og tilsett 70 ul kald lyseringsbuffer 22 (inkludert protease og fosfatase-inhibitorer, Tabell 1) til hver brønn. Platene inkuberes i 10 minutter på is.
- Overfør cellelysatene til mikrorør og rask fryse dem ved å dypperør i flytende nitrogen. Tillate prøvene å tine og gjenta ytterligere 2 fryse tinesykluser for en total av tre.
- Sentrifuger lysatene i 15 minutter ved 4 ° C, 15 700 xg, for å pelletere celleavfallet. Overfør supernatanten til nye mikrorør og bestemme proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Coomassie blue (Bradford) -metoden 23,24.
- Løse 75 ug protein fra hver prøve på en 10% denaturerende polyakrylamid gel og overføres til en nitrocellulosemembran som beskrevet tidligere 25,26.
- Etter elektroforese og overføring til en membran, viser proteinbånd ved inkubering av membranen i Ponceau S (tabell 1) i 1 minutt, etterfulgt av vasking i dobbeltdestillert vann. Bruk band og protein stige som en guide for å kutte membranen 80 og 55 kDa.
Merk: I trinn 4.4 prøvene kan kjøres på 16 x 18 cm 2-geler ned til 34 kDa, slik at det er lett å skjære membranen ved de angitte posisjonene og ikke skjære gjennomband av interesse. Alternativt kan flere geler kjøres med de samme prøvene for å unngå å kutte membranen. - Vaske ut Ponceau S farging med Tris-bufret saltvann inneholdende 0,05% Tween 20 (TBST, tabell 1). Legg TBST med 5% fettfri melk til å dekke membranene. Inkuber membraner ved RT under omrøring i 1 time.
- Inkuber membraner O / N i TBST med 3% bovint serumalbumin (BSA) og antistoff fortynnet til 1 i 1000 mot ADAR1 (110 og 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), og fosfo-IRF3 (47 kDa), for den øverste, midtre og nedre deler av membranen, henholdsvis.
- Vaske membranene 5 ganger i 5 min med TBST og inkubert i TBST med 5% ikke-fettmelk og peroksidase-merket geite-anti-kanin sekundære antistoffer (fortynnet til 1 i 5000) i 1 time.
- Vask membraner 5x i 5 min med TBST og gjelder elektrokjemiluminescens (ECL) løsning for å visualisere band på filmene i henhold til produsentens instruksjoner.
- Etter å visualisere proteinbåndene på filmer, vask de midtre og nedre deler av membranen i 10 minutter med et antistoff strippeoppløsning. Inkuber membraner O / N i TBST med 3% BSA og antistoffer mot total PKR (1 i 500) og IRF3 (på 1 i 1000), for midtre og nedre stykker, henholdsvis. Gjenta trinn 4.8. og 4.9. ved hjelp av peroksidase-merket geit anti-mus i stedet for det anti-kanin-sekundært antistoff for PKR membranen (i midten).
- Vask bunnstykket av membranen 5x i 5 minutter med TBST og inkuber membranen i TBST med 3% BSA i 1 time med et antistoff mot aktin (fortynnet til 1 i 5000). Gjenta trinn 4.8. og 4.9. ved hjelp av peroksidase-merket geit anti-mus i stedet for det anti-kanin sekundært antistoff. Et eksempel på resultatene sammenlikner ulike test RNA og en positiv kontroll er gitt i Figur 5. Se tabell for material for de spesifikke antistoffer som skal brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En generell skjematisk av de prosedyrer som er vist i figur 2 med et eksempel transfeksjon plan for tre test RNA og en kontroll RNA gitt i figur 2B. For viral produksjon og cellelevedyktighetstest, utlesning for hver test konstruksjon er normalisert til en negativ kontroll. Replikater transfekteres i sett, slik at hver prøve RNA er normalisert til dens tilstøtende negativ kontroll. Dette gjøres for å unngå feilaktige data relatert til tiden mellom kompleks og transfeksjon, noe som kan oppstå dersom, for eksempel, alle de negative kontrollene er transfektert først. Siden HIV-1 kan påvirke immunresponser 27,28, blir cellelevedyktigheten og immunaktivering analyser utført uten tilsetning av et HIV-1-uttrykkende plasmid.
