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Immunology and Infection

जीन या ड्रग थेरेपी में उपयोग के लिए लक्ष्य निर्धारण एचआईवी -1 उत्पादन प्रभावकारिता और आरएनए की विषाक्तता का मूल्यांकन

Published: September 5, 2016 doi: 10.3791/54486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2,3
1Virus-Cell Interactions Laboratory, Lady Davis Institute for Medical Research, 2Department of Microbiology & Immunology, McGill University, 3Department of Medicine, McGill University

Introduction

वर्तमान एचआईवी -1 उपचार की एक सीमा है कि वे लंबे समय से रोग प्रगति को रोकने के लिए प्रशासित किया जाना चाहिए। एचआईवी -1 प्रतिरोधी टी लिम्फोसाइट, या hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यारोपण, संभावित ड्रग थेरेपी 1,2 के अभाव में एचआईवी -1 प्रतिकृति की लंबी अवधि के नियंत्रण प्रदान करने के लिए है और यह भी एक प्रभावी दृष्टिकोण एक एचआईवी -1 इलाज प्राप्त करने के लिए हो सकता है 3। एक तरह से एचआईवी -1 प्रतिकृति के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं को प्रस्तुत करने के लिए एक ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण 4 के दौरान एक या एक से अधिक जीन एक संक्रमित व्यक्ति की कोशिकाओं में विरोधी एचआईवी -1 आरएनए या पेप्टाइड्स के लिए कोडिंग डालने के लिए है। कई उम्मीदवार विरोधी एचआईवी -1 जीन किसी भी एक जीन को एचआईवी -1 प्रतिरोध के विकास को रोकने के लिए दो या तीन 5 6 के संयोजन में कुछ में प्रवेश क्लिनिकल परीक्षण के साथ डिजाइन किया गया है।

एंटी एचआईवी -1 आरएनए उनके कम संभावित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने के कारण और क्योंकि वे संयोजन जीन थेरेपी के लिए शीर्ष उम्मीदवारों के बीच में हैंबहुत ही कम जीन दृश्यों से लिखित हैं। कुछ विरोधी एचआईवी -1 आरएनए वायरल प्रविष्टि और एकीकरण को लक्षित करने के लिए डिजाइन किया गया है। हालांकि, ज्यादातर विरोधी एचआईवी -1 आरएनए वायरल जीवन चक्र में बाद के एकीकरण कदम (चित्रा 1) लक्ष्य। पोस्ट-एकीकरण अवरोधकों ऐसे ribozymes 7, 8 और shRNAs U1i RNAs 9 के रूप में एचआईवी -1 नियामक प्रोटीन गूंथना या रेव 1, और antisense आधारित RNAs को लक्षित, एचआईवी -1 शाही सेना में अलग अलग साइटों को लक्षित, प्रलोभन RNAs शामिल हैं। तरीके कि विरोधी एचआईवी -1 आरएनए की प्रभावकारिता तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जीन उम्मीदवार RNAs के लिए कोडिंग और क्षणिक उम्मीदवार RNAs व्यक्त plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में वायरल उत्पादन और एक एचआईवी -1 प्लाज्मिड अभिव्यक्ति को मापने के साथ transduced कोशिकाओं में वायरल प्रतिकृति की निगरानी में शामिल 10 -13। हम पहले से स्क्रीन करने के लिए एचआईवी -1 नई ribozyme लक्ष्य साइटों 13-15 के लिए शाही सेना एक एचआईवी -1 उत्पादन परख का इस्तेमाल किया है। इन विधियों के बाद से एक शाही सेना के प्रारूप अनुकूलन करने के लिए परिष्कृत किया गया हैहस्तक्षेप अणु एक shRNA के रूप में प्लास्मिड डीएनए से व्यक्त या एक सिंथेटिक siRNA 16 के रूप में दिया जाता है। परख मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T कोशिकाओं से परिपक्व वायरस के उत्पादन के उपाय, और अवरोधकों कि एचआईवी -1 प्रतिकृति चक्र में बाद के एकीकरण कदम लक्ष्य (चित्रा 1) के प्रभाव की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अवरोधकों कि पूर्व एकीकरण कदम लक्ष्य के लिए, इस तरह के एक TZM बीएल सेल संक्रामकता परख 17 के रूप में वैकल्पिक assays एंटीवायरल प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने की जरूरत है।

क्लिनिक में विरोधी एचआईवी -1 आरएनए के वितरण के लिए प्रमुख सुरक्षा चिंताओं मानव आरएनए या प्रोटीन, और सहज प्रतिरक्षा सेंसर की सक्रियता पर संभावित बंद लक्ष्य प्रभाव शामिल हैं। विरोधी एचआईवी -1 siRNAs की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए, हम अलग अलग सेल लाइनों 16 में एक सेल व्यवहार्यता परख का इस्तेमाल किया है। हम भी डबल असहाय शाही सेना प्रतिरक्षा सेंसर की सक्रियता को मापा, आरएनए सक्रिय प्रोटीन काइनेज आर (PKR) और रिसेप्टर 3 (TLR3) की तरह टोल, साथ ही पूर्वइंटरफेरॉन की अभिव्यक्ति जीन, ADAR1 P150 को प्रेरित किया। ये assays पुष्टि करने के लिए कि विरोधी एचआईवी -1 आरएनए की प्रभावकारिता सेल व्यवहार्यता या प्रतिरक्षा सेंसर सक्रियण पर अप्रत्यक्ष प्रभाव के कारण नहीं है इस्तेमाल किया जा सकता है। उन्होंने यह भी आगे विकास से संभावित विषाक्तता के साथ उम्मीदवार RNAs को छोड़कर में उपयोगी होते हैं।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, प्रक्रियाओं नई चिकित्सकीय RNAs की पहचान करने और अनुकूलन मौजूदा वालों के प्रारूप में वर्णित किया जाता है। तरीकों एचआईवी -1 प्रतिकृति की स्क्रीनिंग आरएनए आधारित पोस्ट-एकीकरण अवरोधकों के लिए उपयोगी होते हैं और इस तरह के वायरल शाही सेना 18 या CRISPR की रेव मध्यस्थता निर्यात को निशाना छोटे अणुओं के रूप में अन्य के बाद एकीकरण निरोधक, स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है / डिजाइन किए कैस सिस्टम एकीकृत लक्षित करने एचआईवी -1 डीएनए 19।

