Introduction
הגבלה של טיפולי HIV-1 הנוכחיים היא שהם צריכים להתנהל באופן כרוני כדי למנוע התקדמות מחלה. להשתלות של HIV-1 עמיד לימפוציטים T, או תאי גזע hematopoietic, יש את הפוטנציאל לספק בקרה לטווח ארוך של שכפול HIV-1 בהעדר טיפול תרופתי 1,2 ויכול גם להיות גישה יעילה להשיג תרופה HIV-1 3. דרך אחת להפוך תאים עמידים שכפול HIV-1 היא להכניס גנים אחד או יותר קידוד עבור אנטי HIV-1 RNAs או פפטידים לתוך התאים של אדם שנדבק במהלך השתלה עצמית 4. כמה המועמד גנים אנטי HIV-1 עוצבו עם כמה ניסויים קליניים נכנסים שילובים של שני 5 או שלוש 6, כדי למנוע התפתחות של עמידות HIV-1 לכל גן יחיד.
RNAs-1 נגד HIV הוא בין המועמדים הבולטים עבור ריפוי גנטי שילוב בשל הפוטנציאל הנמוך שלהם לעורר תגובה חיסונית ובגלל שהםמשועתק מתוך רצפי גנים מאוד קצרים. חלק RNAs נגד HIV-1 עוצב למקד כניסה ושילוב ויראלי. עם זאת, רוב RNAs נגד HIV-1 למקד צעדים שלאחר אינטגרציה במחזור החיים של הנגיף (איור 1). מעכבי פוסט אינטגרציה כוללים RNAs דמה, מיקוד חלבונים רגולטוריים HIV-1 טאט או Rev 1, ו RNAs מבוססי antisense, מיקוד אתרים שונים HIV-1 RNA, כגון ribozymes 7, shRNAs 8 ו U1i 9 RNAs. שיטות שנוצלו כדי להשוות את היעילות של RNAs נגד HIV-1 כוללות ניטור שכפולה נגיפית בתאי transduced עם גני מקודדי RNAs מועמד למדידת ייצור נגיפי בתאי transfected זמני עם פלסמידים להביע RNAs מועמד פלסמיד ביטוי HIV-1 10 -13. השתמשנו בעבר assay ייצור HIV-1 להקרין HIV-1 RNA עבור אתרי היעד ribozyme חדש 13-15. שיטות אלה שוכללו מאז כדי לייעל את הפורמט של RNAמולקולת פרעות הביעה מ- DNA פלסמיד כקובץ shRNA או נמסרה בתור siRNA סינטטי 16. את assay מודד את הייצור של וירוסים בוגרים מן הכליות עובריות אנושיים (HEK) תאי 293T, וניתן להשתמש בו כדי להשוות את ההשפעות של מעכבים כי למקד צעדים שלאחר אינטגרציה במחזור שהכפול HIV-1 (איור 1). עבור מעכבים כי למקד צעדים מראש אינטגרציה, מבחנים חלופיים כגון assay infectivity תא TZM-bl 17 נדרשים להעריך יעילות אנטי.
חששות בטיחות סרן עבור המשלוח של אנטי HIV-1 RNAs במרפאת כוללים השפעות חוץ-היעד פוטנציאליות על RNAs אדם או חלבונים, והפעלה של חיישני חיסון מולדים. כדי להעריך את הרעילות של siRNAs נגד HIV-1, השתמשנו assay כדאיות התא שורות תאים שונות 16. כמו כן, אנו נמדדים הפעלה של החיישנים החיסוניים גדילי RNA הכפולים, R פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR) ו אגרה כמו 3 קולטן (TLR3), כמו גם לשעברpression של אינטרפרון מגורה גן, p150 ADAR1. מבחנים אלה יכולים לשמש כדי לאשר את היעילות של RNAs נגד HIV-1 הוא לא בשל השפעות עקיפות על כדאיויות תא או הפעלת חיישן חיסונית. הם גם שימושי למעט RNAs מועמד עם רעילות פוטנציאל להתפתח הלאה.
ב הפרוטוקולים הבאים, נהלים לזהות RNAs הטיפולית חדשות ולבצע אופטימיזציה של הפורמט של התנחלויות קיימות מתואר. השיטות שימושיות מעכבי אינטגרציה שלאחר מבוסס RNA הקרנת שכפול HIV-1 יכולות להיות מותאמות למסך מעכבים שלאחר אינטגרציה אחרות, כגון מולקולות קטנות מיקוד יצוא Rev בתיווך של רנ"א הנגיפי 18 או CRISPR / מערכות קאש שנועדו למקד משולבות HIV-1 DNA 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תאי transfections
- תרבות תאי HEK 293T במדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. כן השעית 2 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום תרבית תאים. הוספת 500, 100 ו -1,000 μl של השעיה התא היטב כל 24 גם, 96-היטב צלחות 12-היטב, לייצור ויראלי, כדאיות התא מבחני ההפעלה החיסונית, בהתאמה (איור 2 א).