For å identifisere den optimale lengden på RNA-interferens molekyler mot et konservert område i HIV-1 RNA (posisjon 1498-141519 i HIV-1-stamme NL4-3) 13, ble et sett av sirnas konstruert (figur 3A). Ved hjelp av produksjons assay HIV-1, prosenten av RT-aktivitet sammenlignet med celler transfektert med en lang dicer substrat nonsense siRNA (Sins) ble beregnet for celler transfektert med hvert test siRNA ved forskjellige mengder av ko-transfeksjon med 100 ng av et plasmid som uttrykker HIV-1-stamme NL4-3 (figur 3B).
Ved hjelp av cellelevedyktighet analysen ble den prosentvise metabolisme av MTT bestemt for celler transfektert med de mest effektive sirnas identifisert i figur 3B. Data ble normalisert til MTT metabolisme i celler behandlet med transfeksjon reagens alene (figur 4). En lang dobbel strandet RNA (Poly I: C) redusert celle levedyktighet; Men effekten var bare signifikant ved den høyeste dose evalueres. Ingen signifikant reduksjon i celle levedyktighet ble observert for siRNAs rettet mot 1498 si te i HIV-1 RNA, uavhengig av deres lengde. Ved hjelp av aktivering av immunsystemet analysen ble det samme sett av RNA evaluert for deres evne til å utløse immunresponsen (figur 5). I forhold der Poly I: C aktivert uttrykk for ADAR1 p150 og indusert fosforylering av PKR og IRF3, kunne ingen signifikant effekt på immunaktiverings markører holdes for noen av test RNA.
Figur 1. Skjematisk av pre- og post-integrasjon trinn i HIV-1-replikasjon syklus. Pre-integrasjon (1-3) og post-integrasjon (4-7) trinn i HIV-1-replikasjon syklus er vist i skissert bokser . klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2 "src =" / files / ftp_upload / 54486 / 54486fig2.jpg "/>
Figur 2. Skjematisk av virusproduksjon, celleviabilitet og immunaktivering assays. (A) Tallerken adherente celler og kultur i 24 timer. Cellene blir sådd ut i 24-, 96- og henholdsvis 12- brønners plater i 500, 100 og 1000 mL av cellekulturmedier for virusproduksjon, celleviabilitet og immunaktivering analyser. (B) Forbered transfeksjon rør, transfektere celler og kultur i 48 timer. Et eksempel transfeksjon plan for et sett på tre test RNA (RNA1-3) er vist med hensiktsmessige kontroller. Transfeksjon fremgangsmåten er også vist. (C) Read-out. Den lese-out for viral produksjon, celle levedyktighet og immunaktiveringsanalyser er skrevet og forklart i detalj i del 2, 3 og 4, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ P>
Figur 3. Effekt av test siRNAs på HIV-1 produksjon. (A) Design av siRNAs med forskjellige lengder og symmetrier. En konservert sekvens i HIV-1-RNA (1498 målstedet) ble anvendt til å designe symmetriske og asymmetriske sirnas (si1498-) med forskjellige lengder (17 til 29 nukleotid sanse tråder). Den forventede forstand (topp, svart) og antisense (nederst, rød) tilnærmingene er angitt. (B) Inhibering av HIV-1-produksjon ved si1498 lengde varianter. Den prosentvise (%) hemming av HIV-1-RT-aktivitet i supernatanten av HEK293T celler transfektert med symmetriske eller asymmetriske si1498 lengdevarianter blir vist i forhold til en lang dicer substrat nonsense siRNA (Sins). Hver test RNA ble sammenlignet med Sins ved forskjellige doser i minst to uavhengige transfeksjoner med to til tre replikater. Dataene er expressed som middelverdier ± standardfeil midler (Sems). Dette tallet har blitt forandret fra 16, copyright American Society for Microbiology. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Effekt av si1498 lengde varianter på celleviabilitet HEK293T celler ble transfektert med poly I:. C 50 og 200 mikrogram / ml (PIC50 og PIC200) og forskjellige lengder og formater av si1498 på 100 nM. Det% metabolisme av MTT ble bestemt i forhold til celler behandlet med den transfeksjon reagens alene (Mock, M) i tre uavhengige transfeksjoner med to til tre replikater. Dataene er uttrykt som middelverdier ± SEM. Uparet student t-test ble benyttet for å bestemme hvorvidt de ulike trans significantly (*, p <0,05) redusert cellelevedyktighet i forhold til den mock-transfekterte celler. Dette tallet har blitt forandret fra 16, copyright American Society for Microbiology. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Effekt av si1498 lengde varianter på medfødte immunresponser. HEK293T celler ble transfektert med PIC50, PIC200 og ulike lengder og formater av si1498 på 100 nM. Aktivering av PKR og TLR3 ble evaluert ved å måle fosforylert PKR og IRF3, respektivt. Uttrykk for en interferon stimulert gen (ISG) ble evaluert ved å måle de ISG ADAR1 P150 nivåer i forhold til konstitutivt uttrykt variant, ADAR1 P110. Ekspresjonen av aktin ble benyttet som en kontroll lasting. dette figure har blitt forandret fra 16, copyright American Society for Microbiology. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navn på Buffer / Reagens | sammensetning |
| Viral avbrudd cocktail | 60 mM Tris-HCl (fra 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1,04 mM EDTA, 1% NP-40. |
| Radioaktivt cocktail | 60 mM Tris-HCl (fra 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1,04 mM EDTA, 10 ug / ml poly (A), 0,33 ug / ml oligo dT. Lagt umiddelbart før bruk: 8 mM ditiotreitol (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) og 5 pl [32P] dTTP (3000 Ci / mmol) For hver 500 mL av cocktail. |
| Radioaktiv / viral avbrudd cocktail | 60 mM Tris-HCl (fra 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1,04 mM EDTA, 0,1% NP-40, 5 ug / ml poly (A), 0,16 ug / ml oligo dT. Lagt umiddelbart før bruk: 8 mM ditiotreitol (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) og 5 pl [32P] dTTP (3000 Ci / mmol) for hver 1 ml cocktail. |
| 2x SSC | 17,53 g NaCl og 8,82 g natriumsitrat - 2H 2 O i en LH 2 O. |
| lyseringsbuffer | 50 mM Tris-HCl (fra 1 M Tris-HCl, pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA (0,5 M, pH 8,0), 10% volum / volum glycerol, 1% volum / volum NP-40. |
| Ponceau S | 2,5 g Ponceau S og 5 ml eddiksyre i 500 ml H 2 O. |
| TBST 6,05 g Tris, 8,76 g NaCl og 1 ml Tween 20 i en LH 2 O. |
Tabell 1:. Komponenter i ikke-kommersielle buffere og reagenser Oppskrifter for alle ikke-kommersielle buffere og reagenser er gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HIV-1-produksjon assayet beskrevet ble utført ved anvendelse av HEK293T celler (figur 2) og er lik assays som brukes for å screene HIV-1 RNA for effektiv ribozym 13, shRNA 10,29, siRNA 30, og U1i RNA 11,31 målse. Ved hjelp av ulike metoder for å kvantifisere HIV-1 produksjon, har de fleste studiene målt virusproduksjon 48 timer etter ko-transfeksjon av en HIV-1 uttrykk plasmid med kandidat RNA. Etter produksjon av HIV-1, umodne viruspartiklene gjennomgår proteolytisk spaltning av deres polyproteiner av HIV-1-protease for å bli modne viruspartikler, som er i stand til å infisere nye celler. For HIV-1-RT-enzymaktivitetsanalyse som er beskrevet i trinn 2.2. til 2.5., blir både produksjon og modningstrinn evaluert, ettersom RT-enzymet er bare aktiv i modne virioner. I motsetning til dette, kan det kapsidprotein og virus-RNA være tilstede i både modne og umodne virioner. Derfor kvantifisere HIV-1 produksjon av p24 ELISA eller RT-PCR may savner virkninger av terapeutiske RNA som virker på modningen trinn av HIV-1-replikasjonssyklus, slik som ribozymer som lokaliserer til HIV-1-virioner 32 og antisens-baserte molekyler som inhiberer Gag behandling i tillegg til HIV-1-protein ekspresjon 13, 31. En begrensning av virusproduksjon analyser er at de anvendte celler ikke uttrykker de riktige reseptorer for HIV-1-inngang og kan ikke brukes til å evaluere effekten av terapeutiske RNA på HIV-1-inngangs eller integrering.