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Protocol

1. कोशिकाओं और transfections

  1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में संस्कृति HEK 293T कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक। सेल संस्कृति के माध्यम में एक 2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल निलंबन तैयार करें। की एक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 500, 100 और 1,000 μl जोड़े 24 अच्छी तरह से, 96 अच्छी तरह से और 12 अच्छी तरह प्लेटें, वायरल उत्पादन, सेल व्यवहार्यता और प्रतिरक्षा सक्रियण assays में क्रमश: (2A चित्रा) के लिए।
  2. धीरे प्लेटों चक्कर आने और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हे / एन। 50-70% confluency करने के लिए कोशिकाओं को विकसित।
  3. एक अभिकर्मक योजना के अनुसार, 1.5 मिलीग्राम सूक्ष्म ट्यूब (उदाहरण के लिए, चित्रा 2 बी) में परीक्षण RNAs और उनके नियंत्रण के dilutions तैयार करते हैं।
    1. वायरल उत्पादन परख के लिए, एक 10 एनजी / एक एचआईवी -1 प्लाज्मिड अभिव्यक्ति की μl कमजोर पड़ने को तैयार करने और प्रत्येक ट्यूब 10 μl जोड़ें। अगले टेस्ट RNAs के 5 माइक्रोन के dilutions और एक नकारात्मक नियंत्रण आर.एन. तैयारए 25 या 100 एनएम अंतिम सांद्रता के लिए प्रत्येक परीक्षा शाही सेना और इसी ट्यूबों के लिए नकारात्मक नियंत्रण कमजोर पड़ने के 2.5 या 10 μl जोड़ें।
    2. सी: सेल व्यवहार्यता परख के लिए, 5 माइक्रोन के एक 10 मिलीग्राम / सकारात्मक नियंत्रण शाही सेना, कम आणविक वजन पाली मैं मिलीलीटर कमजोर पड़ने परीक्षण RNAs के dilutions और तैयार करते हैं। 100 एनएम या 200 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम सांद्रता, क्रमशः के लिए इसी ट्यूबों के लिए परीक्षण शाही सेना या सकारात्मक नियंत्रण आरएनए dilutions के 2 μl जोड़ें।
    3. प्रतिरक्षा सक्रियण परख के लिए, परीक्षण शाही सेना या सकारात्मक नियंत्रण आरएनए कदम 1.3.2 में तैयार dilutions के 20 μl जोड़ें। 100 एनएम या 200 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम सांद्रता, क्रमशः के लिए इसी ट्यूबों के लिए।
      नोट: परीक्षण के शाही सेना अभिव्यक्ति plasmids के लिए, परीक्षण RNAs के 5 माइक्रोन के dilutions के स्थान पर 10 एनजी / μl dilutions तैयार, कदम 1.3.1 के लिए एनजी 25 और 100 के अंतिम मात्रा में दे रही है। और 100 कदम 1.3.2 के लिए एनजी। और 1.3.3।
  4. वायरल ठेस के लिए प्रत्येक अभिकर्मक ट्यूब के लिए DMEM के 50, 25 या 75 μl जोड़ेuction, सेल व्यवहार्यता और प्रतिरक्षा सक्रियण assays, क्रमशः। वायरल उत्पादन assays के लिए, अगले कदम से पहले एक जैव सुरक्षा स्तर 3 (BSL3) प्रयोगशाला के लिए कोशिकाओं और तैयार अभिकर्मक नलियों लाने के लिए।
  5. अभिकर्मक ट्यूबों के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक क्रमिक रूप से 2 μl जोड़ें और 15 से 20 मिनट सेते हैं परिसरों के लिए फार्म की अनुमति है। प्रयोग की जाने वाली विशिष्ट अभिकर्मक अभिकर्मक के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  6. प्रत्येक सूक्ष्म ट्यूब बूंद के लिहाज से सेल संस्कृति प्लेटों में इसी पदों के लिए से पूरे अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें। भंवर धीरे और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं।
  7. उपाय एचआईवी -1 उत्पादन (खंड 2), सेल संस्कृति प्लेट (चित्रा -2) में सेल व्यवहार्यता (धारा 3) और प्रतिरक्षा सक्रियण (धारा 4)।