- מערבולת בעדינות את הצלחות דגירה אותם O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לגדל תאים כדי 50-70% confluency.
- על פי תוכנית transfection, להכין דילולים של RNAs מבחן ובקרות שלהם ב 1.5 צינורות מיקרו מ"ל (דוגמה, איור 2B).
- עבור assay הייצור ויראלי, להכין 10 ng / דילול μl של פלסמיד ביטוי HIV-1 ולהוסיף 10 μl על צינור אחד. הבא להכין 5 מיקרומטר דילולים של RNAs הניסיוני RN בקרה שליליא להוסיף 2.5 או 10 μl של כל RNA מבחן ודילול בקרה שלילי על הצינורות המקביל עבור 25 או 100 ריכוזים סופיים ננומטר.
- עבור assay כדאיות התא, להכין 5 מיקרומטר דילולים של RNAs הבדיקה דילול 10 מ"ג / מ"ל של RNA בקרה חיובית, משקל מולקולרי נמוך אני פוליפוני: C. הוסף 2 μl של רנ"א בדיקה או דילולי RNA הבקרה חיוביים על הצינורות המתאימים עבור 100 ננומטר או 200 ריכוזים סופיים מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה.
- עבור assay ההפעלה החיסוני, להוסיף 20 μl של רנ"א בדיקה או דילולי RNA בקרה חיוביים מוכנים בשלב 1.3.2. אל הצינורות המתאימים עבור 100 ננומטר או 200 מיקרוגרם / ריכוזיים סופי מיליליטר, בהתאמה.
הערה: פלסמידים ביטוי RNA בדיקות, להכין 10 ng / דילולים μl במקום של 5 מיקרומטר דילולים של RNAs הבדיקה, מתן הסכומים הסופיים של 25 ו -100 ng עבור צעד 1.3.1. ו -100 ng לצעדים 1.3.2. ו 1.3.3.
- הוסף 50, 25 או 75 μl של DMEM על צינור אחד transfection למוצרים ויראליuction, כדאיות התא מבחני ההפעלה החיסונית, בהתאמה. מבחני ההפקה ויראלי, להביא תאים וצינורות transfection מוכן מעבדה ביו בטיחות ברמה 3 (BSL3) לפני השלב הבא.
- הוסף 2 μl של ברצף מגיב transfection אל צינורות transfection דגירה 15 עד 20 דקות, כדי לאפשר מתחמי הטופס. ראה הטבלה של חומרים עבור מגיב transfection הספציפי כדי לשמש.
- מוסיפים את תערובת transfection כולו מהצינור כל מיקרו-חכם ירידה לעמדות המקביל צלחות תרבית תאים. מערבולת בעדינות דגירה הצלחות במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- מדוד ייצור HIV-1 (סעיף 2), כדאיות התא (סעיף 3) והפעלה החיסונית (סעיף 4) ב צלחות תרבית תאים (איור 2 ג).
2. Assay הפקה ויראלי
- הסר את צלחות תרבית תאי 24 גם מן החממה בעדינות מערבולת הצלחות בתוך תרבית תאי BSL3מכסה מנוע. עבר 150 μl של supernatant מכל טוב על תואמים היטב צלחת תחתית שטוחה 96-היטב, אשר תשמש לכמת ייצור HIV-1.
הערה: מבחני כימות ויראלי נפוצות כוללות מדידת ביטוי של חלבון קפסיד HIV-1 (p24) על ידי assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) 20, לכימות רנ"א נגיפי על ידי RT-PCR (RT-PCR) 21 ומדידת פעילות של האנזים RT HIV-1. צעדים 2.2 ל 2.5 להסביר שיטות לכמת HIV-1 RT פעילות 13,15,16. - העברה 5 μl של supernatant כדי מקביל בארות בצלחת 96-היטב, המכיל 25 μl של קוקטייל שיבוש ויראלי 15 (טבלה 1). דגירה את התערובת במשך 5 דקות ב RT ולהעביר את הצלחת לתחנת עבודת רדיואקטיביות.
