Introduction
Una limitazione di corrente trattamenti HIV-1 è che devono essere somministrati cronicamente per prevenire la progressione della malattia. Trapianto di HIV-1 resistenti linfociti T, o cellule staminali ematopoietiche, ha il potenziale per fornire un controllo a lungo termine della replicazione dell'HIV-1 in assenza di terapia farmacologica 1,2 e può anche essere un approccio efficace per raggiungere un HIV-1 cura 3. Un modo per rendere le cellule resistenti alla replicazione dell'HIV-1 è quello di inserire uno o più geni che codificano per anti-HIV-1 RNA o peptidi nelle cellule di un individuo infetto durante un trapianto autologo 4. Diversi candidati-HIV-1 anti-geni sono stati progettati con alcuni studi clinici che entrano in combinazioni di due o tre 5 6, per prevenire lo sviluppo di HIV-1 resistenza a qualsiasi singolo gene.
Anti-HIV-1 RNA sono tra i primi candidati per la terapia genica combinazione a causa del loro basso potenziale per suscitare risposte immunitarie e perchésono trascritti da sequenze geniche molto brevi. Alcuni-HIV-1 anti-RNA sono stati progettati per colpire l'ingresso e l'integrazione virale. Tuttavia, la maggior parte degli RNA anti-HIV-1 Target passaggi post-integrazione nel ciclo di vita virale (Figura 1). Inibitori post-integrazione includono RNA decoy, mira le HIV-1 Tat proteine regolatrici o Rev 1, e RNA antisenso a base, il targeting siti diversi in HIV-1 RNA, come ribozimi 7, 8 e shRNAs U1i RNA 9. I metodi che sono stati utilizzati per confrontare l'efficacia di anti HIV-1-RNA includono il monitoraggio replicazione virale in cellule trasdotte con i geni codificanti per RNA candidati e misurando la produzione virale in cellule trasfettate con plasmidi esprimenti RNA candidati e uno di HIV-1 plasmide di espressione 10 -13. Abbiamo usato in precedenza un test di produzione di HIV-1 per lo screening HIV-1 RNA per il nuovo ribozima siti bersaglio 13-15. Questi metodi sono stati dal raffinato per ottimizzare il formato di un RNAmolecola interferenze espresso dal DNA plasmide come shRNA o consegnato come siRNA sintetico 16. Il test misura la produzione di virus maturi dalle cellule 293T umane embrionali renali (HEK), e può essere utilizzato per confrontare gli effetti degli inibitori che colpiscono fasi post-integrazione nel ciclo di replicazione dell'HIV-1 (Figura 1). Per gli inibitori che colpiscono fasi di pre-integrazione, sono necessari test alternativi come una prova di infettività delle cellule TZM-bl 17 per valutare l'efficacia antivirale.
I principali problemi di sicurezza per la fornitura di anti-HIV-1 RNA nella clinica includono potenziali effetti fuori bersaglio sulla RNA umani o proteine, e l'attivazione dei sensori del sistema immunitario innato. Per valutare la tossicità di anti-HIV-1 siRNA, abbiamo utilizzato un test di vitalità cellulare in diverse linee cellulari 16. Abbiamo anche misurato attivazione dei doppi sensori immuni RNA incagliati, RNA proteina chinasi attivata R (PKR) e Toll like receptor 3 (TLR3), nonché expressione dell'interferone stimolato gene, p150 ADAR1. Questi saggi possono essere usati per confermare che l'efficacia anti-HIV-1 RNA non è dovuto ad effetti indiretti sulla vitalità cellulare o attivazione del sensore immunitaria. Sono anche utili per escludere RNA candidati potenziali tossicità di ulteriore sviluppo.
