Protocol
1. للمعالجة باني التجميعي
- حل الأنيلين (1 مل، 11 ملمول) تماما في 60 مل من الكلوروفورم في 250 مل قارورة جولة القاع. إثارة في 600 دورة في الدقيقة ل5 دقائق وبارد إلى 0-5 درجة مئوية مع الثلج. هذا عادة ما يستغرق 15-20 دقيقة (الشكل 2A).
- إضافة الصوديوم دوديسيل البنزين سلفونات (NaDBS) (7.44 غرام، 21 ملمول) إلى حل الأنيلين في دورق كروي، مع التحريك في 600 دورة في الدقيقة.
- حل فوق كبريتات الأمونيوم (APS) (3.072 غرام، 13.5 ملمول) في 20 مل من الماء وإضافة كل منها قطرة من الحكمة أكثر من 30 دقيقة لتجنب ارتفاع درجة الحرارة رد فعل.
- تنفيذ رد فعل في 0-5 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، والسماح لها للوصول إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة أخرى.
- مراقبة خليط التفاعل بدوره في البداية أبيض حليبي بعد 15 دقيقة، والبني الداكن ثم بعد 2 ساعة وفي النهاية إلى اللون الأخضر الداكن ذلك بعد 24 ساعة (الشكل 2B-إف).
- تصفية حل باني-NaDBS مع قمع بوخنر. مزيج 80 مل الكلوروفورم، و 120 مل من الماء في النحوقمع eparation (الشكل 2G).
- احتضان الحل لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة وجمع باني خضراء داكنة من قمع الفصل، وترك NaDBS المتفاعل وكالة الأنباء الجزائرية في طاف مائي.
2. خلط باني مسبار الأشعة فوق البنفسجية والإشعاع
- تمييع باني حل 10X مع الكلوروفورم للماء (1: 3 ت / ت) ومزيج 200 ميكرولتر من باني المخفف مع 6.4 مكرومول من أليغنوكليوتيد] الحمض النووي التحقيق التي كتبها هزاز لطيف لمدة 15 دقيقة في أنبوب microfuge.
- أشرق الحل باني الحمض النووي مع 1200 μJ / الطول 2 من الأشعة فوق البنفسجية في crosslinker ل2 دقيقة. ومن الأهمية بمكان أن التعرض للأشعة فوق البنفسجية يقتصر على المبلغ المشار إليه. مددت التعرض للأشعة فوق البنفسجية يهدد التغيير مضان في باني، من المحتمل بسبب التساهمية عبر ربط باني والحمض النووي.
- مجمعات بيليه بواسطة الطرد المركزي في 17000 x ج لمدة 6 دقائق، ويغسل مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). بيليه مرة أخرى، وإعادة تعليق في برنامج تلفزيوني.
3. Hybridization من باني مسبار
- إضافة 8 ميكرولتر من 100 ميكرومتر أليغنوكليوتيد] الحمض النووي مكملة أو استهداف الأحماض النووية إلى 200 ميكرولتر من المجمعات باني مسبار.
- أداء التهجين التي تعصف حل الخليط لمدة 15 دقيقة في 40 ° C.
- بيليه المجمعات باني بواسطة الطرد المركزي في 17000 x ج لمدة 6 دقائق. يغسل مع برنامج تلفزيوني واعادة تعليق في الماء.
4. الانبعاثات مطرد القياس دولة الإسفار
- إضافة باني من العلاجات المختلفة في صفيحة 96 جيدا وقياس مضان الانبعاثات في نطاق 270-850 نانومتر الإثارة في 250 نانومتر. ينبغي مراعاة ذروة الانبعاثات لباني حوالي 500 نانومتر.
