Introduction
Eine Einschränkung der derzeitigen HIV-1-Behandlungen ist, dass sie chronisch Fortschreiten der Krankheit zu verhindern, verabreicht werden müssen. Transplantation von HIV-1 resistent T - Lymphozyten oder hämatopoetischen Stammzellen, hat das Potenzial , Langzeitkontrolle der HIV-1 - Replikation in Abwesenheit von Arzneimitteltherapie 1,2 und kann auch ein wirksamer Ansatz sein , um eine HIV-1 Heilung zu erreichen 3. Ein Weg , um Zellen resistent gegen HIV-1 - Replikation rendern ist ein oder mehrere Gene einzuführen , kodierend für anti-HIV-1 RNAs oder Peptide in einem infizierten Individuum Zellen während einer autologe Transplantation 4. Mehrere Kandidaten anti-HIV-1 - Gene wurden mit einigen klinischen Studien Eingabe in Kombinationen von zwei oder drei 5 6, die die Entwicklung von HIV-1 Resistenz gegenüber einem einzelnen Gen zu verhindern.
Anti-HIV-1 RNAs sind unter den ersten Kandidaten für die Kombination Gentherapie aufgrund ihrer niedrigen Potential Immunantworten hervorzurufen, und weil siesind von sehr kurzen Gensequenzen transkribiert. Einige anti-HIV-1 RNAs wurden entwickelt Viruseintritt und Integration zu zielen. Allerdings sind die meisten anti-HIV-1 - RNA das Ziel nach der Integrationsschritte im viralen Lebenszyklus (Abbildung 1). Nachintegration Inhibitoren umfassen Decoy RNAs, die Targeting - HIV-1 - regulatorischen Proteine Tat oder Rev 1 und Antisense-RNAs beruhen, verschiedene Standorte in HIV-1 - RNA - Targeting, wie Ribozyme 7, 8 und shRNAs U1i RNAs 9. Verfahren, die die Wirksamkeit von Anti-HIV-1 RNAs gehören die Überwachung der viralen Replikation in Zellen , transduziert mit Genen , kodierend für Kandidaten RNAs und Mess virale Produktion in Zellen , transient transfiziert mit Plasmiden exprimieren Kandidaten RNAs und eine HIV-1 - Expressionsplasmid 10 zum Vergleich verwendet wurden -13. Wir haben zuvor eine HIV-1 - Produktion zu screenen Assay HIV-1 RNA für neue Ribozym - Zielstellen 13-15 verwendet. Diese Verfahren sind seit verfeinert das Format einer RNA zu optimieren,Interferenz - Molekül von dem Plasmid DNA als shRNA oder geliefert als synthetisches siRNA 16 ausgedrückt. Der Assay misst die Produktion von reifen Viren aus menschlichen embryonalen Nieren (HEK) , 293T - Zellen, und kann verwendet werden , die Auswirkungen von Inhibitoren zu vergleichen , die nach der Integrationsschritte in der HIV-1 - Replikationszyklus Ziel (Abbildung 1). Für Inhibitoren , die Pre-Integrationsschritte Ziel, alternative Assays wie eine TZM-bl Zelle Infektiosität Assay 17 nötig sind , um antivirale Wirksamkeit zu bewerten.
Wichtige Sicherheitsbedenken für die Lieferung von Anti-HIV-1-RNA in der Klinik sind potenzielle Nebeneffekte auf die menschliche RNAs oder Proteine, und die Aktivierung der angeborenen Immunsensoren. Um die Toxizität von anti-HIV-1 siRNAs bewerten, haben wir einen Zelllebensfähigkeitstest in verschiedenen Zelllinien 16 verwendet. Wir maßen auch die Aktivierung der doppelsträngigen RNA-Immunsensoren, RNA aktivierte Proteinkinase R (PKR) und Toll-like-Rezeptor 3 (TLR3), sowie expression des Interferon-stimulierte Gen, ADAR1 p150. Diese Assays können verwendet werden, um zu bestätigen, dass die Wirksamkeit von Anti-HIV-1-RNA ist nicht auf indirekte Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen oder Immunsensoraktivierung. Sie sind auch nützlich in Ausnahme von Kandidaten RNAs mit potentiellen Toxizitäten von der weiteren Entwicklung.
In den folgenden Protokolle, Verfahren neue therapeutische RNAs zu identifizieren und zu optimieren das Format der bestehenden beschrieben werden. Die Verfahren sind nützlich für das Screening RNA basieren Nachintegration Inhibitoren der HIV-1 - Replikation und angepasst werden könnten andere post-Integration - Inhibitoren, wie kleine Moleküle Targeting Rev vermittelte Export von viraler RNA 18 oder CRISPR / CAS - Systeme entwickelt , um screenen integrierten Ziel HIV-1 DNA 19.