Nelle seguenti protocolli, le procedure per identificare nuovi RNA terapeutici e ottimizzare il formato di quelli esistenti sono descritti. I metodi sono utili per gli inibitori della post-integrazione a base di screening di RNA di HIV-1 replicazione e potrebbero essere adattati per lo screening altri inibitori post-integrazione, come ad esempio piccole molecole di targeting Rev esportazione mediata di RNA virale 18 o CRISPR / sistemi Cas progettato per indirizzare integrato HIV-1 DNA 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellule e trasfezioni
- Culture cellule HEK 293T in terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Preparare una sospensione 2 x 10 5 cellule / ml nel terreno di coltura cellulare. Aggiungere 500, 100 e 1.000 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di 24 pozzetti, 96 e 12 pozzetti, per la produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione immunitaria, rispettivamente (Figura 2A).
- Mescolare delicatamente i piatti e li incubare O / N a 37 ° C con 5% di CO 2. Crescere le cellule a 50-70% di confluenza.
- Secondo un piano di trasfezione, preparare diluizioni di RNA di prova e dei loro controlli in provette da 1,5 ml (micro esempio, la figura 2B).
- Per il saggio di produzione virale, preparare un 10 ng / ml di diluizione di HIV-1 plasmide di espressione e aggiungere 10 microlitri in ciascun tubo. Successivo preparare 5 micron diluizioni di RNA di prova e un RN controllo negativoA. Aggiungere 2,5 o 10 ml di ogni RNA di prova e la diluizione di controllo negativo ai corrispondenti tubi per 25 o 100 concentrazioni finali nm.
- Per il test di vitalità cellulare, preparare 5 pM diluizioni di RNA di prova e 10 mg / ml di diluizione dell'RNA controllo positivo, a basso peso molecolare Poly I: C. Aggiungere 2 ml di RNA test o diluizioni di controllo RNA positivi ai corrispondenti tubi per 100 nm o concentrazioni finali ml 200 mg /, rispettivamente.
- Per il saggio attivazione del sistema immunitario, aggiungere 20 ml di RNA test o diluizioni di RNA di controllo positivo previste al punto 1.3.2. ai corrispondenti tubi di 100 nm o 200 mg / ml concentrazione finale rispettivamente.
Nota: Per il test di RNA plasmidi di espressione, preparare 10 ng / diluizioni microlitri al posto dei 5 micron diluizioni di RNA di prova, dando importi finali di 25 e 100 ng per passo 1.3.1. e 100 ng per passi 1.3.2. e 1.3.3.
- Aggiungere 50, 25 o 75 ml di DMEM ad ogni provetta trasfezione per prod viraleuzione, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario, rispettivamente. Per i saggi di produzione virale, portare le cellule e tubi trasfezione preparati per un 3 (BSL3) laboratorio di livello di bio-sicurezza prima del passaggio successivo.
- Aggiungere 2 ml di trasfezione reattivo sequenzialmente i tubi di trasfezione e incubare 15 a 20 minuti per consentire di formare complessi. Vedere la tabella dei materiali per la specifica del reagente di trasfezione da utilizzare.
- Aggiungere la miscela di trasfezione da ciascuna goccia a goccia alle posizioni corrispondenti nelle piastre di coltura cellulare tubicino. Agitare delicatamente e incubare le piastre per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Misura HIV-1 di produzione (sezione 2), la vitalità cellulare (sezione 3) e l'attivazione immunitaria (sezione 4) nelle piastre di coltura cellulare (Figura 2C).
2. Assay La produzione virale
- Rimuovere le piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti da incubatore e mescolare delicatamente le piastre all'interno della coltura cellulare BSL3cappuccio. Trasferire 150 pl di surnatante da ogni pozzetto ad un corrispondente bene in una piastra inferiore 96 pozzetti piatta, che sarà utilizzato per quantificare HIV-1 di produzione.
Nota: saggi titolazione virale comuni includono misurando l'espressione della proteina del capside di HIV-1 (p24) by enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA) 20, quantificando RNA virale mediante trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) 21 e misurando l'attività di HIV-1 RT enzima. I passaggi da 2.2 a 2.5 spiegare i metodi per quantificare l'HIV-1 RT attività 13,15,16. - Trasferimento 5 ml di surnatante in pozzetti in una piastra a 96 pozzetti, contenente 25 ml di una perturbazione virale cocktail 15 (Tabella 1). Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente e trasferire la piastra ad una workstation radioattività.