הערה: שלב 2.2. יש צורך רק אם לא זמינה עבודת רדיואקטיביות היא במעבדת BSL3. אם הצלחות לא צריכות תיוסרנהמעבדת BSL3, המשך לשלב 2.3. ולהוסיף 50 μl של קוקטייל שיבוש רדיואקטיביים / ויראלי (טבלה 1) במקום 25 μl של קוקטייל רדיואקטיבי. - כן רדיואקטיבי קוקטייל 15 (1 טבלה), ולהוסיף 25 μl היטב כל supernatant ויראלי קוקטייל הפרעה. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- ספוט 5 μl של תערובת התגובה על ריבועים מקבילים סיבי זכוכית Di אתיל אמינו אתיל (DEAE) נייר filtermat ולאפשר הכתמים להתייבש במשך 10 דקות. ספוט את תערובת התגובה על כל ריבוע אחר כך ששתי אין דגימות ישירות דייר אחד אחרת. זה עוזר למנוע מעל הכלאה בין דגימות בעת קביעת ספירת לדקה (CPM) בשלב 2.6.
- שטפו את העיתונים 5x במשך 5 דקות עם חיץ נתרן ציטרט מלוחים 2x (SSC) (טבלה 1), ואחריו שני שוטף 1 דקות עם אתנול 95%. אפשר בעיתונים להתייבש ולאטום אותם בשקיות מדגמות.
- שיתוף שקיות מדגם קליפntaining נייר filtermat לתוך קלטת והכניס את הקלטת לתוך מונה נצנץ microplate. הגדר הדלפק לקרוא לדקה עבור 32 P עם התאריכים להשוואה סיפק עבור אצוות של [32 P] dTTP השתמשו בניסוי. בחר בו שימוש בדגימות לקרוא באמצעות מפת צלחת ולהתחיל הדלפק.
- בכל שיטת כימות ויראלי, לחלק את הערכים שהתקבלו עבור כל RNA בדיקה על ידי הביקורת השלילית הסמוכה להכפיל ערך זה על ידי 100 כדי לקבל את עיכוב אחוז הייצור HIV-1 עבור כל לשכפל של RNAs הבדיקה. דוגמה לתוצאות השוואת RNAs מבדקים שונים בריכוזים שונים מסופק באיור 3.
Assay כדאיות התא 3.
- הסר את 96-גם הצלחות מן החממה ולהוסיף 20 μl של 5 מ"ג / מ"ל MTT (3- [4.5-דימתיל-2-thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium ברומיד) מדולל בופר פוספט של Dulbecco ( DPBS) זה טוב. דגירת צלחות fאו 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף 150 μl של isopropanol acidified עם חומר ניקוי (1% NP-40, 4 מ"מ HCl ב isopropanol) זה טוב דגירה צלחות במשך שעה 2 ב RT.
- קבע את הספיגה ב 570 ננומטר ב ספקטרופוטומטר microplate.
- חשב את חילוף חומרי MTT ביחס לכל RNA מלא בדיקה חיובי על ידי חלוקת הערך המתקבל עבור כל דגימה על ידי שליטת transfection הסמוכה לה. דוגמא לתוצאות השוואת RNAs מבחן שונה כביקורת חיובית מסופקת באיור 4.
4. Assay ההפעלה החיסונית
- הסר את 12 גם הצלחות מן החממה לשאוב את התקשורת והתרבות. לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם DPBS ולהוסיף 70 μl של חיץ תמוגה קר 22 (כולל מעכבי פרוטאז ו phosphatase, טבלה 1) זה טוב. דגירת הצלחות עבור 10 דקות על קרח.
- עבר lysates תא צינורות המייקר ומהר להקפיא אותם על ידי טבילהצינורות בחנקן נוזלי. אפשר הדגימות להפשיר וחזרו על 2 יותר מחזור הפשרת הקפאה עבור סכום כולל של 3.
- צנטריפוגה lysates במשך 15 דקות ב 4 ° C, 15,700 XG, כדי גלולה פסולת התא. מעבירים את supernatant צינורות מיקרו חדש ולקבוע את ריכוז החלבון באמצעות כחול Coomassie (ברדפורד) שיטה 23,24.
- פתור 75 מיקרוגרם של חלבון מכל מדגם ב ג'ל polyacrylamide denaturing 10% ולהעביר אל קרום nitrocellulose כפי שתואר לעיל 25,26.
- בעקבות אלקטרופורזה ולהעביר קרום, לחשוף להקות חלבון על ידי דוגרי קרום Ponceau S (לוח 1) 1 דקות ואחריו כביסה במים מזוקקים פעמים. השתמש להקות סולם חלבון כמדריך לחתוך את הממברנה 80 ו -55 kDa.