2. वायरल उत्पादन परख

  1. इनक्यूबेटर से 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों निकालें और धीरे BSL3 सेल संस्कृति के अंदर प्लेटों ज़ुल्फ़हुड। एक एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे की थाली है, जो एचआईवी -1 उत्पादन यों इस्तेमाल किया जाएगा में अच्छी तरह से इसी के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला के 150 μl स्थानांतरण।
    नोट: आम वायरल मात्रा का ठहराव assays एचआईवी -1 capsid प्रोटीन (पी 24) एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) 20, बढ़ाता रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी पीसीआर) 21 से वायरल शाही सेना द्वारा की अभिव्यक्ति को मापने और गतिविधि को मापने शामिल एचआईवी -1 आरटी एंजाइम की। कदम 2.2 से 2.5 के तरीकों को समझाने एचआईवी -1 आर टी गतिविधि 13,15,16 यों की।
  2. स्थानांतरण एक 96 अच्छी तरह से थाली में इसी कुओं, एक वायरल व्यवधान कॉकटेल 15 (1 टेबल) का 25 μl युक्त सतह पर तैरनेवाला के 5 μl। आरटी पर 5 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं और एक कार्य केंद्र के लिए रेडियोधर्मिता प्लेट हस्तांतरण।
    नोट: 2.2 कदम। अगर एक रेडियोधर्मिता वर्कस्टेशन BSL3 प्रयोगशाला में उपलब्ध नहीं है केवल आवश्यक है। प्लेटों से हटा दिया जाना चाहिए नहीं हैBSL3 प्रयोगशाला, कदम दर 2.3 आगे बढ़ें। और रेडियोधर्मी कॉकटेल के 25 μl के स्थान पर रेडियोधर्मी / वायरल व्यवधान कॉकटेल (तालिका 1) के 50 μl जोड़ें।
  3. एक रेडियोधर्मी कॉकटेल 15 (1 टेबल) तैयार करें, और वायरल सतह पर तैरनेवाला और व्यवधान के कॉकटेल से प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 25 μl जोड़ें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
  4. स्पॉट एक ग्लास फाइबर Di इथाइल एमिनो इथाइल (DEAE) filtermat अखबार में इसी चौकों पर प्रतिक्रिया मिश्रण के 5 μl और स्पॉट 10 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं। हर दूसरे वर्ग पर प्रतिक्रिया मिश्रण स्पॉट इतना है कि कोई दो नमूने सीधे एक दूसरे लेखक। इस नमूने के बीच क्रॉस ओवर से बचने के लिए जब 2.6 चरण में प्रति मिनट (सीपीएम) में गिना जाता है का निर्धारण करने में मदद करता है।
  5. धो कागजात 2x खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) बफर (तालिका 1) के साथ 5 मिनट, 95% इथेनॉल के साथ दो 1 मिनट washes के द्वारा पीछा के लिए 5x। कागजात सूखी और उन्हें नमूना बैग में सील करने की अनुमति दें।
  6. क्लिप नमूना बैग सहएक कैसेट में filtermat कागज ntaining और एक microplate जगमगाहट काउंटर में कैसेट डालें। काउंटर सेट प्रयोग में इस्तेमाल किया [32] पी dTTP के बैच के लिए प्रदान की संदर्भ तारीख के साथ 32 पी के लिए सीपीएम को पढ़ने के लिए। का चयन करें जो नमूने प्लेट मानचित्र का उपयोग कर पढ़ सकते हैं और काउंटर शुरू करने के लिए।
  7. किसी भी वायरल मात्रा का ठहराव विधि के लिए, आसन्न नकारात्मक नियंत्रण से मूल्यों प्रत्येक परीक्षा शाही सेना के लिए प्राप्त की फूट डालो और परीक्षण RNAs के प्रत्येक को दोहराने के लिए एचआईवी -1 उत्पादन का प्रतिशत निषेध पाने के लिए 100 से इस मूल्य गुणा। अलग सांद्रता में विभिन्न परीक्षण RNAs की तुलना परिणाम का एक उदाहरण चित्रा 3 में प्रदान की जाती है।

3. सेल व्यवहार्यता परख

  1. इनक्यूबेटर से 96 अच्छी तरह प्लेटें निकालें और 5 मिलीग्राम के 20 μl जोड़ें / मिलीलीटर MTT (3 [4.5-डाइमिथाइल-2-thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium ब्रोमाइड) Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा में पतला ( DPBS) प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए। एफ प्लेटें सेतेया 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा।
  2. डिटर्जेंट (1% एनपी 40, isopropanol में 4 मिमी एचसीएल) प्रत्येक अच्छी तरह से साथ acidified isopropanol के 150 μl जोड़ें और आरटी पर 2 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं।
  3. एक microplate स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 570 एनएम पर absorbance निर्धारित करते हैं।
  4. अपनी आसन्न अभिकर्मक नियंत्रण से प्रत्येक नमूना के लिए प्राप्त मूल्य विभाजित करके प्रत्येक के लिए सकारात्मक नियंत्रण और परीक्षण शाही सेना के लिए रिश्तेदार MTT चयापचय की गणना। विभिन्न परीक्षण RNAs और एक सकारात्मक नियंत्रण की तुलना परिणाम का एक उदाहरण चित्रा 4 में प्रदान की जाती है।