Nota: Step 2.2. è necessaria solo se una workstation radioattività non è disponibile in laboratorio BSL3. Se le piastre non devono essere rimossi dallaboratorio BSL3, procedere al punto 2.3. e aggiungere 50 ml di radioattivi / virale perturbazione cocktail (Tabella 1) al posto dei 25 ml di cocktail radioattivi. - Preparare una radioattivo cocktail 15 (Tabella 1), e aggiungere 25 ml a ciascun pozzetto di surnatante virale e cocktail interruzioni. Incubare le piastre a 37 ° C per 2 ore.
- Spot 5 ml di miscela di reazione su piazze corrispondenti in una fibra di vetro Di Etile Amino etilico (DEAE) carta filtermat e consentire le macchie asciugare per 10 minuti. Spot la miscela di reazione su ogni altro quadrato in modo che non esistono due campioni Boarder direttamente l'un l'altro. Ciò consente di evitare cross-over tra i campioni per determinare i conteggi per minuto (cpm) al punto 2.6.
- Lavare le carte 5X per 5 minuti con 2x salina citrato di sodio (SSC) tampone (Tabella 1), seguito da due 1 min lavaggi con etanolo al 95%. Lasciare le carte a secco e sigillarli in sacchetti di campionamento.
- Clip portacampionari containing la carta filtermat in una cassetta ed inserire la cassetta in un contatore a scintillazione micropiastra. Impostare il contatore di leggere CPM per 32 P, con la data di riferimento previsto per la partita di [32 P] dTTP utilizzato nell'esperimento. Selezionare quali campioni da letto utilizzando la mappa piatto e avviare il contatore.
- Per qualsiasi metodo titolazione virale, dividere i valori ottenuti per ciascun RNA test il controllo negativo adiacente e moltiplicare tale valore per 100 per ottenere la percentuale di inibizione di HIV-1 di produzione per ciascun replicato degli RNA prova. Un esempio dei risultati confrontando i diversi RNA di prova, a diverse concentrazioni è fornita in figura 3.
3. vitalità cellulare Assay
- Rimuovere le piastre a 96 pozzetti dall'incubatore e aggiungere 20 ml di 5 mg / ml MTT (3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromide) diluito in tampone fosfato di Dulbecco ( DPBS) in ciascun pozzetto. Incubare le piastre Fo 3 ore a 37 ° C.
- Aggiungere 150 ml di isopropanolo acidificato con detergente (1% NP-40, 4 mM HCl in isopropanolo) a ciascun pozzetto ed incubare le piastre per 2 ore a RT.
- Determinare l'assorbanza a 570 nm in uno spettrofotometro per micropiastre.
- Calcolare il metabolismo MTT relativo per ciascun controllo e test di RNA positivo dividendo il valore ottenuto per ciascun campione per il controllo trasfezione adiacente. Un esempio dei risultati confrontando i diversi RNA di prova e un controllo positivo è fornito in Figura 4.
4. Immune attivazione del test
- Rimuovere le piastre da 12 pozzetti da incubatore e aspirare il terreno di coltura. Lavare delicatamente le cellule due volte con DPBS e aggiungere 70 ml di tampone di lisi freddo 22 (tra cui proteasi e fosfatasi inibitori, Tabella 1) in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per 10 minuti in ghiaccio.
- Trasferimento lisati cellulari per tubi micro e veloce congelarli immergendo iltubi in azoto liquido. Consentire ai campioni di scongelare e ripetere per altri 2 cicli di gelo e disgelo, per un totale di 3.
- Centrifugare i lisati per 15 minuti a 4 ° C, 15.700 xg, per far sedimentare i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in nuovi tubi micro e determinare la concentrazione di proteine con il metodo 23,24 Coomassie blu (Bradford).
- Risoluzione 75 mg di proteine di ogni campione in un gel di poliacrilammide denaturante al 10% e trasferimento su membrana di nitrocellulosa come precedentemente descritto 25,26.
- Dopo elettroforesi e trasferimento ad una membrana, rivelare bande proteiche incubando la membrana Ponceau S (Tabella 1) per 1 min seguita da lavaggio con acqua bidistillata. Utilizzare le bande e scaletta proteine come guida per tagliare la membrana 80 e 55 kDa.