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Protocol
1. Zellen und Transfektionen
- Kultur HEK 293T Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt. Vorbereiten eines 2 x 10 5 Zellen / ml - Suspension in dem Zellkulturmedium. In 500, 100 und 1000 & mgr; l der Zellsuspension in jede Vertiefung von 24-Well, 96-Loch - und 12-Well - Platten, die für die virale Produktion, die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierung Assays, bzw. (2A).
- Vorsichtig schwenken die Platten und inkubieren O / N bei 37 ° C mit 5% CO 2. Wachsen Zellen zu 50-70% Konfluenz.
- Nach einer Transfektion Plan, bereiten Verdünnungen von Test RNAs und ihre Kontrollen in 1,5 ml Mikroröhrchen (Beispiel 2B).
- Für die virale Produktion Assay, bereiten eine 10 ng / & mgr; l Verdünnung einer HIV-1-Expressionsplasmid und 10 & mgr; l zu jedem Röhrchen hinzufügen. Vorbereitung Die nächsten 5 uM Verdünnungen von Test RNAs und eine negative Kontrolle RNA. In 2,5 oder 10 & mgr; l jeder Test RNA und negative Kontrolle Verdünnung auf die entsprechenden Rohre für 25 oder 100 nM Endkonzentrationen.
- Für die Zelllebensfähigkeitstest vorbereiten 5 uM Verdünnungen von Test RNAs und eine 10 mg / ml Verdünnung der positiven Kontroll-RNA, niedermolekulare Poly I: C. Fügen Sie 2 ul Test RNA oder positive Kontroll-RNA-Verdünnungen zu den entsprechenden Röhrchen 100 nM oder 200 & mgr; g / ml Endkonzentration, respectively.
- Für die Immunaktivierung Test werden 20 ul Test RNA oder positive Kontroll-RNA Verdünnungen, hergestellt in Schritt 1.3.2. zu den entsprechenden Röhrchen 100 nM oder 200 & mgr; g / ml Endkonzentration, respectively.
Hinweis: Für den Test-RNA-Expressionsplasmide Herstellung von 10 ng / ul-Verdünnungen anstelle der 5 & mgr; M Verdünnungen von Test RNAs, so dass endgültige Mengen von 25 und 100 ng für Schritt 1.3.1. und 100 ng für die Schritte 1.3.2. und 1.3.3.
- In 50, 25 oder 75 & mgr; l DMEM zu jeder Transfektion Rohr für die virale production, die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierung Assays sind. Für die virale Produktion Assays bringen Zellen und bereit Transfektion Rohre zu einem Bio-Sicherheitsstufe 3 (BSL3) Labor vor dem nächsten Schritt.
- Fügen Sie 2 ul des Transfektionsreagenz sequentiell an die Transfektion Röhrchen und Inkubation 15 bis 20 min-Komplexen zu erlauben, zu bilden. Siehe Tabelle der Materialien für die spezifischen Transfektionsreagenz verwendet werden.
- Fügen Sie die gesamte Transfektionsgemischs aus jedes Mikroröhrchen tropfenweise auf die entsprechenden Positionen in den Zellkulturplatten. Leicht geschwenkt und die Platten für 48 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2 inkubieren.
- Messen Sie HIV-1 - Produktion (Abschnitt 2), die Lebensfähigkeit der Zellen (Abschnitt 3) und Immunaktivierung (Abschnitt 4) in den Zellkulturplatten (2C).
2. Viral Produktion Assay
- Entfernen Sie die 24-Well-Zellkulturplatten aus dem Inkubator und vorsichtig schwenken die Platten im Inneren der BSL3 ZellkulturHaube. Übertragung von 150 & mgr; l Überstand aus jeder Vertiefung auf eine gut entspricht, in einer 96-Well-Flachbodenplatte, die verwendet werden, HIV-1-Produktion zu quantifizieren.
Hinweis: Common viral Quantifizierungsassays umfassen die Expression des HIV-1 - Kapsidprotein Messung (p24) durch enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 20, viraler RNA durch reverse Transkriptase - Polymerase - Kettenreaktion quantifiziert (RT-PCR) 21 und Messen der Aktivität der HIV-1 RT-Enzym. Die Schritte 2.2 bis 2.5 erklären Methoden HIV-1 - RT - Aktivität 13,15,16 zu quantifizieren. - Transfer 5 & mgr; l Überstand zu entsprechenden Vertiefungen in einer 96-Well - Platte, enthaltend 25 & mgr; l einer viralen Störung Cocktail 15 (Tabelle 1). Inkubieren der Mischung für 5 min bei RT und übertragen die Platte auf eine Radioaktivität Workstation.