4. प्रतिरक्षा सक्रियण परख

  1. इनक्यूबेटर से 12 अच्छी तरह प्लेटें निकालें और संस्कृति मीडिया aspirate। धीरे DPBS के साथ कोशिकाओं को दो बार धोने और ठंड lysis बफर 22 प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से (प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों, 1 टेबल सहित) के 70 μl जोड़ें। बर्फ पर 10 मिनट के लिए प्लेटें सेते हैं।
  2. माइक्रो ट्यूबों के लिए सेल lysates स्थानांतरण और तेज डुबो कर उन्हें रोकतरल नाइट्रोजन में ट्यूबों। नमूने पिघलना और 3 की कुल के लिए 2 अधिक फ्रीज पिघलना चक्र के लिए दोहराने के लिए अनुमति दें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस, 15,700 XG पर 15 मिनट के लिए lysates अपकेंद्रित्र, सेल मलबे गोली। नई माइक्रो ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और Coomassie ब्लू (ब्रैडफोर्ड) विधि 23,24 का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
  4. एक 10% denaturing polyacrylamide जेल में प्रत्येक नमूने से प्रोटीन के 75 माइक्रोग्राम को हल करने और के रूप में पहले 25,26 वर्णित एक nitrocellulose झिल्ली को हस्तांतरण।
  5. एक झिल्ली को वैद्युतकणसंचलन और हस्तांतरण के बाद, 1 मिनट दोहरा आसुत पानी में धोने के बाद के लिए रक्तवर्ण रंग एस (1 टेबल) में झिल्ली incubating द्वारा प्रोटीन बैंड प्रकट करते हैं। 80 और 55 केडीए पर झिल्ली में कटौती करने के लिए एक गाइड के रूप में बैंड और प्रोटीन सीढ़ी का प्रयोग करें।
    नोट: चरण में 4.4 नमूनों पर 16 x 18 सेमी 34 केडीए के लिए नीचे 2 जैल चलाया जा सकता है, इतना है कि यह निर्दिष्ट पदों पर झिल्ली में कटौती करने के लिए और के माध्यम से कटौती नहीं आसान हैब्याज की बैंड। वैकल्पिक रूप से, कई जैल झिल्ली काटने से बचने के लिए एक ही नमूनों के साथ चलाया जा सकता है।
  6. Tris बफर खारा 0.05% के बीच 20 (TBST, 1 टेबल) युक्त साथ रक्तवर्ण रंग एस धुंधला बाहर धो लें। 5% गैर वसा दूध के साथ TBST मे पूरी तरह से झिल्ली को कवर करने के लिए। 1 घंटे के लिए आंदोलन के साथ आरटी पर झिल्ली सेते हैं।
  7. झिल्ली सेते हे / एन 3% गोजातीय सीरम albumin के साथ TBST (बीएसए) और एंटीबॉडी ADAR1 (110 और 150 केडीए), phospho-PKR (62 केडीए), और phospho-IRF3 (47 केडीए) के खिलाफ 1000 में 1 को पतला में, क्रमशः झिल्ली के शीर्ष मध्य और नीचे टुकड़े, के लिए।
  8. धो झिल्ली TBST के साथ 5 मिनट के लिए 5x और 1 घंटे के लिए 5% गैर वसा दूध और peroxidase लेबल बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (5000 में 1 से पतला) के साथ TBST में सेते हैं।
  9. TBST के साथ 5 मिनट के लिए झिल्ली 5x धो और निर्माता के निर्देशों के अनुसार फिल्मों पर बैंड कल्पना करने के लिए electrochemiluminescence (ईसीएल) समाधान लागू होते हैं।
  10. फिल्मों पर प्रोटीन बैंड visualizing के बाद, एक एंटीबॉडी अलग करना समाधान के साथ 10 मिनट के लिए झिल्ली के मध्य और नीचे टुकड़े धो लें। और IRF3 (500 में 1 पर) 3% BSA के साथ झिल्ली हे / एन TBST में और कुल PKR के खिलाफ एंटीबॉडी सेते हैं (1000 में 1 पर), मध्य और नीचे टुकड़े, क्रमशः के लिए। दोहराएँ 4.8 कदम। और 4.9। PKR झिल्ली (मध्य) के लिए विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के स्थान पर peroxidase लेबल बकरी विरोधी माउस का उपयोग।
  11. TBST के साथ 5 मिनट के लिए झिल्ली 5x के नीचे टुकड़ा धो और actin के खिलाफ एक एंटीबॉडी (5000 में 1 से पतला) के साथ 1 घंटे के लिए 3% BSA के साथ TBST में झिल्ली सेते हैं। दोहराएँ 4.8 कदम। और 4.9। विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के स्थान पर peroxidase लेबल बकरी विरोधी माउस का उपयोग। विभिन्न परीक्षण RNAs और एक सकारात्मक नियंत्रण की तुलना परिणाम का एक उदाहरण चित्रा 5 में प्रदान की जाती है। विशिष्ट एंटीबॉडी इस्तेमाल किया जा करने के लिए सामग्री की तालिका देखें।

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Representative Results

प्रक्रियाओं का एक सामान्य योजनाबद्ध तीन टेस्ट RNAs और एक नियंत्रण चित्रा 2 बी में प्रदान की शाही सेना के लिए एक उदाहरण अभिकर्मक योजना के साथ चित्रा 2 में दिखाया गया है। वायरल उत्पादन और सेल व्यवहार्यता assays के लिए, प्रत्येक परीक्षा के निर्माण के लिए पढ़ने के लिए बाहर एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत है। Replicates, सेटों में ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं ताकि प्रत्येक परीक्षा आरएनए अपनी आसन्न नकारात्मक नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत है। इस complexing और अभिकर्मक के बीच का समय है, जो अगर, उदाहरण के लिए, नकारात्मक नियंत्रण के सभी पहले ट्रांसफ़ेक्ट हैं परिणाम हो सकता है से संबंधित गलत डेटा से बचने के लिए किया जाता है। चूंकि एचआईवी -1 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 27,28 प्रभावित कर सकते हैं, सेल व्यवहार्यता और प्रतिरक्षा सक्रियण assays के एक एचआईवी -1 व्यक्त प्लाज्मिड के अलावा बिना किया जाता है।

एचआईवी -1 शाही सेना में एक संरक्षित साइट (1498-15 स्थिति को निशाना शाही सेना के हस्तक्षेप के अणुओं की अधिकतम लंबाई पहचान करने के लिएएचआईवी -1 तनाव NL4-3) 13 में 19, siRNAs का एक सेट (चित्रा 3) के डिजाइन किए गए थे। एचआईवी -1 उत्पादन परख का प्रयोग, एक लंबे पासा खेलनेवाला सब्सट्रेट बकवास siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की तुलना में आरटी गतिविधि का प्रतिशत (पापों) एक प्लाज्मिड के 100 एनजी के साथ सह-अभिकर्मक के विभिन्न मात्रा में प्रत्येक परीक्षा siRNA व्यक्त के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए गणना की गई एचआईवी -1 तनाव NL4-3 (चित्रा 3 बी)।

सेल व्यवहार्यता परख का प्रयोग, MTT का प्रतिशत चयापचय सबसे प्रभावी चित्रा 3 बी में पहचान siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए निर्धारित किया गया था। डेटा अकेले अभिकर्मक अभिकर्मक (चित्रा 4) के साथ इलाज किया कोशिकाओं में MTT चयापचय के लिए सामान्यीकृत किया गया। एक लंबे समय तक डबल असहाय शाही सेना (पाली मैं: सी) सेल व्यवहार्यता कम हो; हालांकि, प्रभाव उच्चतम खुराक का मूल्यांकन पर केवल महत्वपूर्ण था। सेल व्यवहार्यता में कोई उल्लेखनीय कमी 1498 si को निशाना siRNAs के लिए मनाया गया एचआईवी -1 शाही सेना में ते, उनकी लंबाई की परवाह किए बिना। प्रतिरक्षा सक्रियण परख का प्रयोग, आरएनए का एक ही सेट अपनी क्षमता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (चित्रा 5) को गति प्रदान करने के लिए मूल्यांकन किया गया। शर्तों जहां पाली मैं: सी ADAR1 P150 की अभिव्यक्ति और PKR और IRF3 प्रेरित फोस्फोराइलेशन सक्रिय, प्रतिरक्षा सक्रियण मार्कर पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव का परीक्षण RNAs से किसी के लिए मनाया जा सकता है।

