Protocol
1.可处理合成聚苯胺
- 溶解苯胺（1毫升，11毫摩尔）完全在60毫升氯仿中的250毫升圆底烧瓶中。在搅拌600转5分钟，冷却至0-5℃，有冰冻。这通常需要15-20分钟（ 图2A）。
- 十二烷基苯磺酸钠（NaDBS）（7.44克，21毫摩尔）添加到在圆底烧瓶中的苯胺溶液在600rpm搅拌。
- 溶解过硫酸铵（APS）（3.072克，13.5毫摩尔）在20毫升水中，并添加所有的它逐滴在30分钟内，以避免过热的反应。
- 进行在0-5℃反应24小时，并使其达到室温下再24小时。
- 观察反应混合物最初打开乳白色15分钟后，再暗褐色后2小时，最后以24小时后（ 图2B-F）的深绿色。
- 过滤用布氏漏斗聚苯胺-NaDBS解决方案。用80毫升氯仿和120ml水在作为混合eparation漏斗（ 图2G）。
- 在室温下孵育24小时的溶液，并收集从分离漏斗暗绿色聚苯胺，留下未反应的NaDBS和APS在含水上清液。
2. PANI探针混合和紫外线照射
- 稀聚苯胺溶液10倍，用氯仿 - 水（1：3体积/体积）并通过温和摇动用于在微量离心管15分钟，混合200微升稀释聚苯胺与探针DNA寡核苷酸的6.4微摩尔。
- 照射在交联剂与1200μJ/ cm 2的紫外线的PANI-DNA溶液2分钟。至关重要的是，紫外线照射被限制为指定量。延长暴露于UV损害在聚苯胺的荧光的变化，可能是由于聚苯胺和DNA的共价交联。
- 沉淀物通过离心在17000×g离心6分钟，并立即用磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。再次颗粒，并在PBS再中止。
3. ^ h聚苯胺探头的ybridization
- 添加8微升100微米的互补DNA寡核苷酸或靶核酸200微升聚苯胺探针复合物。
- 在40摇动溶液混合物15分钟进行杂交 C。
- 沉淀通过离心聚苯胺配合物在17000×g离心6分钟。用PBS洗涤，并在水中重新悬浮。
4.排放稳态荧光测量
- 从不同处理在250nm处添加聚苯胺到96孔微量培养板，并测量在270-850纳米范围内发射荧光通过激发。对于聚苯胺的排放峰值应该围绕500纳米观察。
杂交复式5.荧光显微镜测量
- 滴涂层聚苯胺上的硼硅玻璃盖玻片并干燥在40℃下48小时。
- 在干燥的聚苯胺薄膜添加探头（8微升100μM），并用紫外线（1200微焦/厘米2照射它
- 用PBS洗聚苯胺探针膜并干燥，在40℃48小时。
- 通过加入靶核酸15分钟进行杂交。这可能是一个生物样品或控制目标寡核苷酸（8微升100μM的的）。用PBS洗涤跟随。
- 获取荧光图像放大40倍，具有500纳米长通滤波器。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图2A捕捉在聚合过程中， 即 ，APS添加前的开始时的反应设置。胶束的形成是在胶束界面反应中的初始步骤过程聚苯胺合成发生。 图2B示出了5分钟后乳状溶液。 30分钟的APS加到在反应后变成浅棕色颜色。 图2C示出了具有低聚物的形成相关的颜色的变化。 图2D示出了4小时后深棕色，表明短链聚苯胺的高浓度，具有一致的一个非常缓慢的反应。最后48小时后，可观察到高的分子量聚苯胺的深绿色溶液被分散在氯仿-水（ 图2E）。 图2F示出了良好分散的，均匀的聚苯胺在分液漏斗中，没有相分离溶液。
图2）或滴涂膜的表面上（ 图3）。聚苯胺薄膜的基础荧光相对较低（ 图3A）。探针DNA是在薄膜中加入，并在室温下干燥。当预期的DNA聚苯胺复合物的形式，在荧光的激烈的增加，可以观察到的（ 图3B）。从带负电荷的DNA的电子流入导致聚苯胺分子较高的电子密度，导致荧光增加。探针-靶双链体的杂交诱导解离后，聚苯胺荧光返回到基底强度（ 图3C）。离解是通过在杂交时的DNA骨架的妥协聚苯胺 - 探针相互作用的变化而引起的。传感核酸用这种技术也可在乳液（ 图3D）直接进行。使用该乳液的益处基于系统和微孔板检测仪仪器的兼容性。这允许聚苯胺荧光的高度精确的测量，并避免了由在膜包衣凹凸困难。乳液格式基于聚苯胺传感器是非常具体的。引入在目标寡一个错配（毫米）的未能恢复基底聚苯胺荧光（ 图3D）。
图1. 紫外线照射调节探头附件从聚苯胺增加目标脱离核酸结果聚苯胺荧光。的杂交和聚合物基础荧光逆转。 请点击此处，查看这个数字的放大版。
尔斯/ ftp_upload / 54590 / 54590fig2.jpg“/>
图2. 合成处理的聚苯胺（A）聚合反应的开始。 （B）的5分钟后，当缓慢加入APS。 （C）30分钟后，APS加法。 （D）1小时后。 （E）经过4小时。 （F）后反应48小时绿色环保产品。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.聚苯胺荧光的使用，以检测核酸杂交。通过滴涂层上硼硅玻璃在（A）的聚苯胺薄膜，随后在40℃干燥48小时。 （B）探针固定后聚苯胺的荧光。 （C）以下用聚苯胺固定化的探针的靶DNA杂交。在之前与任何互补或错配（毫米）的目标寡核苷酸杂交后聚苯胺乳液为500nm（D）荧光。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