Hinweis: Schritt 2.2. Wenn ein Radioaktivität Workstation ist nur notwendig, nicht im BSL3 Labor ist. Wenn die Platten müssen nicht aus der entfernt werdenBSL3 Labor, gehen 2.3 zu treten. und fügen Sie 50 ul radioaktivem / viralen Störung Cocktail (Tabelle 1) anstelle der 25 ul radioaktiver Cocktail. - Bereiten Sie eine radioaktive Cocktail 15 (Tabelle 1), und fügen Sie 25 ul in jede Vertiefung der viralen Überstand und Störungen Cocktail. Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 2 Stunden.
- Spot 5 ul der Reaktionsmischung auf entsprechenden Plätzen in einer Glasfaser Di Ethyl Aminoethyl (DEAE) Filtermat Papier und ermöglichen die Flecken für 10 min trocknen. Spot der Reaktionsmischung auf jedem anderen Platz, so dass keine zwei Proben unmittelbar aneinander Grenze. Dies hilft, cross-over zwischen den Proben zu vermeiden, wenn in Counts pro Minute (cpm) Schritt 2.6 bestimmt wird.
- Waschen Sie die Papiere für 5 min 5x mit 2x Salz Natriumcitrat (SSC) Puffer (Tabelle 1), gefolgt von zwei 1 minütiges Waschen mit 95% Ethanol. Lassen Sie die Papiere, um zu trocknen und zu versiegeln sie in einen Probenbeutel verpackt.
- Clip Probenbeutel containing die Filtermatte Papier in eine Kassette und legen Sie die Kassette in einem Mikrotiterplatten-Szintillationszähler. Stellen Sie den Zähler cpm für 32 P mit dem Referenzdatum für die Partie von [32 P] dTTP in dem Experiment verwendet zur Verfügung gestellt zu lesen. Wählen Sie die Proben zu lesen, die Platte Karte unterhalten und den Zähler zu starten.
- Für jede viral Quantifizierungsmethode, teilen die Werte für jede Test RNA durch die benachbarte negative Kontrolle erhalten und multiplizieren diesen Wert mit 100 für jede Wiederholung der Test RNAs die prozentuale Hemmung der HIV-1-Produktion zu erhalten. Ein Beispiel der Ergebnisse verschiedener Test RNAs in unterschiedlichen Konzentrationen zu vergleichen ist in 3 bereitgestellt.
3. Zell Viability Assay
- Entfernen Sie die Platten mit 96 Vertiefungen aus dem Inkubator und füge 20 & mgr; l von 5 mg / ml MTT (3- [4,5-Dimethyl-2-thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium-bromid), verdünnt in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung ( DPBS) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platten foder 3 Stunden bei 37 ° C.
- Zugabe von 150 ul angesäuertes Isopropanol mit einem Detergens (1% NP-40, 4 mM HCl in Isopropanol) in jede Vertiefung und Inkubieren der Platten für 2 h bei RT.
- Bestimmen Sie die Absorption bei 570 nm in einem Mikroplatten-Spektralphotometer.
- Berechnen der relativen MTT-Metabolismus für jede positive Kontrolle und Test-RNA durch den Wert für jede Probe durch seinen benachbarten Transfektionskontrolle erhalten dividiert wird. Ein Beispiel der Ergebnisse verschiedener Test RNAs und eine positive Kontrolle Vergleich ist in Figur 4 vorgesehen.
4. Immunaktivierung Assay
- Entfernen Sie die 12-Well-Platten aus dem Inkubator und absaugen Kulturmedien. Die Zellen vorsichtig waschen zweimal mit DPBS und 70 ul Puffer kalt Lyse in jede Vertiefung 22 (einschließlich Protease und Phosphatase - Inhibitoren, Tabelle 1) hinzuzufügen. Inkubieren Sie die Platten für 10 Minuten auf Eis.
- Übertragen Sie Zelllysate auf Mikroröhrchen und sie schnell frieren durch das EintauchenRöhrchen in flüssigem Stickstoff. Lassen Sie die Proben für 2 weitere Gefrier-Auftau-Zyklen für insgesamt 3 aufzutauen und zu wiederholen.
- Zentrifugation der Lysate 15 min bei 4 ° C, 15.700 xg, um Zelltrümmer zu pelletieren. Den Überstand auf neue Mikroröhrchen und bestimmen die Proteinkonzentration unter Verwendung des Coomassie - Blau (Bradford) Methode 23,24.