Nota: Nel passo 4.4 campioni possono essere eseguiti su 16 x 18 cm 2 gel scorrimento a 34 kDa, in modo che sia facile da tagliare la membrana nelle posizioni specificate e non tagliare ilbande di interesse. In alternativa, alcuni gel possono essere eseguiti con gli stessi campioni per evitare di tagliare la membrana. - Lavare la colorazione Ponceau S con soluzione salina Tris tamponata contenente 0,05% di Tween 20 (TBST, Tabella 1). Aggiungere TBST con latte non grasso 5% per coprire completamente le membrane. Incubare le membrane a temperatura ambiente con agitazione per 1 ora.
- Incubare le membrane O / N in TBST con 3% di albumina sierica bovina (BSA) e anticorpi diluito a 1 su 1.000 contro ADAR1 (110 e 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), e fosfo-IRF3 (47 kDa), per i primi, basso e intermedio pezzi della membrana, rispettivamente.
- Lavare le membrane 5X per 5 minuti con TBST e incubare in TBST con latte 5% senza grassi e di capra anti-coniglio anticorpi secondari perossidasi (diluito a 1 su 5.000) per 1 ora.
- Lavare il membrane 5x per 5 minuti con TBST e applicare la soluzione elettrochemiluminescenza (ECL) per visualizzare le bande in film, secondo le istruzioni del produttore.
- Dopo visualizzare le bande proteiche su film, lavare i pezzi intermedia ea valle della membrana per 10 minuti con una soluzione di anticorpi stripping. Incubare le membrane O / N in TBST con 3% di BSA e anticorpi contro PKR totale (a 1 a 500) e IRF3 (a 1 su 1.000), per la metà e pezzi di fondo, rispettivamente. Ripetere i punti 4.8. e 4.9. utilizzando marcato con perossidasi di capra anti-topo al posto del anticorpo secondario anti-coniglio per la membrana PKR (centro).
- Lavare il pezzo inferiore della membrana 5x per 5 minuti con TBST e incubare la membrana in TBST con 3% BSA per 1 ora con un anticorpo contro actina (diluito 1 a 5000). Ripetere i punti 4.8. e 4.9. utilizzando marcato con perossidasi di capra anti-topo al posto del anticorpo secondario anti-coniglio. Un esempio dei risultati che confrontano diversi RNA di prova e un controllo positivo viene fornito nella Figura 5. Vedere la tabella di materiali per i anticorpi specifici da utilizzare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uno schema generale delle procedure è mostrata in figura 2 con un piano trasfezione esempio per tre RNA di prova e un RNA di controllo fornito in Figura 2B. Per i saggi di produzione e vitalità cellulare virali, la lettura per ciascun costrutto test è normalizzata a un controllo negativo. Replicati vengono trasfettati in serie, in modo che ogni RNA test viene normalizzato al suo controllo negativo adiacente. Questo viene fatto per evitare dati imprecisi relativi al tempo tra complessante e trasfezione, che può causare, ad esempio, tutti i controlli negativi sono trasfettate prima. Poiché HIV-1 può influenzare le risposte immunitarie 27,28, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione immunitaria vengono eseguite senza l'aggiunta di un plasmide che esprime HIV-1.
Per identificare la lunghezza ottimale di molecole di RNA interference mira un sito conservato in HIV-1 RNA (posizione 1498-141519 in HIV-1 ceppo NL4-3) 13, un insieme di siRNAs sono stati progettati (Figura 3A). Usando il test di produzione di HIV-1, la percentuale di attività RT rispetto alle cellule trasfettate con un lungo Dicer substrato dialogo siRNA (Sins) è stata calcolata per le cellule trasfettate con l'siRNA test a diverse quantità di co-trasfezione con 100 ng di plasmide esprimente HIV-1 ceppo NL4-3 (Figura 3B).