הערה: בשלב 4.4 דגימות ניתן להריץ על 16 x 18 ס"מ 2 ג'לים עד 34 kDa, כך שזה קל לחתוך את הקרום על העמדות שצוינו ולא לחתוך דרךלהקות של עניין. לחלופין, כמה ג'לים ניתן להפיק דגימות אותו כדי למנוע חיתוך הממברנה. - יש לשטוף היטב את מכתים Ponceau S עם מי מלח שנאגרו טריס המכיל 0.05% Tween 20 (TBST, טבלה 1). להוסיף TBST עם 5% חלב דל שומן על מנת לכסות את הקרום לחלוטין. דגירה ממברנות ב RT עם תסיסה במשך שעה 1.
- דגירה ממברנות O / N ב TBST עם אלבומין בסרום שור 3% (BSA) ונוגדנים מדולל ל -1 מכל 1,000 נגד ADAR1 (110 ו -150 KDA), phospho-PKR (62 KDA), ו phospho-IRF3 (47 KDA), עבור החלקים העליונים, אמצעיים ותחתונים של הממברנה, בהתאמה.
- שטפו את ממברנות 5x במשך 5 דקות עם TBST ו דגירה ב TBST עם חלב 5% דל שומן ו נוגדנים משני נגד ארנב עז שכותרתו peroxidase (מדולל ל 1 ב 5000) במשך שעה 1.
- שטוף את 5x ממברנות במשך 5 דקות עם TBST ולהחיל electrochemiluminescence פתרון (ECL) כדי להמחיש את הלהקות על סרטים על פי הוראות היצרן.
- לאחר לדמיין את להקות חלבון על סרטים, לשטוף את החלקים באמצע ההר ובתחתית הממברנה במשך 10 דקות עם פתרון הפשטת נוגדן. הדגירה ממברנות O / N ב TBST עם 3% BSA ונוגדנים נגד PKR הכולל (ב 1 ב 500) ו IRF3 (ב -1 מכל 1,000), עבור באמצע והחתיכות תחתונות, בהתאמה. חזור על שלבים 4.8. ו -4.9. באמצעות העכבר אנטי-עז שכותרתו peroxidase במקום של נוגדנים משני נגד ארנב עבור קרום PKR (באמצע).
- שטוף את הפיסה התחתונה של 5x הקרום למשך 5 דקות עם TBST ו דגירת הממברנה ב TBST עם BSA 3% במשך שעה 1 עם נוגדן נגד אקטין (מדולל ל 1 ב 5000). חזור על שלבים 4.8. ו -4.9. באמצעות עכבר אנטי-עז שכותרתו peroxidase במקום של נוגדנים משני נגד הארנב. דוגמא לתוצאות השוואת RNAs מבחן שונה כביקורת חיובית מסופקת באיור 5. ראה הטבלה של חומרים עבור הנוגדנים הספציפיים כדי לשמש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סכימטי הכללי של הנהלים מוצג באיור 2 עם תכנית transfection לדוגמה עבור שלושה RNAs ניסיוניים RNA מלא מסופק באיור 2B. עבור מבחני כדאיות התא ייצור ויראליות, מחוץ לקרוא לכל מבנה המבחן מנורמל כביקורת שלילית. משכפל הם transfected בסטים, כך שכל RNA המבחן מנורמל בקרה שלילית הסמוכים לה. הדבר נעשה על מנת למנוע נתונים לא מדויקים הקשור לעיתוי בין complexing ו transfection, אשר עלול לגרום אם, למשל, כל הבקרות השליליות הם transfected ראשון. מאז HIV-1 יכול להשפיע על מערכת חיסונית 27,28, את כדאיות תא מבחני הפעלה חיסוניות נעשים ללא תוספת של פלסמיד מבטא HIV-1.
כדי לזהות את האורך האופטימלי של מולקולות RNA התערבות מיקוד אתר נשמר ב- HIV-1 RNA (מיקום 1498-141519 זן HIV-1 NL4-3) 13, סט של siRNAs תוכננו (איור 3 א). באמצעות assay הייצור HIV-1, אחוז פעילות RT לעומת תאי transfected עם siRNA שטויות מצע דייסר ארוכה (חטאים) חושבו עבור תאי transfected עם siRNA כל מבחן בסכומים שונים של transfection שיתוף עם 100 ננוגרם של פלסמיד המבטא HIV-1 זן NL4-3 (איור 3 ב).