- Auflösen 75 ug Protein aus jeder Probe in einem 10% igen denaturierenden Polyacrylamid - Gel und Transfer auf eine Nitrocellulosemembran , wie zuvor beschrieben 25,26.
- (Tabelle 1) für 1 min , gefolgt von Waschen in doppelt destilliertem Wasser nach der Elektrophorese und Transfer auf eine Membran, offenbaren Proteinbanden durch die Membran in Ponceau S inkubiert. Verwenden Sie die Bänder und Proteinleiter als Führung der Membran bei 80 und 55 kDa zu schneiden.
Hinweis: In Schritt 4.4 kann mit Hilfe von 16 x 18 cm 2 Gelen ausgeführt werden , bis zu 34 kDa, so dass es einfach ist , die Membran an den angegebenen Positionen zu schneiden und nicht durch den ausgeschnittenenBands von Interesse. Alternativ können mehrere Gele mit den gleichen Proben durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass die Membran zu schneiden. - Auswaschen der Ponceau S Färbung mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung , enthaltend 0,05% Tween 20 (TBST, Tabelle 1). In TBST mit 5% fettfreie Milch, um vollständig die Membranen abdecken. Inkubieren der Membranen bei RT unter Rühren für 1 Stunde.
- Inkubieren der Membranen O / N in TBST mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) und 1 in 1000 gegen ADAR1 verdünnten Antikörper (110 und 150 kDa), phospho-PKR (62 kDa) und phospho-IRF3 (47 kDa), für die oberen, mittleren und unteren Teile der Membran sind.
- Waschen Sie die Membranen für 5 min mit TBST 5x und in TBST mit 5% fettfreie Milch und Peroxidase-markierten Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (verdünnt auf 1 in 5000) für 1 Stunde inkubiert.
- Waschen Sie die Membranen 5x 5 min mit TBST und gelten Elektrochemilumineszenz (ECL) Lösung, die Bänder auf Filme zu visualisieren den Anweisungen des Herstellers entsprechend.
- Nach Visualisierung auf Filme, die die Proteinbanden, wasche die mittleren und unteren Stücke der Membran für 10 min mit einem Antikörper Ausstreiflösung. Inkubieren der Membranen O / N in TBST mit 3% BSA und Antikörper gegen Gesamt PKR (bei 1 in 500) und IRF3 (bei 1 in 1000), für die mittleren und unteren Teile, respectively. Wiederholen Sie die Schritte 4.8. und 4.9. unter Verwendung von Peroxidase-markiertem Ziege-anti-Maus anstelle des anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers für die PKR-Membran (mittel).
- Waschen Sie das Unterteil der Membran 5x für 5 min mit TBST und die Membran in TBST mit 3% BSA für 1 h inkubiert mit einem Antikörper gegen Actin (verdünnt auf 1 in 5000). Wiederholen Sie die Schritte 4.8. und 4.9. unter Verwendung von Peroxidase-markiertem Ziege-anti-Maus anstelle des anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers. Ein Beispiel der Ergebnisse verschiedener Test RNAs und eine positive Kontrolle zu vergleichen ist in 5 vorgesehen. Siehe Tabelle der Materialien für die spezifischen Antikörpern verwendet werden.
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Representative Results
Eine allgemeine schematische Darstellung der Verfahren ist in Figur 2 mit einem Beispiel der Transfektion Plan für drei Test RNAs und einer Steuer RNA bereitgestellt in 2B gezeigt. Für die virale Produktion und Zelllebensfähigkeitstests, die Auslese für jedes Testkonstrukt wird auf eine negative Kontrolle normalisiert. Replikate werden in Sätzen transfiziert, so daß jeder Test RNA an seinen benachbarten negativen Kontrolle normiert. Dies geschieht, um unrichtige Daten auf die Zeit zwischen Transfektion und Komplexierung bezogen vermeiden, die, wenn beispielsweise ergeben können, alle negativen Kontrollen zuerst transfiziert werden. Da HIV-1 - Immunantworten 27,28, die die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierung Assays beeinflussen können , werden ohne die Zugabe eines HIV-1 exprimierenden Plasmids durchgeführt.
Zur Identifizierung der optimalen Länge der RNA-Interferenz-Moleküle gezielt eine konservierte Stelle in HIV-1-RNA (Position 1498-141519 in HIV-1 - Stamm NL4-3) 13, wurden eine Reihe von siRNAs entworfen (3A). Verwendung des HIV-1-Produktion Assay transfiziert der Prozentsatz der RT-Aktivität im Vergleich zu Zellen, die mit einem langen Dicer Substrat nonsense siRNA (Sins) wurde für Zellen, die mit jeder Test siRNA bei unterschiedlichen Mengen an Co-Transfektion mit 100 ng eines Plasmids transfiziert berechnet exprimierenden HIV-1 - Stamm NL4-3 (3B).