आकृति 1
एचआईवी -1 प्रतिकृति चक्र में पूर्व और बाद के एकीकरण कदम की चित्रा 1. योजनाबद्ध। प्री-इंटीग्रेशन (1-3) और बाद के एकीकरण (4-7) एचआईवी -1 प्रतिकृति चक्र में कदम उल्लिखित बक्से में दिखाया जाता है । यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2. वायरल उत्पादन, सेल व्यवहार्यता और प्रतिरक्षा सक्रियण assays के योजनाबद्ध। (ए) प्लेट पक्षपाती कोशिकाओं और 24 घंटे के लिए संस्कृति। प्रकोष्ठों 24 में चढ़ाया जाता है, 96- और 500, 100 में 12 अच्छी तरह प्लेटें और वायरल उत्पादन, सेल व्यवहार्यता और प्रतिरक्षा सक्रियण assays, के लिए सेल संस्कृति मीडिया के 1,000 μl क्रमशः। (बी) के 48 घंटे के लिए अभिकर्मक ट्यूब, transfect कोशिकाओं, और संस्कृति को तैयार है। तीन टेस्ट आरएनए (RNA1-3) का एक सेट के लिए एक उदाहरण अभिकर्मक योजना उचित नियंत्रण के साथ दिखाया गया है। अभिकर्मक प्रक्रिया भी यह साफ है। (सी) पढ़ने के लिए बाहर। वायरल उत्पादन, सेल व्यवहार्यता और प्रतिरक्षा सक्रियण assays के लिए पढ़ने के लिए बाहर लिखा है और धारा 2, 3 और 4 में विस्तार से समझाया जाता है, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ P>

चित्र तीन
चित्रा 3. एचआईवी -1 उत्पादन पर परीक्षण siRNAs का प्रभाव। (ए) अलग लंबाई और समानताएं साथ siRNAs की डिजाइन। एचआईवी -1 आरएनए (1498 लक्ष्य साइट) में एक संरक्षित अनुक्रम अलग लंबाई (17 से 29 न्यूक्लियोटाइड भावना किस्में) के साथ सममित और विषम siRNAs (si1498-) डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। उम्मीद भावना (ऊपर, काला) और antisense (नीचे, लाल) किस्में संकेत कर रहे हैं। (बी) si1498 लंबाई वेरिएंट द्वारा एचआईवी -1 उत्पादन का निषेध। सममित या विषम si1498 लंबाई वेरिएंट के साथ ट्रांसफ़ेक्ट HEK293T कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला में एचआईवी -1 आर टी गतिविधि का प्रतिशत (%) निषेध एक लंबे पासा खेलनेवाला सब्सट्रेट बकवास siRNA (पापों) के सापेक्ष दिखाया गया है। प्रत्येक परीक्षा आरएनए दो से तीन प्रतिकृति के साथ कम से कम दो स्वतंत्र transfections में अलग अलग मात्रा में पापों की तुलना में था। डेटा expr हैं± मानक त्रुटि का अर्थ (एसईएम) के रूप में मतलब मूल्यों essed। यह आंकड़ा 16 से संशोधित किया गया है, सूक्ष्म जीव विज्ञान के लिए कॉपीराइट अमेरिकन सोसायटी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. si1498 लंबाई का प्रभाव सेल व्यवहार्यता पर वेरिएंट HEK293T कोशिकाओं पाली मैं के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। 50 और 200 माइक्रोग्राम / एमएल सी 100 एनएम पर (PIC50 और PIC200) और अलग अलग लंबाई और स्वरूपों si1498 की। MTT का% चयापचय अभिकर्मक दो से तीन प्रतिकृति के साथ तीन स्वतंत्र transfections में अकेले अभिकर्मक (मॉक, एम) के साथ इलाज किया कोशिकाओं के सापेक्ष निर्धारित किया गया था। डेटा एसईएम ± मतलब मूल्यों के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। Unpaired छात्र टी परीक्षण है कि क्या अलग transfections significantl निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गयावाई (*, पी <0.05) नकली ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए कम सेल व्यवहार्यता रिश्तेदार। यह आंकड़ा 16 से संशोधित किया गया है, सूक्ष्म जीव विज्ञान के लिए कॉपीराइट अमेरिकन सोसायटी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. si1498 लंबाई का प्रभाव सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के वेरिएंट। HEK293T कोशिकाओं PIC50, PIC200 और अलग अलग लंबाई और 100 एनएम पर si1498 के स्वरूपों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। PKR और TLR3 की सक्रियता, फॉस्फोरिलेटेड PKR और IRF3 मापने क्रमशः द्वारा मूल्यांकन किया गया। एक इंटरफेरॉन प्रेरित जीन (आईएसजी) की अभिव्यक्ति आईएसजी ADAR1 P150 स्तरों अनिवार्यता से व्यक्त संस्करण, ADAR1 P110 के सापेक्ष को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था। actin की अभिव्यक्ति एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इस figurई 16 से संशोधित किया गया है, सूक्ष्म जीव विज्ञान के लिए कॉपीराइट अमेरिकन सोसायटी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बफर / अभिकर्मक का नाम रचना
वायरल व्यवधान कॉकटेल 60 मिमी Tris एचसीएल, 75 मिमी KCl, 5 मिमी 2 MgCl, 1.04 मिमी EDTA, 1% एनपी 40 (1 एम Tris एचसीएल, पीएच 7.8 से)।
रेडियोधर्मी कॉकटेल 60 मिमी Tris एचसीएल, 75 मिमी KCl, 5 मिमी 2 MgCl, 1.04 मिमी EDTA, 10 माइक्रोग्राम / एमएल पाली (ए), 0.33 माइक्रोग्राम / एमएल oligo डीटी (1 एम Tris एचसीएल, पीएच 7.8 से)। तुरंत उपयोग करने से पहले जोड़ा गया: 8 मिमी dithiothreitol (डीटीटी, सी 4 घंटे 10 हे 2 एस 2) और 5 μl [32] पी dTTP (3000 सीआइ / mmol) कॉकटेल में से प्रत्येक के 500 μl के लिए।
रेडियोधर्मी / वायरल व्यवधान कॉकटेल 60 मिमी Tris एचसीएल, 75 मिमी KCl, 5 मिमी 2 MgCl, 1.04 मिमी EDTA, 0.1% एनपी 40, 5 माइक्रोग्राम / एमएल पाली (ए), 0.16 माइक्रोग्राम / एमएल oligo (1 एम Tris एचसीएल, पीएच 7.8 से) डीटी। तुरंत उपयोग करने से पहले जोड़ा गया: 8 मिमी dithiothreitol (डीटीटी, सी 4 घंटे 10 हे 2 एस 2) और कॉकटेल के प्रत्येक 1 मिलीलीटर के लिए 5 μl [32] पी dTTP (3000 सीआइ / mmol)।
2x एसएससी 17.53 छ NaCl और 8.82 ग्राम सोडियम साइट्रेट - 2H 2 हे 1 एलएच 2 ओ में
लिसेस बफ़र 50 मिमी Tris एचसीएल, 150 मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA (1 एम Tris एचसीएल, पीएच 7.4 से), 10% वी / वी ग्लिसरॉल, 1% वी / वी (0.5 एम, पीएच 8.0 से) एनपी 40।
रक्तवर्ण रंग एस 2.5 ग्राम रक्तवर्ण रंग एस और 5 मिलीलीटर 500 मिलीलीटर एच 2 ओ में एसिटिक एसिड
TBST 6.05 छ Tris, 8.76 छ NaCl और 1 मिलीलीटर बीच 20 1 एलएच 2 ओ में