Usando il test di vitalità cellulare, il metabolismo cento di MTT è stata determinata per le cellule trasfettate con i siRNA più efficaci identificati nella Figura 3B. I dati sono stati normalizzati al metabolismo MTT in cellule trattate con il solo reagente di trasfezione (Figura 4). Una lunga RNA a doppia elica (Poly I: C) ha ridotto la vitalità delle cellule; Tuttavia, l'effetto era significativo soltanto alla dose più elevata. No significativa riduzione della vitalità cellulare è stata osservata per siRNA targeting 1498 SI te in HIV-1 RNA, indipendentemente dalla loro lunghezza. Usando il test di attivazione immunitaria, lo stesso insieme di RNA sono stati valutati per il loro potenziale per innescare risposte immunitarie (Figura 5). In condizioni in cui Poly I: C attivata l'espressione di p150 ADAR1 e fosforilazione indotta di PKR e IRF3, alcun effetto significativo sui marcatori di attivazione immunitaria potrebbe essere osservata per una qualsiasi delle RNA di prova.
Figura 1. Schema di passaggi pre e post-integrazione nel ciclo di replicazione dell'HIV-1. Pre-integrazione (1-3) e post-integrazione (4-7) passi nel ciclo di replicazione di HIV-1 sono mostrati in scatole delineati . clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
2 "src =" / files / ftp_upload / 54486 / 54486fig2.jpg "/>
Figura 2. Schema della produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario. Cellule aderenti (A) Piastra e la cultura per 24 ore. Le cellule sono placcati in a 24, 96 e 12- pozzetti a 500, 100 e 1.000 ml di mezzi di coltura cellulare per la produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario, rispettivamente. (B) Preparare le provette di trasfezione, le cellule trasfezione, e la cultura per 48 ore. Un piano esempio trasfezione per una serie di tre test (RNA RNA1-3) viene mostrato con controlli appropriati. La procedura di transfezione è anche illustrata. (C) Leggi-out. La presenza di un letto per la produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario sono scritti e ha spiegato in dettaglio nelle sezioni 2, 3 e 4, rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. </ P>
Figura 3. Effetto di siRNA di test per l'HIV-1 di produzione. (A) Progettazione di siRNA con lunghezze e simmetrie differenti. Una sequenza conservata in HIV-1 RNA (1498 sito di destinazione) è stato utilizzato per la progettazione di siRNA simmetrici e asimmetrici (si1498-) con diverse lunghezze (da 17 a 29 fili nucleotide senso). Il senso atteso (in alto, nero) e antisenso (in basso, rosso) filamenti sono indicati. (B) L'inibizione del virus HIV-1 produzione varianti di lunghezza si1498. La percentuale (%) di inibizione di HIV-1 RT nel supernatante di cellule trasfettate con HEK293T varianti di lunghezza si1498 simmetriche o asimmetriche è mostrato relativamente ad una lunga substrato Dicer dialogo siRNA (Sins). Ogni RNA test è stato confrontato Sins a dosi differenti in almeno due trasfezioni indipendenti con due o tre repliche. I dati sono espressed come valori medi ± mezzi di errore standard (SEM). Questa cifra è stata modificata da 16, copyright American Society for Microbiology. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Effetto di lunghezza si1498 varianti sulla vitalità cellulare HEK293T cellule sono state trasfettate con poli I:. C a 50 e 200 mcg / ml (PIC50 e PIC200) e lunghezze diverse e formati di si1498 a 100 nM. Il metabolismo% di MTT è stata determinata rispetto alle cellule trattate con solo il reagente di trasfezione (Mock, M) in tre trasfezioni indipendenti con due o tre repliche. I dati sono espressi come valori medi ± SEM. studenti spaiato t-test sono stati utilizzati per determinare se il diverso trasfezioni significantly (*, P <0,05) ridotta vitalità cellulare rispetto alle cellule transfettate finta. Questa cifra è stata modificata da 16, copyright American Society for Microbiology. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Effetto della lunghezza si1498 varianti sulle risposte immunitarie innate. HEK293T cellule sono state trasfettate con PIC50, PIC200 e diverse lunghezze e formati di si1498 a 100 nM. L'attivazione di PKR e TLR3 sono stati valutati misurando PKR fosforilata e IRF3, rispettivamente. L'espressione di un interferone gene stimolato (ISG) è stata valutata misurando i livelli di P150 ISG ADAR1 relativi alla variante costitutivamente espresso, P110 ADAR1. L'espressione di actina è stata utilizzata come controllo di caricamento. Questo figure è stato modificato da 16, copyright American Society for Microbiology. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Nome di Buffer / reagente | Composizione |
| Cocktail interruzione virale | 60 mM Tris-HCl (da 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,04 mM EDTA, 1% NP-40. |
| cocktail radioattivo | 60 mM Tris-HCl (da 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,04 mM EDTA, 10 ug / ml Poly (A), 0,33 mg / ml oligo dT. Aggiunta immediatamente prima dell'uso: 8 mm ditiotreitolo (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) e 5 ml [32 P] dTTP (3000 Ci / mmol) Per ogni 500 ml di cocktail. |
| Radioactive / virale cocktail perturbazione | 60 mM Tris-HCl (da 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,04 mM EDTA, 0,1% NP-40, 5 mg / ml poli (A), 0,16 mg / oligo ml it. Aggiunta immediatamente prima dell'uso: 8 mm ditiotreitolo (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) e 5 ml [32] P dTTP (3000 Ci / mmol) per ogni 1 ml di cocktail. |
| 2x SSC | 17.53 g NaCl e 8,82 g di sodio citrato - 2H 2 O in 1 LH 2 O. |
| tampone di lisi | 50 mM Tris-HCl (da 1 M Tris-HCl, pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA (da 0,5 M, pH 8,0), 10% v / v di glicerolo, 1% v / v NP-40. |
| Ponceau S | 2.5 g Ponceau S e 5 ml di acido acetico in 500 ml di H 2 O. |
| TBST 6,05 g Tris, 8,76 g di NaCl e 1 ml di Tween 20 in 1 LH 2 O. |
Tabella 1:. Componenti del buffer non commerciali e reagenti Ricette per tutti i buffer non commerciali e reagenti sono forniti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'HIV-1 test di produzione, definita è stata effettuata utilizzando cellule HEK293T (Figura 2) ed è simile a dosaggi utilizzati per lo screening HIV-1 RNA per ribozyme efficace 13, shRNA 10,29, siRNA 30, e U1i RNA siti 11,31 bersaglio. Utilizzando diversi metodi per quantificare l'HIV-1 di produzione, la maggior parte degli studi hanno misurato la produzione virale 48 ore dopo la co-trasfezione di HIV-1 RNA plasmide con candidati. Dopo la produzione di HIV-1, virioni immaturi subiscono scissione proteolitica dei loro poliproteine dal HIV-1 proteasi diventare virioni maturi, capaci di infettare nuove cellule. Per il saggio RT attività enzimatica HIV-1 descritto nelle fasi 2.2. a 2,5., sia la produzione e gradini maturazione vengono valutati, poiché l'enzima RT è attivo solo in virioni maturi. Al contrario, la proteina del capside e RNA virale possono essere presenti in entrambi i virioni maturi e immaturi. Pertanto, quantificando HIV-1 produzione p24 ELISA o RT-PCR may perdere effetti di RNA terapeutici che agiscono sul gradino maturazione del ciclo di replicazione di HIV-1, come ribozimi che localizzano per HIV-1 virioni 32 e molecole antisenso basate che inibiscono l'elaborazione Gag in aggiunta a HIV-1 espressione della proteina 13, 31. Una limitazione di saggi produzione virale è che le cellule utilizzate non esprimono i recettori appropriati per HIV-1 iscrizione e non possono essere utilizzati per valutare gli effetti di RNA terapeutici su HIV-1 iscrizione o l'integrazione.