For å evaluere effekten av anti-HIV-1 RNA på hele replikasjonssyklus, er forskjellige HIV-1 infeksjonsmodeller blitt brukt i forskjellige T-lymfocytt-cellelinjer eller primære blodceller 5,33. Siden disse cellelinjene er vanskelige å transfektere, mer arbeidskrevende metoder som lentiviral vektor gen innsetting eller aptamer / peptid konjugering er nødvendig for å levere tilstrekkelige mengder av anti-HIV-1-RNA for å observere effekter på HIV-1 replikasjon. Denne begrensningen gjør det difficult til hurtig sammenligne den struktur-aktivitetsforhold mellom varianter av et spesielt anti-HIV-1 RNA eller utføre i stor skala screening for å identifisere det optimale målsetet for nye klasser av anti-HIV-1-RNA. Mens virale produksjonsanalyser har vært nyttige for å identifisere nye anti-HIV-1-RNA-molekyler, alternative cellemodeller i lett transfekterte cellelinjer som støtter HIV-1-replikasjon, slik som TZM-BL-celler, vil være nyttige for screening av anti-HIV-1- RNA rettet mot andre trinn i replikasjonssyklus, for eksempel oppføring og integrering.
Avhengig av klasse av anti-HIV-1-RNA, er flere mulige mekanismer for toksisitet er blitt beskrevet. For eksempel kan antisense-RNA basert ha off-target effekter på cellulære RNA inneholdende den samme eller en tilsvarende sekvens for deres tiltenkte målområde i HIV-1 RNA. Tilsvarende RNA aptamerer, modellert etter det transaktiverings respons element (TAR) eller Rev respons element (RRE), kan påvirke funksjonen til mobil proteins, slik som TAR RNA-bindende protein (TRBP) 34. shRNAs og sirnas har i tillegg mulighet til å påvirke RNA-interferens veien ved sekvestrering av RNAi-proteiner 35 og noen U1i molekyler har blitt vist å påvirke spleising og behandling av cellulære RNA ved sekvestrering av proteinene ifølge U1 small nuclear RNA-proteinkompleks 36. Mens noen av disse effekter kan minimaliseres ved forsiktig design, målinger av cellulær toksisitet i skjermer for nye anti-HIV-1-RNA-molekyler er anvendbare i eksklusiv-molekyler med potensielle off-target-effekter på grunn av videre utvikling. Videre kan off-target effekter indirekte hemmer HIV-1 produksjon, slik cellulær toksisitet en viktig måling i validere effekten av nye anti-HIV-1 molekyler identifisert fra HIV-1 produksjon skjermer.
Den celleviabilitet analysen beskrevet i trinn 3.1. til 3,4. er en variant av en standardanalyse som har blitt brukt for å screene forskjellige antiviral molekyl s 37. Analysen måler aktiviteten av NAD (P) H-avhengige cellulære enzymer for å redusere MTT-reagens til sin uoppløselig lilla form, formazan. Protokollen er tilpasset fra tidligere publiserte metoder 38 og flere kits er tilgjengelig ved hjelp av MTT eller andre nært beslektede reagenser. Mens det er viktig å analysere cellelevedyktighet i cellelinje som brukes for screening av anti-HIV-1 RNA, skal det bemerkes at ulike cellelinjer varierer i deres følsomhet overfor RNA-indusert toksisitet. For eksempel, Reynolds et al., Demonstrerte at dicer substrat sirnas hadde ingen virkning på cellelevedyktighet i HEK293T celler, men betydelig redusert cellelevedyktighet i MCF7, DU145 og HeLa S3-celler 39. For analysen beskrevet heri, blir HEK293T celler brukt som et eksempel (figur 4); imidlertid har den samme analysen også blitt gjort i MCF7-celler for å evaluere potensiell toksisitet i en cellelinje som er mer følsom for små RNA-indusert toksisitet 16.