तालिका 1:। गैर वाणिज्यिक buffers और अभिकर्मकों के घटक सभी गैर वाणिज्यिक buffers और अभिकर्मकों के लिए व्यंजनों प्रदान की जाती हैं।

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Discussion

एचआईवी -1 उत्पादन परख वर्णित HEK293T कोशिकाओं का उपयोग कर (चित्रा 2) का प्रदर्शन किया गया था और प्रभावी ribozyme 13 के लिए स्क्रीन करने के लिए एचआईवी -1 शाही सेना, shRNA 10,29, siRNA 30, और U1i आरएनए 11,31 लक्ष्य साइटों का इस्तेमाल किया assays के समान है। एचआईवी -1 उत्पादन यों की विभिन्न विधियों का प्रयोग, ज्यादातर अध्ययनों वायरल उत्पादन उम्मीदवार RNAs के साथ एक एचआईवी -1 प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के सह अभिकर्मक के बाद 48 घंटा मापा जाता है। एचआईवी -1 के उत्पादन के बाद, अपरिपक्व virions एचआईवी -1 प्रोटीज द्वारा उनके polyproteins के proteolytic दरार से गुजरना परिपक्व virions, नई कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम हो जाते हैं। एचआईवी -1 आरटी एंजाइम गतिविधि कदम 2.2 में वर्णित परख के लिए। 2.5।, दोनों के उत्पादन और परिपक्वता कदम मूल्यांकन कर रहे हैं, के बाद से आरटी एंजाइम परिपक्व virions में ही सक्रिय है। इसके विपरीत, कैप्सिड प्रोटीन और वायरल शाही सेना दोनों परिपक्व और अपरिपक्व virions में मौजूद हो सकता है। इसलिए, पी 24 एलिसा या आरटी पीसीआर मीटर से एचआईवी -1 उत्पादन बढ़ाताप्र कि एचआईवी -1 virions 32 और antisense आधारित अणुओं है कि एचआईवी -1 प्रोटीन अभिव्यक्ति 13 के अलावा चुप प्रसंस्करण को बाधित करने के लिए स्थानीय बनाना ऐसे ribozymes के रूप में चिकित्सीय RNAs कि एचआईवी -1 प्रतिकृति चक्र की परिपक्वता कदम पर कार्रवाई के प्रभाव को, याद आती है, 31। वायरल उत्पादन assays की एक सीमा है कि इस्तेमाल किया कोशिकाओं एचआईवी -1 प्रवेश के लिए उचित रिसेप्टर्स व्यक्त नहीं करते और एचआईवी -1 प्रविष्टि या एकीकरण पर चिकित्सीय RNAs के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है।

विरोधी एचआईवी -1 पूरे प्रतिकृति चक्र पर RNAs के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, विभिन्न एचआईवी -1 संक्रमण मॉडल अलग टी लिम्फोसाइट सेल लाइनों या प्राथमिक रक्त कोशिकाओं 5,33 में इस्तेमाल किया गया है। चूंकि इन सेल लाइनों transfect करने के लिए मुश्किल हो जाता है, इस तरह के lentiviral वेक्टर जीन सम्मिलन या aptamer / पेप्टाइड विकार के रूप में अधिक श्रम गहन तरीकों एचआईवी -1 प्रतिकृति पर प्रभाव का पालन करने के लिए विरोधी एचआईवी -1 RNAs के लिए पर्याप्त मात्रा में वितरित करने के लिए आवश्यक हैं। यह सीमा यह di बनाता हैतेजी से एक विशेष विरोधी एचआईवी -1 शाही सेना के वेरिएंट के बीच संरचना गतिविधि संबंध तुलना या विरोधी एचआईवी -1 RNAs के नए वर्गों के लिए इष्टतम लक्ष्य साइट की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर प्रदर्शन करने के लिए स्क्रीनिंग fficult। वायरल उत्पादन assays आसानी से ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों है कि समर्थन एचआईवी -1 प्रतिकृति, ऐसे TZM बीएल कोशिकाओं के रूप में नए विरोधी एचआईवी -1 आरएनए अणुओं, वैकल्पिक सेलुलर मॉडल की पहचान के लिए उपयोगी हो गया है, वहीं स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी होगा विरोधी एचआईवी -1 RNAs इस तरह के प्रवेश और एकीकरण के रूप में प्रतिकृति चक्र में अन्य कदम, निशाना।