באמצעות assay כדאיות התא, מטבוליזם אחוז MTT נקבע עבור תאים transfected עם siRNAs היעיל ביותר שזוהו איור 3B. נתונים היו מנורמלים מטבוליזם MTT בתאים שטופלו מגיב transfection לבד (איור 4). RNA גדילי כפול ארוך (אני פוליפוני: C) מופחת כדאיות התא; עם זאת, ההשפעה הייתה משמעותית רק במינון הגבוה ביותר המוערך. אין הפחתה משמעותית כדאיות התא נצפתה siRNAs מיקוד 1498 סי טה HIV-1 RNA, ללא קשר לאורך שלהם. באמצעות assay ההפעלה החיסוני, אותה הקבוצה של RNAs הוערכה על הפוטנציאל שלהם כדי לעורר תגובות חיסוניות (איור 5). בתנאים שבהם פוליפוני לי: C הפעיל את הביטוי של p150 ADAR1 ו זירחון המושרה של PKR ו IRF3, לא היתה השפעה מהותית על סמנים ההפעלה החיסונית יכול להיבחן על מי מבין RNAs הבדיקה.
איור 1. סכמטי של השלבים לפני ואחרי אינטגרציה במחזור שכפול HIV-1. קדם-אינטגרציה (1-3) ופוסט אינטגרציה (4-7) צעדים במחזור שכפול HIV-1 מוצגים תיבות התווה . אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2 "src =" / files / ftp_upload / 54,486 / 54486fig2.jpg "/>
איור 2. סכמטי של ייצור ויראלי, כדאיויות תא מבחני הפעלה חיסוניות. (א) פלייט תאים חסידים והתרבות למשך 24 שעות. תאים הם מצופים ב 24-, 96 ו 12 צלחות גם ב 500, 100 ו -1,000 μl של תקשורת תרבית תאים לייצור ויראלי, כדאיויות תא מבחני הפעלה חיסוניות, בהתאמה. (ב) הכן צינורות transfection, תאים transfect, ותרבות במשך 48 שעות. תכנית transfection לדוגמה עבור קבוצה של שלושה RNAs בדיקה (RNA1-3) מוצגת עם שליטה ובקרה נאותה. הליך transfection מודגם גם. (ג) קרא-אאוט. לקריאה החוצה לייצור ויראלי, כדאיויות תא מבחני הפעלה חיסוניות נכתבים והסביר בפירוט בסעיפים 2, 3 ו -4 בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. </ P>
איור 3. השפעת siRNAs מבחן על ייצור HIV-1. (א) תכנון siRNAs עם אורכי סימטריות שונים. רצף נשמרת ב HIV-1 RNA (אתר היעד 1498) שימש לעצב siRNAs סימטרי ולא סימטרי (si1498-) עם אורכים שונים (17 עד 29 גדילי תחושה נוקלאוטיד). התחושה הצפויה (למעלה, שחורה) antisense (למטה, אדום) גדילים מסומנים. (ב) עיכוב של ייצור HIV-1 על ידי גרסאות אורך si1498. האחוזים (%) העיכוב של פעילות HIV-1 RT ב supernatant של תאי HEK293T טרנספקציה עם גרסות אורך si1498 סימטריות או א-סימטריות מוצג ביחס שטויות מצע דייסר ארוכות siRNA (חטאים). כל RNA בדיקה הושווה חטאים במינונים שונים לפחות שני transfections העצמאי עם שניים עד שלוש חזרות. הנתונים הם expressed כערכים ממוצע ± סטיית התקן אמצעי (SEM). נתון זה יש הבדל בין 16, זכויות יוצרים האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. השפעת אורך si1498 וריאנטים על כדאיות התא תאים HEK293T היו transfected עם פולי I:. C ב 50 ו -200 מיקרוגרם / מ"ל (PIC50 ו PIC200) ואורכים שונים ופורמטים של si1498 ב 100 ננומטר. המטבוליזם% של MTT נקבעו ביחס לתאים שטופלו מגיב transfection לבד (מוק, M) בשלוש transfections העצמאית עם שניים עד שלוש חזרות. הנתונים באים לידי ביטוי ערכים ממוצעים ± ומשווקי מנועי חיפוש. סטודנט מבחני t מזווג שימשו כדי לקבוע אם significantl transfections שוניםy (*, P <0.05) ביחס כדאיות התא מופחת התאים transfected מדומה. נתון זה יש הבדל בין 16, זכויות יוצרים האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. השפעת אורך si1498 וריאנטים על תגובות חיסון מולד. תאי HEK293T היו transfected עם PIC50, PIC200 ואורכים שונים ופורמטים של si1498 ב 100 ננומטר. הפעלת PKR ו TLR3 הוערכו על ידי מדידת PKR ו IRF3 פוספורילציה, בהתאמה. ביטוי של גן מגורה אינטרפרון (ISG) הוערך על ידי מדידת רמות p150 ADAR1 ISG ביחס הגרסה הביעה constitutively, p110 ADAR1. הביטוי של אקטין שימש כביקורת הטעינה. Figur זהדואר יש הבדל בין 16, זכויות יוצרים האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שם חוצץ / מגיב | הרכב |