Per valutare gli effetti di anti HIV-1-RNA sull'intero ciclo di replica, vari modelli HIV-1 sono stati utilizzati in diverse linee cellulari T linfociti o globuli primarie 5,33. Dal momento che queste linee cellulari sono difficili da trasfezione, sono necessari per fornire una quantità sufficiente di HIV-1 RNA anti-per osservare gli effetti sulla replicazione dell'HIV-1 metodi più alta intensità di lavoro, come l'inserimento del gene vettori lentivirali o aptameri / peptide coniugazione. Questa limitazione rende difficult per confrontare rapidamente il rapporto struttura-attività tra le varianti di un particolare anti-HIV-1 RNA o eseguire lo screening su larga scala per identificare il sito di destinazione ottimale per nuove classi di anti-HIV-1 RNA. Mentre saggi produzione virali sono utili per identificare nuove molecole anti-HIV-1 RNA, modelli cellulari alternativi in linee cellulari facilmente transfettate che supportano replicazione dell'HIV-1, come TZM-bl cellule, sarebbe utile per lo screening anti-HIV-1 RNA di targeting altre fasi del ciclo di replicazione, come l'ingresso e l'integrazione.
A seconda della classe di anticorpi anti-HIV-1 RNA, sono state descritte diverse possibili meccanismi di tossicità. Ad esempio, RNA antisenso-based possono avere effetti fuori bersaglio sulla RNA cellulari contenenti la stessa o una sequenza simile al loro sito bersaglio in HIV-1 RNA. Allo stesso modo, aptameri RNA, sul modello della risposta elemento trans-attivazione (TAR) o elemento di risposta Rev (RRE), potrebbero influenzare la funzione di pr cellularioteins, come la proteina legante TAR RNA (TRBP) 34. shRNAs e siRNA hanno il potenziale aggiunto per influenzare il percorso RNA interference sequestrando proteine RNAi 35 e alcune molecole U1i hanno dimostrato di influenzare la giunzione e lavorazione di RNA cellulari sequestrando proteine del U1 piccoli RNA-proteina nucleare complesso 36. Mentre alcuni di questi effetti possono essere minimizzati un'attenta progettazione, misurazioni della tossicità cellulare in schermi per nuove molecole anti-HIV-1 RNA sono utili per escludere molecole con potenziali effetti fuori bersaglio da un ulteriore sviluppo. Inoltre, gli effetti fuori bersaglio potrebbero indirettamente inibire l'HIV-1 di produzione, rendendo tossicità cellulare una misura importante nel convalidare l'efficacia di nuovi farmaci anti HIV-1 molecole identificate dagli schermi HIV-1 di produzione.
Il saggio vitalità cellulare descritto in passi 3.1. a 3,4. è una variante di un test standard che è stata usata per vagliare diverse molecola antivirale S 37. Il dosaggio misura l'attività di enzimi cellulari NAD (P) H-dipendenti per ridurre il reagente MTT alla sua forma viola insolubile, formazan. Il protocollo è adattato da metodi precedentemente pubblicati 38 e diversi kit sono disponibili con MTT o altri reagenti strettamente correlati. Mentre è importante per saggiare la vitalità cellulare nella linea cellulare utilizzata per lo screening anti-HIV-1-RNA, va notato che diverse linee cellulari variano nella loro sensibilità verso tossicità RNA-indotta. Ad esempio, Reynolds et al. Dimostrato che Dicer siRNA substrato ha avuto alcun effetto sulla vitalità cellulare nelle cellule HEK293T, ma ha ridotto significativamente la vitalità cellulare nelle cellule MCF7, DU145 e HeLa S3 39. Per il saggio descritto, HEK293T cellule sono usati come esempio (figura 4); Tuttavia, lo stesso test è anche stato fatto in cellule MCF7 per valutare la potenziale tossicità in una linea cellulare che è più sensibile a piccole tossicità RNA-indotta 16.