विरोधी एचआईवी -1 आरएनए की श्रेणी पर निर्भर करता है, विषाक्तता के कई संभावित तंत्र वर्णित किया गया है। उदाहरण के लिए, antisense आधारित RNAs एचआईवी -1 शाही सेना में एक ही है या उनकी इच्छित लक्ष्य साइट के लिए एक समान अनुक्रम युक्त सेलुलर RNAs पर बंद लक्ष्य प्रभाव हो सकता है। इसी तरह, आरएनए aptamers, ट्रांस-सक्रियण प्रतिक्रिया तत्व (टीएआर) या रेव प्रतिक्रिया तत्व (आरआरई) के बाद मॉडलिंग, सेलुलर जनसंपर्क के कार्य को प्रभावित कर सकता हैऐसे टीएआर आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (TRBP), 34 के रूप में oteins। shRNAs और siRNAs U1 छोटे परमाणु आरएनए प्रोटीन जटिल 36 के प्रोटीन sequestering द्वारा splicing और सेलुलर RNAs के प्रसंस्करण को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है sequestering आरएनएआई प्रोटीन 35 और कुछ U1i अणुओं से शाही सेना के हस्तक्षेप मार्ग को प्रभावित करने के लिए जोड़ा क्षमता है। इन प्रभावों के कुछ सावधान डिजाइन द्वारा कम किया जा सकता है, नए विरोधी एचआईवी -1 आरएनए अणुओं के लिए स्क्रीन में सेलुलर विषाक्तता की माप आगे विकास से संभावित बंद लक्ष्य प्रभाव के साथ अणुओं को छोड़कर में उपयोगी होते हैं। इसके अलावा, बंद लक्ष्य प्रभाव परोक्ष रूप से एचआईवी -1 उत्पादन को बाधित कर सकता है, नए विरोधी एचआईवी -1 एचआईवी -1 उत्पादन स्क्रीन से पहचान अणुओं की प्रभावकारिता मान्य में सेलुलर विषाक्तता एक महत्वपूर्ण माप कर रही है।

सेल व्यवहार्यता परख कदम 3.1 में वर्णित है। 3.4। एक मानक परख है कि विविध एंटीवायरल अणु स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है के विभिन्नता है 37 है। परख, इसके अघुलनशील बैंगनी प्रपत्र को MTT अभिकर्मक कम करने के लिए formazan (पी) एच-निर्भर सेलुलर एंजाइमों NAD की गतिविधि के उपाय। प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित तरीकों 38 से अनुकूलित है और कई किट MTT या अन्य निकट से संबंधित अभिकर्मकों का उपयोग उपलब्ध हैं। हालांकि यह सेल विरोधी एचआईवी -1 आरएनए स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल लाइन में सेल व्यवहार्यता परख करने के लिए महत्वपूर्ण है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विभिन्न सेल लाइनों आरएनए प्रेरित विषाक्तता की ओर उनकी संवेदनशीलता में भिन्नता है। उदाहरण के लिए, रेनॉल्ड्स एट अल। दिखा दिया है कि पासा खेलनेवाला सब्सट्रेट siRNAs MCF7, DU145 और हेला S3 कोशिकाओं 39 में HEK293T कोशिकाओं में सेल व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं है, लेकिन काफी कम सेल व्यवहार्यता था। परख यहाँ बताया लिए, HEK293T कोशिकाओं एक उदाहरण (चित्रा 4) के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं; हालांकि, एक ही परख भी एक सेल लाइन है कि छोटे आरएनए प्रेरित विषाक्तता से 16 अधिक संवेदनशील है में संभावित विषाक्तता का मूल्यांकन करने के MCF7 कोशिकाओं में किया गया है।

e_content "> विरोधी एचआईवी -1 आरएनए के बाद से संसाधित नहीं किया जा सकता और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली है, वे कम immunogenic माना जाता विरोधी एचआईवी -1 प्रोटीन या पेप्टाइड्स की तुलना करने के लिए प्रस्तुत किया। हालांकि, उनके अनुक्रम या संरचना पर निर्भर करता है, वे सहज प्रकाश में लाना कर सकते हैं प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और कई प्रतिरक्षा सेंसर और संकेत दे रास्ते पहचान की गई है कि छोटे RNAs (40 में समीक्षा) का जवाब कर सकते हैं। यहाँ वर्णित प्रतिरक्षा सक्रियण परख में, फॉस्फोरिलेटेड PKR और IRF3 के स्तर को एक के रूप में छोटे RNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में तुलना की गई PKR या TLR3 सक्रियण के संकेत, क्रमशः। दोनों शाही सेना सेंसर सेल लाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला में मौजूद हैं और उनके सक्रियण PKR, अनुवाद में एक बंद नीचे के मामले में टाइप 1 इंटरफेरॉन के उत्पादन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और। मूल्यांकन करने के लिए विरोधी एचआईवी -1 आरएनए के लिए संभावित प्रकार के उत्पादन वैकल्पिक मार्ग द्वारा 1 इंटरफेरॉन सक्रिय करने के लिए, इंटरफेरॉन प्रेरित जीन ADAR1 (P150) के स्तर को भी साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में तुलना की गईविरोधी एचआईवी -1 आरएनए। लंबे dsRNA सकारात्मक नियंत्रण के प्रभाव से प्रदर्शन किया, पाली मैं: सी, इन प्रतिक्रियाओं के सभी (चित्रा 5) HEK293T कोशिकाओं में सक्रिय थे और इसी तरह के प्रभाव MCF7 कोशिकाओं 16 में मनाया गया। चूंकि इन प्रतिक्रियाओं सेल व्यवहार्यता पर प्रभाव के अभाव में एचआईवी -1 उत्पादन को बाधित कर सकता है, प्रतिरक्षा सक्रियण परख नए विरोधी एचआईवी -1 आरएनए की प्रभावकारिता के लिए अतिरिक्त मान्यता प्रदान करता है। इसके अलावा माप है कि इस मूल्यांकन करने के लिए जोड़ा जा सकता भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन को मापने शामिल और सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में 1 इंटरफेरॉन टाइप करें, और अधिक इंटरफेरॉन प्रेरित जीनों की अभिव्यक्ति को मापने। चूंकि इस तरह सीडी 4+ टी कोशिकाओं और मैक्रोफेज के रूप में एचआईवी लक्ष्य कोशिकाओं सहज प्रतिरक्षा सेंसर के विभिन्न स्तरों व्यक्त कर सकते हैं, इस प्रोटोकॉल में वर्णित assays से पहचान उम्मीदवारों को भी इन प्रकार की कोशिकाओं में संभावित प्रतिरक्षा उत्तेजना के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