| קוקטייל שיבוש ויראלי | 60 mM Tris-HCl (מ -1 M Tris-HCl, pH 7.8), 75 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl 2, 1.04 mM EDTA, 1% NP-40. |
| קוקטייל רדיואקטיביים | 60 mM Tris-HCl (מ -1 M Tris-HCl, pH 7.8), 75 KCl מ"מ, 5 מ"מ MgCl 2, 1.04 mM EDTA, 10 מיקרוגרם / מ"ל Poly (A), 0.33 מיקרוגרם / מ"ל אוליגו DT. נוסף מיד לפני השימוש: 8 מ"מ dithiothreitol (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) ו -5 μl [32 P] dTTP (3,000 Ci / מילימולעבור) כל 500 μl של קוקטייל. |
| רדיואקטיביים / קוקטייל שיבוש ויראלי | 60 mM Tris-HCl (מ -1 M Tris-HCl, pH 7.8), 75 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl 2, 1.04 mM EDTA, 0.1% NP-40, 5 מיקרוגרם / מ"ל midi (א), 0.16 מיקרוגרם / אוליגו מ"ל dT. נוסף מיד לפני השימוש: 8 מ"מ dithiothreitol (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) ו -5 μl [32 P] dTTP (3,000 Ci / mmol) עבור כל 1 מ"ל של קוקטייל. |
| 2x SSC | 17.53 גרם NaCl ו 8.82 גרם נתרן ציטרט - 2H 2 O ב 1 LH 2 O. |
| חיץ תמוגה | 50 mM Tris-HCl (מ -1 M Tris-HCl, pH 7.4), 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA (מ -0.5 M, pH 8.0), 10% v / גליצרול נ, 1% v / v NP-40. |
| Ponceau S | 2.5 גרם Ponceau S ו 5 מ"ל חומצה אצטית 500 מ"ל H 2 O. |
| TBST 6.05 גרם טריס, 8.76 גרם NaCl ו 1 מ"ל Tween 20 ב 1 LH 2 O. |
טבלת 1:. מרכיבים לא מסחרי מאגרים ריאגנטים מתכונים לכל שאינם מסחריים המאגרים ריאגנטים מסופקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
את assay ייצור HIV-1 תיאר בוצעה באמצעות תאים HEK293T (איור 2), והוא דומה מבחני לשמש מסך HIV-1 RNA עבור ribozyme שנכנס לתוקף ב -13, shRNA 10,29, siRNA 30, ו U1i RNA 11,31 אתרי היעד. באמצעות שיטות שונות כדי לכמת ייצור HIV-1, רוב המחקרים מדדו ייצור ויראלי 48 שעות לאחר שיתוף transfection של פלסמיד ביטוי HIV-1 עם RNAs מועמד. בעקבות ייצור של HIV-1, virions בשלה לעבור מחשוף פרוטאוליטים של polyproteins שלהם על ידי הפרוטאז של ה- HIV-1 להיות virions בוגרת, מסוגל להדביק תאים חדשים. עבור assay פעילות האנזים RT HIV-1 כמתואר צעדים 2.2. 2.5., הן מוערכות בייצור צעדים התבגרות, מאז האנזים RT הוא פעיל רק virions בוגרת. לעומת זאת, חלבון קפסיד ו- RNA הנגיפי יכולים להיות נוכחים בשני virions הבוגרת בשלה. לכן, לכימות ייצור HIV-1 על ידי p24 ELISA או RT-PCR מאיים לפספס השפעות של RNAs הטיפולית לפעול על מדרגת ההבשלה של מחזור השכפול HIV-1, כגון ribozymes כי למקם את virions HIV-1 32 ומולקולות מבוססות antisense המעכבות עיבוד Gag בנוסף ביטוי חלבון HIV-1 13, 31. הגבלה של מבחני ההפקה ויראלי היא כי התאים המשמשים אינם מבטאים את הקולטנים המתאימים לכניסה HIV-1 ולא יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של RNAs טיפולית על כניסה HIV-1 או אינטגרציה.