5. مضان المجهر قياس تهجين دوبلكس
- إسقاط معطف باني على ساترة البورسليكات الزجاج وجافة عند 40 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- إضافة التحقيق (8 ميكرولتر من 100 ميكرومتر) على فيلم باني المجففة وأشرق ذلك مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (1200 μJ / سم 2
- غسل فيلم باني مسبار مع برنامج تلفزيوني وجافة عند 40 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- أداء التهجين لمدة 15 دقيقة وذلك بإضافة الهدف الأحماض النووية. هذا يمكن أن يكون عينة بيولوجية أو قليل النوكليوتيد تحكم الهدف (8 ميكرولتر من 100 ميكرومتر). اتبع مع غسل برنامج تلفزيوني.
- الحصول على صور الفلورسنت في 40X التكبير، مع 500 نانومتر تمريرة طويلة التصفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 2A يلتقط الإعداد رد فعل في بداية عملية البلمرة، أي قبل وكالة الأنباء الجزائرية بالإضافة. تشكيل مذيلة هو الخطوة الأولى في رد فعل يحدث التوليف عملية باني في واجهة micellar. الشكل 2B يظهر حل حليبي بعد 5 دقائق. 30 دقيقة بعد إضافة APS رد الفعل يتحول إلى اللون البني قليلا. ويبين الشكل 2C تغيير لون يرتبط مع تشكيل الأوليغومرات. ويبين الشكل 2D اللون البني الداكن بعد 4 ساعات، مما يدل على تركيز عال من سلسلة قصيرة باني، بما يتفق مع رد فعل بطيء للغاية. وأخيرا بعد 48 ساعة حل خضراء داكنة عالية الوزن الجزيئي باني يمكن ملاحظة أن تتوزع في الكلوروفورم في الماء (الشكل 2E). ويبين الشكل 2F حلا باني متجانس فرقت جيدا في قمع فصل مع أي فصل المرحلة.
: المحافظة على together.within الصفحات = "+1"> يمكن أن تقوم الأحماض الأمينية الاستشعار في مستحلب الشكل (2) أو على سطح الأفلام المغلفة انخفاض (الشكل 3). مضان القاعدية من الأفلام باني منخفض نسبيا (الشكل 3A). وأضاف التحقيق الحمض النووي على الفيلم، ويترك ليجف في درجة حرارة الغرفة. عندما أشكال معقدة المتوقع الحمض النووي باني، بزيادة حادة في مضان يمكن ملاحظة (الشكل 3B). الإلكترون تدفق من الحمض النووي سالبة الشحنة يسبب ارتفاع كثافة الإلكترونات في الجزيئات باني، مما تسبب في زيادة مضان. بعد التهجين الناجم عن تفكك الوجهين التحقيق المستهدفة، باني مضان يعود إلى كثافة القاعدية (الشكل 3C). سبب التفكك بسبب التغيرات في العمود الفقري الحمض النووي على تهجين هذه التسوية باني مسبار التفاعل. ويمكن أيضا أن الأحماض النووية الاستشعار مع هذه التكنولوجيا أن يؤديها مباشرة في مستحلب (الشكل 3D). وهناك فائدة من استخدام مستحلب النظام المستند هو التوافق مع الصكوك لوحة القارئ. هذا يسمح لقياس دقيق للغاية من المؤسسة الوطنية للطفولة مضان، والابتعاد عن الصعوبات الناجمة عن مخالفات في طلاء الفيلم. جهاز استشعار على أساس باني في شكل مستحلب غير محددة للغاية. فشل مقدمة من عدم تطابق واحد (مم) في جزئية الهدف لاستعادة القاعدية باني مضان (الشكل 3D).