e_content "> Da-HIV-1 anti-RNA non può essere elaborato e presentato al sistema immunitario adattativo, sono considerati meno immunogenico rispetto anti-HIV-1-proteine o peptidi. Tuttavia, a seconda della loro sequenza o struttura, possono suscitare innata risposte immunitarie, e diversi sensori immunitario e vie di segnalazione sono stati individuati in grado di rispondere a piccoli RNA (recensiti 40). nel saggio di attivazione immunitaria qui descritto, i livelli di PKR fosforilato e IRF3 stati confrontati in cellule trasfettate con piccoli RNA come un indicazione di attivazione PKR o TLR3 rispettivamente. Entrambi i sensori RNA sono presenti in una vasta gamma di linee cellulari e la loro attivazione può portare alla produzione di interferoni di tipo 1 e, in caso di PKR, un arresto in traduzione. per valutare il potenziale anti-HIV-1 RNA per attivare la produzione di interferoni di tipo 1 di percorsi alternativi, i livelli di interferone-stimolata gene ADAR1 (P150) sono stati confrontati in cellule trasfettate conanti-HIV-1 RNA. Come dimostrato dagli effetti della lunga controllo positivo dsRNA, Poly I: C, tutte queste risposte erano attivi nelle cellule HEK293T (Figura 5) ed effetti simili sono stati osservati nelle cellule MCF7 16. Poiché queste risposte possono inibire HIV-1 di produzione in assenza di effetti sulla vitalità cellulare, il saggio di attivazione immunitaria fornisce un'ulteriore convalida per l'efficacia di nuovi anti-HIV-1 RNA. Ulteriori misure che possono essere aggiunti a questa valutazione includono la misurazione della produzione di citochine infiammatorie e interferoni di tipo 1 nelle cellule in coltura supernatante, e misurando l'espressione di più geni interferone-stimolata. Dato che le cellule bersaglio HIV come le cellule ei macrofagi T CD4 + possono esprimere diversi livelli di sensori immunitarie innate, i candidati individuati dai saggi descritti in questo protocollo dovrebbero essere valutati per potenziale stimolazione immunitaria in questi tipi di cellule.Per tutti i saggi descrivonod, il passaggio critico per ottenere risultati riproducibili ed accurati è la preparazione dei tubi DNA o RNA transfezione (punto 1.3.). Il DNA plasmidico o RNA dovrebbero essere di elevata purezza con concentrazioni determinate con precisione. E 'anche fondamentale per comprendere gli opportuni controlli. Per valutare nuovi plasmidi di espressione dell'RNA prova nel test di produzione virale, un controllo negativo appropriato è il plasmide di espressione vuota. Per RNA antisenso-based, deve essere incluso un ulteriore controllo negativo plasmide che esprime un RNA non-targeting. Sequenze per un ribozima non-targeting e shRNA che non incidono produzione HIV sono forniti in 13. Per siRNA prova, l'unico controllo negativo che può essere utilizzato è un RNA non-targeting e un non-targeting siRNA sequenza appropriata per il dosaggio di produzione virale è fornito in 16. Per la vitalità delle cellule e saggi di attivazione immunitaria, il controllo negativo deve essere cellule trattate con solo il reagente di trasfezione ed è critical che un controllo positivo come poli I: C è incluso per confermare che le cellule sono sensibili alla tossicità RNA-indotto o attivazione immunitaria. Per RNA plasmidi di espressione, il plasmide vuoto deve essere incluso per garantire che il vettore stesso non ha effetti tossici sulle cellule.
Nel complesso, i saggi qui descritti rappresentano un buon primo passo verso l'identificazione di terapie RNA sicuri ed efficaci per l'uso in HIV-1 gene o la terapia farmacologica. Per molecole di targeting HIV-1 RNA, è anche importante considerare la conservazione del loro sito bersaglio in HIV-1 ceppi circolanti e metodi dettagliati per calcolare conservazione di sequenza sono stati precedentemente pubblicati 15. Per spostare una molecola in avanti in studi clinici, tossicità ed efficacia studi a lungo termine devono essere eseguite in cellule umane primarie e in modelli animali per confermare che i candidati identificati saranno al sicuro ed efficace nella clinica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Il lavoro qui presentato è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (concede DCB-120266, PPP-133.377 e 348.967 HBF-a AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
- Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
- Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
- Scarborough, R. J., Gatignol, A.
- Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
- Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
- McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
- Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
- Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
- Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
- Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
- Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
- Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
- Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
- Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
- Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
- Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M.
- Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
- Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
- Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
- Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
- ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
- Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
- Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
- Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
- Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
- Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
- Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
- Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
- Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
- Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).