e_content "> Siden anti-HIV-1 RNA kan ikke behandles og presenteres for det adaptive immunsystemet, de anses som mindre immunogen i forhold til anti-HIV-1-proteiner eller peptider. Men avhengig av rekkefølgen eller struktur, kan de lokke fram medfødt immunresponser, og flere immun følere og signalveier er identifisert som kan svare på små RNA (oversikt i 40). i det immunaktivering analysen beskrevet her, ble nivåene av fosforylert PKR og IRF3 sammenlignet i celler transfektert med små RNA som en indikasjon på PKR eller TLR3 aktivering, respektivt. Begge RNA-sensorer er til stede i et bredt spekter av cellelinjer og deres aktivering kan føre til produksjon av type 1-interferoner og, i tilfelle av PKR, en nedstenging i oversettelse. for å evaluere potensialet for anti-HIV-1 RNA for å aktivere produksjon av type 1-interferoner ved hjelp av alternative reaksjonsveier, ble nivåer av interferon-stimulerte gen ADAR1 (p150) også sammenlignet i celler transfektert medanti-HIV-1 RNA. Som demonstrert ved effekten av den lange dsRNA positiv kontroll, poly I: C, alle disse responser var aktive i HEK293T-celler (figur 5), og lignende effekt ble observert i MCF7-celler 16. Siden disse reaksjonene kan inhibere HIV-1-produksjon i fravær av virkning på cellelevedyktighet tilveiebringer aktivering av immunsystemet analysen ytterligere kontroll for effektiviteten av nye anti-HIV-1-RNA. Ytterligere målinger som kan legges til denne evalueringen omfatter måling av produksjonen av inflammatoriske cytokiner og type 1 interferoner i cellekultur supernatanten, og måle uttrykket av flere interferon-stimulert gener. Siden HIV målceller som CD4 + T-celler og makrofager kan uttrykke ulike nivåer av medfødte immun sensorer, bør kandidatene identifisert fra analysene som er beskrevet i denne protokollen også bli vurdert for potensielle immunstimulering i disse celletyper.For alle analysene beskrived, den kritiske trinn for å oppnå reproduserbare og nøyaktige resultater er fremstillingen av DNA- eller RNA-transfeksjon rør (trinn 1.3.). Plasmid-DNA eller RNA bør være av høy renhet med konsentrasjoner nøyaktig bestemt. Det er også viktig å inkludere de hensiktsmessige kontroller. For å vurdere nye test RNA ekspresjonsplasmider i viral produksjon analysen, er en egnet negativ kontroll tomt uttrykk plasmid. For antisens-RNA-baserte, bør en ytterligere negativ kontroll plasmid som uttrykker et ikke-målsøkende RNA også være inkludert. Sekvenser for et ikke-måls Ribozyme og shRNA som ikke påvirker HIV produksjon er gitt i 13. For test sirnas, den eneste negativ kontroll som kan brukes er en ikke-målsøkende RNA og et egnet ikke-målsøkende siRNA-sekvens for virusproduksjon analysen er gitt i 16. For celleviabilitet og immunaktivering analyser, bør den negative kontroll være celler behandlet med transfeksjon reagens alene, og det er critical som en positiv kontroll, for eksempel Poly I: C er inkludert for å bekrefte at cellene reagerer på RNA-indusert toksisitet eller aktivering av immunsystemet. For RNA-ekspresjonsplasmider, bør det tomme plasmidet også være inkludert for å sikre at vektoren i seg selv ikke er å ha toksiske virkninger på cellene.
Totalt sett analysene som er beskrevet her representerer et godt første skritt mot identifisering av sikker og effektiv RNA terapi for bruk i HIV-1 genet eller medikamentell behandling. For molekyler rettet mot HIV-1 RNA, er det også viktig å vurdere bevaring av deres målområde i HIV-1 sirkulerende stammer, og detaljerte metoder for å beregne sekvens bevaring har tidligere blitt publisert 15. For å flytte et molekyl fremover i kliniske studier, bør langsiktige toksisitet og effektstudier utføres i primære humane celler og i dyremodeller for å bekrefte at de identifiserte kandidatene vil være trygg og effektiv i klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Arbeidet presenteres her ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) (gir DCB-120 266, PPP-133377 og HBF-348967 til AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
- Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
- Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
- Scarborough, R. J., Gatignol, A.
- Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
- Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
- McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
- Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
- Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
- Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
- Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
- Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
- Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
- Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
- Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
- Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
- Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M.
- Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
- Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
- Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
- Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
- ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
- Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
- Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
- Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
- Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
- Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
- Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
- Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
- Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
- Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).