כדי להעריך את ההשפעות של RNAs נגד HIV-1 על מחזור השכפול כולו, מודלים HIV-1 זיהום שונים שימשו שורות תאים לימפוציטים שונים T או תאי דם ראשוני 5,33. מאז שורות תאים אלה קשות transfect, יותר שיטות עבודה אינטנסיביות כגון הכנסת גן וקטור lentiviral או aptamer / נטייה פפטיד נחוצות כדי לספק כמויות מספיקות של RNAs נגד HIV-1 להתבונן השפעות על שכפול HIV-1. מגבלה זו עושה את זה דיfficult להשוות את מבנה-פעילות יחסים במהירות בין גרסאות של RNA מסוים נגד HIV-1 או לבצע סינון בקנה מידה גדול כדי לזהות את אתר היעד האופטימלי עבור משפחות חדשות של RNAs נגד HIV-1. בעוד מבחני ההפקה ויראלי כבר שימושי לזיהוי מולקולות RNA נגד HIV-1 החדשה, מודלים הסלולר אלטרנטיבה בשורות תאי transfected בקלות התומכים שכפול HIV-1, כגון תאי TZM-bl, יהיה שימושי לסינון נגד HIV-1 RNAs מיקוד צעדים אחרים מחזור השכפול, כגון כניסה ואינטגרציה.
בהתאם למעמד של RNA נגד HIV-1, מנגנונים אפשריים כמה רעילות תוארו. לדוגמא, RNAs מבוסס antisense יכול להיות מחוץ יעד תופעות על RNAs הסלולר המכיל זהה או רצף דומה לאתר היעד המיועד שלהם ב HIV-1 RNA. באופן דומה, aptamers RNA, במודל של אלמנט תגובה טרנס-ההפעלה (TAR) או אלמנט בתגובה Rev (RRE), יכול להשפיע על התפקוד של יחסי ציבור הסלולרoteins, כגון חלבון RNA מחייב TAR (TRBP) 34. יש shRNAs ו siRNAs פוטנציאל הוסיף להשפיע על מסלול התערבות RNA על ידי חלבונים RNAi sequestering 35 וכמה מולקולות U1i הוכחו להשפיע על שחבור ועיבוד של RNAs הסלולר ידי בידוד חלבונים של חלבון RNA גרעיני קטן U1 36 מורכבים. בעוד חלק מהתופעות הללו ניתן למזער על ידי תכנון זהיר, מדידות של רעילויות הסלולר מסכים עבור מולקולות RNA נגד HIV-1 חדשות שימושיות למעט מולקולות עם השפעות אפשריות מחוץ היעד להתפתח הלאה. יתר על כן, השפעות חוץ-היעד יכולות בעקיפין לעכב ייצור HIV-1, מה שהופך רעיל הסלולר אומדן חשוב באימות היעילות של מולקולות אנטי HIV-1 החדשות מזוהות ממסכי ייצור HIV-1.
את assay כדאיות התא כמתואר צעדים 3.1. 3.4. וריאציה היא של assay סטנדרטי, שבו נעשה שימוש כדי להקרין מולקולה אנטי מגוונת זה 37. את assay מודד את הפעילות של NAD (P) H-תלוי אנזימים הסלולר להפחית את מגיב MTT כדי הצורה הסגולה המסיסה שלה, formazan. הפרוטוקול מותאם משיטות שפורסמו בעבר 38 וכמה ערכות זמינות באמצעות MTT או חומרים כימיים אחרים קשורים זה לזה. אמנם חשוב כדי assay כדאיות התא הקו הסלולרי משמש לסינון RNAs נגד HIV-1, יש לציין כי שורות תאים שונות להשתנות ברגישות כלפי רעילות הנגרמת RNA. לדוגמה, ריינולדס et al., הוכיחו כי siRNAs המצע דייסר לא הייתה השפעה על כדאיות התא בתאי HEK293T, אבל כדאיות התא מופחת משמעותית MCF7, DU145 והלה S3 תאים 39. עבור assay המתואר כאן, תאי HEK293T משמשים כדוגמא (איור 4); עם זאת, באותו assay גם נעשה בתאי MCF7 להעריך רעילות אפשרית בקו תא כי הוא רגיש יותר רעיל קטן הנגרמת RNA 16.