الشكل 1. إرفاق تحقيقات بوساطة التعرض للأشعة فوق البنفسجية يزيد باني مضان. التهجين الهدف نتائج الأحماض النووية في مفرزة من المؤسسة الوطنية للطفولة، والارتداد من البوليمر إلى مضان القاعدية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ديزيل / ftp_upload / 54590 / 54590fig2.jpg "/>
الشكل 2. توليف باني للمعالجة. (A) ابدأ من رد فعل البلمرة. (ب) بعد 5 دقائق عند إضافة APS ببطء. (C) 30 دقيقة بعد APS بالإضافة. (D) بعد 1 ساعة. (E) وبعد 4 ساعات. (F) المنتجات الخضراء بعد 48 ساعة من رد الفعل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. استخدام باني الإسفار للكشف عن تهجين الحمض النووي. فيلم (A) باني تنشأ من خلال انخفاض الطلاء على الزجاج البورسليكات، تليها التجفيف لمدة 48 ساعة عند 40 درجة مئوية. (ب) مضان باني بعد تجميد التحقيق. (C)بعد تهجين الحمض النووي الهدف مع تحقيقات يجمد باني. (د) الإسفار في 500 نيوتن متر من باني مستحلب قبل وبعد التهجين مع أي عدم تطابق التكميلية أو واحد (مم) [أليغنوكليوتيد الهدف. الرجاء انقر هنا للاطلاع على عرض أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جهاز استشعار على أساس باني من الأحماض النووية يتطلب الإذابة من البوليمر في الماء من أجل التفاعل مع الحمض النووي والحمض النووي الريبي. ويتم إنجاز تشتت باني في المياه باستخدام السطحي لتشكل المذيلات كما ذكرت سابقا 8. بالإضافة إلى NaDBS المستخدمة هنا الأخرى أنيوني السطحي مثل استر دوديسيل حامض 4-sulfophthalic، السطحي غير أيوني مثل ethoxylate نونيل الفينول، أو السطحي الموجبة مثل بروميد cetyltrimethyl الأمونيوم ويمكن أيضا أن تستخدم لتخليق للمعالجة باني 9،10. تركيب وصفها هنا يبدأ مع نسبة ثابتة من NaDBS السطحي أنيونية تضاف إلى الأنيلين مونومر في نسبة 2: 1 الرحى. وNaDBS السطحي له رصيد عالية محب للماء-lipophile (HLB) السماح البلمرة من مونومر الأنيلين مستحلب في الكلوروفورم المياه عن طريق إقامة التوازن بين قطرات النفط البوليمرية micellar والمياه. ثم يتم إضافة APS أكسدة بنسبة 1: 1.5 نسبة المولي لتوليد المذيلات من غرامبسبب باني، حيث يعمل النواة الداخلية كعامل نواة ل. وهذا يؤدي إلى التوجه إلى التعلق بذيل أحادية، مع الحفاظ أيضا باني في حالة توازن ديناميكي مع المحيط المذيبات 11،12. وتشكل عائدات رد فعل في الطريقة التي تسيطر عليها حتى الثانوية البوليمرات الوزن الجزيئي 13. وهذا البروتوكول توليد الجسيمات التي تتراوح من 50 نانومتر إلى 1500 نانومتر +3. حاسمة لوضع رد فعل حيث ينمو ببطء باني ومع ذلك لا تزال قابلة للذوبان هو إضافة بطء وكالة الأنباء الجزائرية أكسدة، ودرجة حرارة منخفضة، وعدم وجود الأحماض PROTONIC قوية. بعض التحسين من النسب المتفاعلة قد تكون ضرورية لتوليد فرقت جيدا باني. باني توليفها من قبل هذه الطريقة غير مستقرة لأكثر من سنة واحدة كما مستحلب. وينبغي تجنب تخفيف المفرط ما قد يخل بميزان HLB من التشتت، مما تسبب باني لترسيب. عالية السرعة الاختلاط يمكن أن تساعد على الحفاظ على المؤسسة الوطنية للطفولة في الحل. الكمال الذوبان غير مرغوب فيه، لأن من شأنه أن يحول دون formati بيليهعلى، وهو معيار هام لإجراءات التهجين في جهاز استشعار على أساس مستحلب.