Verwendung der Zelllebensfähigkeitstest wurde die prozentuale Metabolismus von MTT bestimmt für den wirksamsten siRNAs transfizierten Zellen in 3B identifiziert. Die Daten wurden in Zellen mit dem Transfektionsreagenz allein (Figur 4) behandelt , um MTT - Metabolismus normalisiert. Eine lange doppelsträngige RNA (Poly I: C) reduzierte die Lebensfähigkeit der Zellen; jedoch war die Wirkung nur von Bedeutung bei der höchsten Dosis bewertet. Keine signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen wurde für siRNAs Targeting die 1498 si beobachtet te in HIV-1 RNA, unabhängig von deren Länge. Verwendung des Immunaktivierungsassay wurden die gleichen Satz von RNAs untersucht auf ihre mögliche Immunantworten (Abbildung 5) auszulösen. Unter Bedingungen, wo Poly I: C, die Expression von p150 ADAR1 und induzierte Phosphorylierung von PKR und IRF3, keine signifikante Wirkung auf die Immunaktivierungsmarker aktiviert könnte für jede der Test RNAs beobachtet werden.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Pre- und Post-Integrationsschritte in der HIV-1 - Replikationszyklus. Pre-Integration (1-3) und Post-Integration (4-7) Schritte in der HIV-1 - Replikationszyklus werden in umrissener Boxen gezeigt . Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2. Schematische Darstellung der Virusproduktion, die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierung Assays. (A) Platte anhaftenden Zellen und Kultur für 24 Stunden. Zellen werden in 24- zogen, 96- und 12- Well-Platten in 500, 100 und 1.000 & mgr; l von Zellkulturmedien für die Virusproduktion, die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierungsassays, respectively. (B) Bereiten Transfektion Rohre, transfizierbaren Zellen und Kultur für 48 Stunden. Ein Beispiel Transfektion Plan für einen Satz von drei Test RNAs (RNA1-3) mit geeigneten Kontrollen gezeigt. Das Transfektionsverfahren ist ebenfalls dargestellt. (C) Das Auslesen. Das Auslesen für die Virusproduktion, die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierung Assays werden geschrieben und im Detail erläutert in den Abschnitten 2, 3 und 4. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. </ P>
Abbildung 3. Wirkung der Test siRNAs auf HIV-1 - Produktion. (A) Auslegung von siRNAs mit verschiedenen Längen und Symmetrien. Eine konservierte Sequenz in HIV-1-RNA (1498-Zielstelle) verwendet zu entwerfen symmetrischer und asymmetrischer siRNAs (si1498-) mit unterschiedlichen Längen (17 bis 29 Nukleotid Sense-Stränge). Der erwartete Sinn (oben, schwarz) und Antisense (unten, rot) Stränge angezeigt. (B) Hemmung der HIV-1 - Produktion durch si1498 Längenvarianten. Die prozentuale (%) Inhibierung der HIV-1-RT-Aktivität im Überstand von transfizierten HEK293T-Zellen mit symmetrischer oder asymmetrischer si1498 Längenvarianten wird zu einem langen Dicer Substrat nonsense siRNA (Sins) relativ gezeigt. Jeder Test-RNA wurde im Vergleich zu Sins in verschiedenen Dosierungen in mindestens zwei unabhängigen Transfektionen mit zwei bis drei Replikaten. Die Daten sind exprEssed als Mittelwerte ± Standardfehler Mittel (REMs). Diese Zahl hat sich von 16, Copyright American Society for Microbiology geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4. Wirkung von si1498 Längenvarianten auf die Lebensfähigkeit der Zellen HEK293T - Zellen transfiziert wurden mit Poly I:. C bei 50 und 200 & mgr; g / ml (pIC 50 und PIC200) und unterschiedliche Längen und Formaten der si1498 bei 100 nM. Die% Metabolismus von MTT wurde mit dem Transfektionsreagenz allein (Mock, M) in drei unabhängigen Transfektionen mit zwei bis drei Wiederholungen behandelt relativ zu Zellen bestimmt. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. Der ungepaarte Student t-Tests wurden, ob die verschiedenen Transfektionen significantl zu bestimmeny (*, p <0,05) reduziert die Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu den mock-transfizierten Zellen. Diese Zahl hat sich von 16, Copyright American Society for Microbiology geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Wirkung von si1498 Längenvarianten auf angeborenen Immunantwort. HEK293T - Zellen wurden mit pIC 50 transfiziert, PIC200 und unterschiedlichen Längen und Formate von si1498 bei 100 nM. Aktivierung von PKR und TLR3 wurden durch Messung phosphorylierten PKR und IRF3 ausgewertet, respectively. Expression eines Interferon-Gens stimuliert (ISG) wurde durch Messung der ISG ADAR1 p150 Ebenen relativ zur konstitutiv exprimierte Variante ADAR1 p110 ausgewertet. Die Expression von Actin wurde als Ladekontrolle verwendet. Diese figure wurde von 16, Copyright American Society for Microbiology geändert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Name des Buffer / Reagenz | Zusammensetzung |
| Viral Störung Cocktail | 60 mM Tris-HCl (1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,04 mM EDTA, 1% NP-40. |
| Radioaktive Cocktail | 60 mM Tris-HCl (1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,04 mM EDTA, 10 ug / ml Poly (A), 0,33 & mgr; g / ml Oligo - dT. Hinzugefügt unmittelbar vor dem Gebrauch: 8 mM Dithiothreitol (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) und 5 ul [32 P] dTTP (3000 Ci / mmol) Für jeweils 500 & mgr; l-Cocktail. |
| Radioaktive / viralen Störung Cocktail | 60 mM Tris-HCl (1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,04 mM EDTA, 0,1% NP-40, 5 & mgr; g / ml Poly (A), 0,16 & mgr; g / ml Oligo dT. Hinzugefügt unmittelbar vor der Verwendung: 8 mM Dithiothreitol (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) und 5 & mgr; l [32 P] dTTP (3000 Ci / mmol) pro 1 ml Cocktail. |
| 2x SSC | 17,53 g NaCl und 8,82 g Natriumcitrat - 2H 2 O in 1 l H 2 O. |
| Lysepuffer | 50 mM Tris-HCl (1 M Tris-HCl, pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA (0,5 M, pH 8,0), 10% v / v Glycerol, 1% v / v NP-40. |
| Ponceau S | 2,5 g Ponceau S und 5 ml Essigsäure in 500 ml H 2 O. |
| TBST 6,05 g Tris, 8,76 g NaCl und 1 ml Tween 20 in 1 l H 2 O. |
Tabelle 1:. Die Komponenten der nichtkommerziellen Puffer und Reagenzien Rezepte für alle nicht-kommerziellen Puffer und Reagenzien werden zur Verfügung gestellt.
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Discussion
Die HIV-1 - Produktion beschriebenen Assay wurde unter Verwendung von HEK293T - Zellen (Figur 2) durchgeführt und ist ähnlich Assays verwendet HIV-1 - RNA für eine effektive Ribozym 13, shRNA 10,29, siRNA 30 und U1i RNA 11,31 Zielstellen zu screenen. Mit Hilfe verschiedener Methoden HIV-1-Produktion zu quantifizieren, wurden die meisten Studien virale Produktion 48 Stunden nach der Co-Transfektion eines HIV-1-Expressionsplasmid mit Kandidaten RNAs gemessen. Nach der Produktion von HIV-1, unterzogen unreifen Virionen proteolytische Spaltung ihrer Polyproteine durch HIV-1-Protease reife Virionen zu werden, der fähig ist, neue Zellen zu infizieren. Für die HIV-1-RT-Enzym-Aktivitätstest in Schritten 2.2 beschrieben. beide bis 2,5., die Herstellung und Reifungsschritte ausgewertet werden, da das RT-Enzym nur aktiv in reifen Virionen ist. Im Gegensatz dazu kann das Kapsid-Protein und viralen RNA in beiden reifen und unreifen Virionen vorhanden sein. Daher Quantifizierung von HIV-1-Produktion durch p24 ELISA oder RT-PCR may verpassen Effekte von therapeutischen RNAs, die auf dem Reifungsschritt des HIV-1 - Replikationszyklus, wie beispielsweise Ribozyme wirken , die zu HIV-1 - Virionen 32 und Antisense-basierte Moleküle lokalisieren , die Gag - Prozessierung zusätzlich zu HIV-1 - Proteinexpression 13, hemmen 31. Eine Begrenzung der viralen Produktion Assays ist, dass die verwendeten Zellen nicht über die entsprechenden Rezeptoren für HIV-1 Eintrag exprimieren und nicht verwendet werden kann, die Effekte von therapeutischen RNAs auf HIV-1-Eintrag oder die Integration zu bewerten.