e_content "> מאז RNAs נגד HIV-1 לא יכול להיות מעובד בפני המערכת החיסונית אדפטיבית, הם נחשבים פחות immunogenic לעומת אנטי HIV-1 חלבונים או פפטידים. עם זאת, בהתאם לרצף או המבנה שלהם, הם יכולים לעורר מולד תגובה חיסונית, וכמה חיישנים חיסוניים מסלולי איתות זוהו שיכולים להגיב RNA הקטן (הנסקרת ב 40). ב assay ההפעלה החיסוני המתואר כאן, רמות PKR פוספורילציה IRF3 הושוו בתאי transfected עם RNA הקטן כקובץ אינדיקצית הפעלת PKR או TLR3, בהתאמה. שניהם חיישני RNA נמצאים במגוון רחב של שורות תאים והפעילו יכול להוביל לייצור של סוג 1 אינטרפרונים, במקרה של PKR, א-כיבוי בתרגום. כדי להעריך פוטנציאל RNAs נגד HIV-1 כדי להפעיל את הייצור של סוג 1 אינטרפרונים ידי דרכים חלופיות, רמות של ADAR1 הגן מגורה אינטרפרון (p150) גם הושוו בתאים transfected עםRNAs נגד HIV-1. כפי שהוכח על ידי ההשפעות של השליטה החיובית dsRNA הארוך, פולי לי: C, כל התגובות האלה היו פעילים תאי HEK293T (איור 5) והשפעות דומות נצפו תאי MCF7 16. מאז התגובות הללו יכולים לעכב ייצור HIV-1 בהעדר השפעות על כדאיויות תא, assay ההפעלה החיסוני מספק אימות נוספת ליעילות של RNAs נגד HIV-1 החדשה. מדידות נוספות כי ניתן להוסיף הערכה זו כוללות מדידת הייצור של ציטוקינים דלקתיים מסוג 1 אינטרפרונים ב supernatant תרבית תאים, ומדידת הביטוי של גנים יותר מגורה אינטרפרון. מאחר ותאי יעד HIV כגון CD4 + T תאי מקרופאגים יכולים להביע רמות שונות של חיישני חיסון מולדים, מועמדים המזוהים מן המבחנים המתואר בפרוטוקול זה אמורים גם להיות מוערך לגירוי פוטנציאל חיסוני בסוגי התאים אלה.עבור כל המבחנים לתארד, השלב הקריטי לקבלת תוצאות לשחזור המדויקות הוא ההכנה של צינורות transfection דנ"א או רנ"א (שלב 1.3.). ה- DNA פלסמיד או RNA צריך להיות של טוהר גבוה עם ריכוזים לקביעה מדויקת. זה גם קריטי כדי לכלול את השליטה והבקרה הנאותה. להערכת פלסמידים ביטוי RNA הבדיקה חדשים ב assay ייצור ויראלי, פקד שלילי מתאים הוא פלסמיד הביטוי הריק. לקבלת RNAs מבוסס antisense, פלסמיד בקרה שלילי נוסף להביע RNA ללא מיקוד גם צריך להיות כלול. רצפים עבור ribozyme ללא מיקוד ו shRNA שאינם משפיעים ייצור HIV ניתנים 13. לקבלת siRNAs בדיקה, הביקורת השלילית היחידה שיכול לשמש הוא RNA ללא מיקוד ואת רצף siRNA מתאים ללא מיקוד עבור assay ייצור ויראלי מסופק 16. עבור כדאיות התא מבחני ההפעלה החיסונית, הביקורת השלילית ומחייב תאים עם מגיב transfection לבד וזה גritical כי כביקורת חיובית כגון פולי לי: C נכללת כדי לאשר כי התאים מגיבים רעילות הנגרמת RNA או הפעלה חיסונית. עבור פלסמידים ביטוי RNA, הפלסמיד הריק גם יש לכלול על מנת להבטיח כי הווקטור עוצמה אינו שיש השפעות רעילות על התאים.
באופן כללי, המבחנים המתוארים בזאת מייצגים צעד ראשון טוב כלפי זיהוי של טיפולי RNA בטוחים ויעילים לשימוש גן HIV-1 או טיפול תרופתי. עבור מולקולות מיקוד HIV-1 RNA, זה חשוב גם לקחת בחשבון את שימור אתר היעד שלהם ב- HIV-1 במחזור זנים, ושיטות מפורטות לחשב שימור רצף פורסם בעבר 15. כדי להעביר מולקולה קדימה לתוך ניסויים קליניים, מחקרים רעילים ויעילות לטווח ארוך צריכות להתבצע בתאים אנושיים ראשוניים במודלים של בעלי חיים כדי לאשר מועמדים המזוהים יהיו בטוחים ויעילים במרפאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
העבודה המוצגת כאן נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) (מעניק DCB-120,266, PPP-133,377 ו HBF-348,967 ל AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
- Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
- Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
- Scarborough, R. J., Gatignol, A.
- Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
- Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
- McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
- Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
- Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
- Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
- Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
- Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
- Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
- Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
- Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
- Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
- Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M.
- Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
- Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
- Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
- Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
- ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
- Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
- Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
- Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
- Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
- Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
- Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
- Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
- Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
- Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).