بعد توليد فرقت باني، وترد oligos الحمض النووي التحقيق الى البوليمر من خلال التفاعل الكهربائي. تفاعل مجموعة إمين باني والفوسفات من العمود الفقري من الحمض النووي يحدث بشكل عفوي. التفاعلات حمض غير محددة باني النووية تعقد الاستشعار عن تحليلها في العينات البيولوجية المعقدة 14. لتحقيق الارتباط بين المؤسسة الوطنية للطفولة والحمض النووي التحقيق التي يمكن تمييزها عن التفاعلات عفوية، والمشع المجمع مع الأشعة فوق البنفسجية. إنشاء الأنصاف القطبية الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية، أثار تهمة توطين يزيد بلل من سطح البوليمر 15. تعرض الأمثل هو حوالي 2 دقيقة، ويمكن التأكد إذا تم رفع باني مضان في 500 نانومتر تقريبا 5X (الشكل 3). الإفراط في التعرض للمجمع للأشعة فوق البنفسجية يمكن أن تؤدي إلى يشابك بين المؤسسة الوطنية للطفولة والحمض النووي، الذي عكس التفاعلات كهرباء، ظبيةق لا يسبب ارتفاع باني مضان.
عملية توليد أجهزة الاستشعار سهلة وسريعة. الانتهاء من رد فعل البلمرة بعد 48 ساعة تليها 24 ساعة لفصل من أكسدة غير المتفاعل وNaDBS. سوف تحتاج إلى القيام بها بشكل غير منتظم وكمية من باني الأسهم التي تنتجها بروتوكول في هذه المقالة التوليف هو قريب كبيرة جدا لكمية المستخدمة في جهاز استشعار. باني مستحلب بتركيزات عالية مستقرة. ومع ذلك، فإن أي تخفيف التي تحدث خلال مرفق التحقيق يمكن أن يؤدي إلى هطول الأمطار من المؤسسة الوطنية للطفولة، التضحية بالأداء الاستشعار. فإن استخدام الفوري من المجمعات باني مسبار للكشف عن أهداف تجنب هذه المسألة. معا، وإنشاء المجمعات والتهجين ويمكن أن يتم في أقل من ساعة. الأفلام باني مسبار وأكثر استقرارا، ويمكن استخدامها بعد التخزين على المدى الطويل. وجود قيود على هذه تكنولوجيا الاستشعار هو أنه لا قابلة للغاية لمضاعفة. يجب أن يتم كل حدث كشف في أنبوب منفصل. قد الأفلامتوفير أفضل شكل لمضاعفة كما يمكن رصدت تحقيقات مختلفة على مناطق مختلفة من فيلم. ويمكن تطبيق النموذج على مجموعة بقعة، ومضان في كل بقعة تستخدم لتقييم التعبير عن الجينات مختلفة.
آلية الكشف عن وصفها هنا توفر العديد من المزايا أكثر من النظم الأخرى. تعتمد تقارير كشف الأحماض النووية من خلال آلية التفكك التي تنطوي باني على fluorophores المرفقة للتحقيق oligos الحمض النووي 5. استراتيجيات أخرى تستخدم مرفق التساهمية من التحقيقات، التي لا تميز الاختلافات قاعدة زوج واحد في الهدف الأحماض النووية 16-17. إغفال وضع العلامات أو وسائط أخرى ثانوية للكشف في هذه التكنولوجيا يخلق فرصا لاستخدام خصائص أخرى لباني الكهربائية النشط. وبالتالي يمكن تمديدها استجابة جهاز استشعار لقياس خصائص الكهروكيميائية تتغير من خلال ديناميات مرفق مفرزة من أجهزة الاستشعار. سوف المختبرات التي تعتمد هذه التقنية العثور على الصورةنظام إنسور أن يكون فعالا من حيث التكلفة بالإضافة إلى سريع ومباشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
- Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
- Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498 (2013).
- Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
- Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
- Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569 (2011).
- Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
- John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
- El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
- Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
- Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
- Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
- Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
- Kadashchuk, A., et al.
- Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
- Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).