Um die Auswirkungen von anti-HIV-1 RNAs auf den gesamten Replikationszyklus, verschiedene HIV-1 - Infektionsmodellen zu bewerten wurden in verschiedenen T - Lymphozyten - Zelllinien oder primäre Blutzellen 5,33 verwendet. Da diese Zelllinien schwierig zu transfizieren, arbeitsintensiver Verfahren wie lentiviralen Vektor Geninsertion oder Aptamer / Peptid-Konjugation erforderlich sind ausreichende Mengen an anti-HIV-1 RNAs zu liefern, um Auswirkungen auf die HIV-1-Replikation zu beobachten. Diese Einschränkung macht es difficult um schnell die Struktur-Wirkungs-Beziehung zwischen Varianten eines bestimmten anti-HIV-1-RNA-Vergleich oder Groß Screening durchzuführen, die optimale Zielstelle für neue Klassen von anti-HIV-1 RNAs zu identifizieren. Während virale Produktion Assays zur Identifizierung von neuen anti-HIV-1-RNA-Molekülen, alternative Zellmodellen in leicht transfizierten Zelllinien nützlich erwiesen, die HIV-1-Replikation zu unterstützen, wie TZM-bl-Zellen wäre nützlich für das Screening von anti-HIV-1 RNAs andere Schritte in dem Replikationszyklus, wie Eingabe und Integration Targeting.
In Abhängigkeit von der Klasse von anti-HIV-1 RNA wurden mehrere mögliche Mechanismen der Toxizität beschrieben. Beispielsweise Antisense-basierte RNAs haben off-target können Effekte auf die zelluläre RNAs die gleiche oder eine ähnliche Sequenz zu ihren beabsichtigten Zielstelle in HIV-1 RNA enthält. In ähnlicher Weise RNA-Aptamere, nach dem Vorbild der trans-Aktivierung-Response-Element (TAR) oder Rev-Response-Element (RRE), könnte die Funktion der zellulären pr beeinflussenoteins wie die TAR - RNA - Bindungsprotein (TRBP) 34. shRNAs und siRNAs haben den zusätzlichen Potential , die RNA - Interferenz - Weg durch Sequestrierung RNAi - Proteine 35 und einigen U1i Moleküle das Spleißen und Verarbeitung von zellulären RNAs gezeigt worden beeinflussen beeinflussen durch Proteine der U1 small nuclear RNA-Protein - Komplex 36 zu maskieren. Während einige dieser Wirkungen, die durch sorgfältiges Design minimiert werden kann, Messungen der zellulären Toxizität in Screens für neue Anti-HIV-1-RNA-Moleküle sind in ausschließlich Moleküle mit möglichen Nebeneffekte von der weiteren Entwicklung nützlich. Darüber hinaus könnte Auswirkungen Off-Target indirekt von HIV-1-Produktion hemmen, zelluläre Toxizität einen wichtigen Messung in der Wirksamkeit von neuen Anti-HIV-1-Moleküle Validierung identifiziert von HIV-1-Produktion Bildschirme.
Die Zelllebensfähigkeitstest in den Schritten 3.1. bis 3.4. ist eine Variation eines Standard-Assays, die verschiedene antivirale Molekül verwendet wurde, zu screenen S37. Der Assay mißt die Aktivität von NAD (P) H-zelluläre Enzyme abhängigen das MTT-Reagens in seine unlösliche Form lila Formazan zu reduzieren. Das Protokoll wird von zuvor veröffentlichten Verfahren angepasst 38 und mehrere Kits sind MTT oder anderen eng verwandten Reagenzien. Während es wichtig ist, die Lebensfähigkeit der Zellen in der Zelllinie zum Screening von anti-HIV-1 RNAs verwendet Assay sollte, dass verschiedene Zelllinien zu beachten, in ihrer Empfindlichkeit gegenüber RNA-induzierten Toxizität variieren. Zum Beispiel Reynolds et al. Zeigten , dass Dicer Substrat siRNAs keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen in HEK293T - Zellen hatten, aber deutlich reduziert die Lebensfähigkeit der Zellen in MCF7, DU145 und HeLa S3 Zellen 39. Für die hier beschriebenen Tests sind HEK293T - Zellen als Beispiel (Figur 4) verwendet wird ; jedoch hat die gleichen Assay auch in MCF7 - Zellen durchgeführt wurden potentielle Toxizität in einer Zelllinie zu bewerten , die empfindlicher auf kleine RNA-induzierten Toxizität ist 16.