核酸基于PANI-传感器需要在水中的聚合物增溶，以与DNA和RNA相互作用。聚苯胺在水中的分散体是使用表面活性剂来完成，形成微胶粒如先前报道8。除了这里使用的其它阴离子表面活性剂一样的4-磺基邻苯二甲酸十二烷基酯的NaDBS，如壬基苯酚乙氧基化物，或类似的溴化十六烷基三甲铵阳离子表面活性剂的非离子表面活性剂也可用于加工的聚苯胺9,10的合成。这里所描述的合成始于在2加入单体苯胺的阴离子表面活性剂NaDBS的固定比例：1的摩尔比。表面活性剂NaDBS具有高的亲水 - 亲油平衡（HLB）使由胶束聚合物油滴和水之间建立平衡在氯仿 - 水中乳化苯胺单体的聚合。氧化剂的APS然后以1加入：1.5的摩尔比，以产生克的微胶粒由于聚苯胺，其中该内芯充当成核剂。这导致前往单体的尾部附件，同时也保持聚苯胺处于动态平衡与周围溶剂11,12。以受控的方式进行反应，直到高分子量聚合物形成13。该协议将生成的范围从50纳米至1500纳米的3粒子。临界建立，其中聚苯胺生长缓慢但仍然可溶的反应是在加入的氧化剂的APS，低温，和缺乏强质子酸的慢。反应物的比例的一些优化可能是必要的，以产生分散良好的聚苯胺。用这种方法合成的聚苯胺为一年以上作为乳液稳定。应避免过分稀释作为分散剂的HLB平衡可能被破坏，从而导致聚苯胺沉淀。高速混合可以帮助保持聚苯胺在溶液中。完美的溶解度是不可取的，因为这会妨碍粒料formati上，这是用于在基于乳液的传感器杂交方法的一个重要标准。
之后产生地分散聚苯胺的DNA探针寡核苷酸被附连到通过静电相互作用的聚合物基质。发生聚苯胺亚胺基团的互动与DNA的骨干磷酸盐油然而生。非特异性的PANI-核酸相互作用复杂复杂生物样品14中的分析物检测。实现聚苯胺和探头的DNA之间的关联，可以从自发的相互作用来区分，复数照射紫外线。通过UV引发的电荷定位诱导极性部分的创建增加了聚合物表面15的润湿性。最佳曝光是约2分钟，并且如果在500nm聚苯胺荧光大致升高5X（ 图3）可以得到证实。过度曝光的复合物的UV可导致聚苯胺和DNA，它不像静电相互作用，美国能源部之间的交联不是引起聚苯胺荧光的正视图。
传感器生成的过程简单快捷。聚合反应在48小时后24小时，以与未反应的氧化剂和NaDBS分离后结束。合成将需要如由本文中的协议生成库存聚苯胺的量很少进行是相对于在传感器中使用的量非常大。在高浓度聚苯胺乳液是稳定的;然而，探头附件期间发生任何稀释可能会导致聚苯胺的沉淀，影响传感器的性能。立即使用聚苯胺探针复合物探测目标会避免此问题。总之，复合物和杂交可以创造一个小时下进行英寸PANI-探针膜是更稳定的，并且可以在长期存储中。本传感器技术的一个限制是，它不是非常适合于复用。每个检测事件必须在一个单独的试管中进行。薄膜可以提供复用更好的格式，不同的探头可以在一部电影的不同区域被发现。样品可以在点阵列被应用，并且在每个点的荧光来评价不同基因的表达。
这里所描述的检测机构超过其他系统提供了若干优点。通过涉及聚苯胺的解离机制检测核酸的报告依赖于连接到探针DNA寡核苷酸5荧光。其他策略使用探头，它未能区分靶核酸16-17单碱基对差异的共价结合。标记或检测在本技术的其它二次模式的省略创造了机会使用电活性聚苯胺的其他属性。传感器的响应因而可以扩展到由传感器的连接 - 分离动力学改变电化学性能的测量。采用这种技术实验室将获得S恩索尔系统具有成本效益，除了快速和简单。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
- Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
- Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498 (2013).
- Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
- Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
- Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569 (2011).
- Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
- John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
- El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
- Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
- Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
- Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
- Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
- Kadashchuk, A., et al.
- Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
- Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).