assays के सभी वर्णनडी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदम डीएनए या आरएनए अभिकर्मक ट्यूब की तैयारी है (1.3 कदम।)। प्लास्मिड डीएनए या आरएनए उच्च शुद्धता की होनी चाहिए सांद्रता के साथ सही ढंग से निर्धारित की। यह भी उचित नियंत्रण शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है। वायरल उत्पादन परख में नए परीक्षण आरएनए अभिव्यक्ति plasmids के मूल्यांकन के लिए, एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण खाली प्लाज्मिड अभिव्यक्ति है। antisense आधारित RNAs के लिए, एक अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण प्लाज्मिड एक गैर लक्षित कर आरएनए व्यक्त भी शामिल किया जाना चाहिए। एक गैर-लक्ष्य ribozyme के लिए दृश्यों और shRNA कि एचआईवी उत्पादन को प्रभावित नहीं करते 13 में प्रदान की जाती हैं। परीक्षण siRNAs के लिए, केवल नकारात्मक नियंत्रण है कि इस्तेमाल किया जा सकता है एक गैर लक्षित कर शाही सेना और वायरल उत्पादन परख 16 में प्रदान की जाती है के लिए एक उपयुक्त गैर लक्षित कर siRNA अनुक्रम है। सेल व्यवहार्यता और प्रतिरक्षा सक्रियण assays के लिए, नकारात्मक नियंत्रण कक्षों अकेले अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ व्यवहार किया जाना चाहिए और यह सी हैritical कि इस तरह की पाली मैं के रूप में एक सकारात्मक नियंत्रण: सी पुष्टि करने के लिए कि कोशिकाओं आरएनए प्रेरित विषाक्तता या प्रतिरक्षा सक्रियण के लिए उत्तरदायी हैं शामिल किया गया है। शाही सेना अभिव्यक्ति plasmids के लिए, खाली प्लाज्मिड यह भी सुनिश्चित करना है कि वेक्टर खुद कोशिकाओं पर विषाक्त प्रभाव नहीं हो रही है शामिल किया जाना चाहिए।

कुल मिलाकर, assays यहाँ बताया एचआईवी -1 जीन या नशीली दवाओं के उपचार में उपयोग के लिए सुरक्षित और प्रभावी आरएनए उपचारों की पहचान की ओर एक अच्छा पहला कदम प्रतिनिधित्व करते हैं। लक्षित कर एचआईवी -1 आरएनए अणुओं के लिए, यह भी महत्वपूर्ण अनुक्रम संरक्षण की गणना करने के लिए एचआईवी -1 उपभेदों घूम, और विस्तृत तरीकों में अपने लक्ष्य स्थल के संरक्षण पर विचार करने के लिए पहले से प्रकाशित किया गया है 15 है। आगे क्लिनिकल परीक्षण में एक अणु को स्थानांतरित करने के लिए, लंबी अवधि के विषाक्तता और प्रभावकारिता के अध्ययन पुष्टि करने के लिए कि पहचान उम्मीदवारों सुरक्षित और क्लिनिक में प्रभावशाली हो जाएगा प्राथमिक मानव कोशिकाओं में और पशु मॉडल में किया जाना चाहिए।

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Acknowledgments

यहाँ प्रस्तुत काम के स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) की कनाडा के संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया (अनुदान DCB-120266, 133377 पीपीपी और एजी को HBF-348967)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM HyClone GE Healthcare SH30243.01
FBS HyClone GE Healthcare SH30396.03
Penicillin/Streptomycin Gibco Thermo Fisher 15140-122
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. Corning 353075, 353047, 353043
Micro tubes Axygen Corning 311-08-051
Low molecular weight Poly I:C InvivoGen 3182-29-6
DharmaFECT-1 Dharmacon T-2001-01 transfection reagent for synthetic RNAs
TransIT-LT1 Mirus MIR 2300 transfection reagent for RNA expression plasmids
Nonidet P40 (NP-40) USB 19628
[32P]dTTP Perkin Elmer BLU505H
poly(A) RNA template  Sigma-Aldrich 10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primer Thermo Fisher 18418-012
DEAE filtermat paper  Perkin Elmer 1450-522
Microplate scintillation counter Perkin Elmer 1450-024
MTT Sigma-Aldrich M-2128
DPBS HyClone GE Healthcare SH30028.02
Microplate spectrophotometer Bio-rad 1706930
Lysis buffer tablets Roche 4693159001, 4906837001 protease and phosphatase inhibitors
Microcentrifuge Eppendorf 5415R
Bradford reagent Bio-rad 500-0006
Gel running chamber Hoefer SE600
Semi-dry transfer cell Bio-rad 1703940
Protein ladder EZ-Run Thermo Fisher BP3603-500
Nitrocellulose membrane Bio-rad 162-0094
BSA Sigma-Aldrich A9647-1006
Antibody stripping solution Millipore 2504
ECL - Pierce Thermo Fisher  PI32106
ADAR1 antibody from Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibody Abcam ab32036
phospho-S396-IRF3 antibody Cell Signaling 4947
PKR antibody from Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibody Cell Signaling 11904
Actin antibody Millipore MAB1501
Peroxidase-labeled goat anti-rabbit KPL 474-1506
Peroxidase-labeled goat anti-mouse KPL 474-1806
Ponceau S  Sigma-Aldrich 6226-79-5

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References

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संक्रमण अंक 115 एचआईवी -1 शाही सेना चिकित्सा प्रभावकारिता विषाक्तता प्रतिरक्षा उत्तेजना सेल व्यवहार्यता MTT PKR ADAR1 TLR3 IRF3 फोस्फोराइलेशन
जीन या ड्रग थेरेपी में उपयोग के लिए लक्ष्य निर्धारण एचआईवी -1 उत्पादन प्रभावकारिता और आरएनए की विषाक्तता का मूल्यांकन
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Scarborough, R. J., Adams, K. L., Del Corpo, O., Daher, A., Gatignol, A. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54486, doi:10.3791/54486 (2016).

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