e_content "> Da anti-HIV-1 RNAs können nicht verarbeitet und an das adaptive Immunsystem präsentiert werden, sie als weniger immunogen im Vergleich zu anti-HIV-1-Proteine oder Peptide. Jedoch, abhängig von ihrer Sequenz oder Struktur können sie hervorrufen angeborene Immunantworten und mehrere Immunsensoren und signal~~POS=TRUNC identifiziert wurden, die kleine RNAs ( beschrieben in 40) reagieren kann. in der Immunaktivierungsassay hier beschrieben, wurden die Spiegel von phosphoryliertem PKR und IRF3 in Zellen im Vergleich mit kleinen RNAs als transfiziert Angabe von PKR oder TLR3 Aktivierung, respectively. Beide RNA-Sensoren sind in einer Vielzahl von Zelllinien und deren Aktivierung können zur Herstellung von im Fall von PKR, einer shut-down translatorisch Typ 1 Interferone und führen. zur Beurteilung das Potential für die anti-HIV-1-RNAs, die Produktion von Typ-1-Interferone durch alternative Wege, Ebenen des Interferon-stimulierte-Gen ADAR1 (p150) wurden ebenfalls in Zellen im Vergleich zu aktivieren, transfiziert mitanti-HIV-1 RNAs. Wie durch die Wirkung der langen dsRNA positive Kontrolle demonstriert, Poly I: C, alle diese Reaktionen waren aktiv in HEK293T - Zellen (Abbildung 5) und ähnliche Effekte wurden in MCF7 - Zellen 16 beobachtet. Da diese Reaktionen HIV-1-Produktion in der Abwesenheit von Wirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen hemmen konnte, stellt die Immunaktivierungsassay zusätzliche Validierung für die Wirksamkeit von neuen anti-HIV-1 RNAs. Weitere Messungen, die zu dieser Bewertung hinzugefügt werden, um die Produktion von inflammatorischen Cytokinen umfassen die Messung und Typ 1-Interferone in Zellkulturüberstand, und das Messen der Expression von mehr Interferon-stimulierte Gene. Da HIV - Zielzellen , wie beispielsweise CD4 + T - Zellen und Makrophagen verschiedene Ebenen der angeborenen Immunsensoren exprimieren kann, aus den in diesem Protokoll identifizierten Kandidaten beschriebenen Assays sollten auch für potentielle Immunstimulation in diesen Zelltypen untersucht werden.Für all die Tests beschreiben,d, der entscheidende Schritt für die reproduzierbare und genaue Ergebnisse zu erhalten, ist die Herstellung der DNA oder RNA-Transfektion Rohre (Schritt 1.3.). Die Plasmid-DNA oder RNA sollte von hoher Reinheit sein, wobei Konzentrationen genau bestimmt. Es ist auch wichtig, die entsprechenden Kontrollen einzubeziehen. Für neue Test-RNA-Expressionsplasmide in der viralen Produktion Test bewerten, ist eine negative Kontrolle ist die leere Expressionsplasmid. Für die Antisense-basierte RNAs, eine zusätzliche negative Kontrolle Plasmid, das eine nicht-Targeting-RNA exprimieren, ebenfalls eingeschlossen werden sollte. Die Sequenzen für einen nicht-Targeting Ribozym und shRNA, die nicht HIV - Produktion betreffen , werden in 13 zur Verfügung gestellt. Für Test siRNAs, die einzige negative Kontrolle , die verwendet werden kann , ist ein nicht-Targeting - RNA und eine entsprechende nicht-Targeting siRNA - Sequenz für die Virusproduktion Assay wird in 16 bereitgestellt. Für die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierungsassays, sollte die negative Kontrollzellen mit dem Transfektionsreagenz allein behandelt werden, und es ist critische, dass eine positive Kontrolle wie Poly I: C RNA-induzierten Toxizität oder immun Aktivierung in Reaktion auf, dass die Zellen zur Bestätigung enthalten ist. Für RNA-Expressionsplasmide, sollte die leeren Plasmid auch sicherstellen, aufgenommen werden, dass der Vektor selbst wird eine toxische Wirkung auf die Zellen nicht aufweist.
Insgesamt stellen die hier beschriebenen Tests eine gute erste Schritt zur Identifizierung von sicheren und wirksamen RNA-Therapien für die Verwendung in der HIV-1-Gen oder medikamentöse Therapie. Für Moleküle HIV-1 RNA - Targeting ist es auch wichtig , die Erhaltung ihrer Zielstelle in HIV-1 - Stämme zirkulierende und detaillierte Verfahren zu berücksichtigen Sequenzkonservierung zu berechnen zuvor 15 veröffentlicht worden. Um ein Molekül nach vorne in klinischen Studien, die Langzeittoxizität und Wirksamkeit bewegen Studien sollten in primären humanen Zellen und in Tiermodellen durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass identifizierten Kandidaten werden in der Klinik sicher und wirksam sein.
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Acknowledgments
Die vorgestellten Arbeiten wurden von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt (gewährt DCB-120266, PPP-133377 und HBF-348967 zu AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
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