Abstract
Transmission (TEM) indeholder oplysninger om den cellulære organisation og ultrastruktur. Men TEM analyse af sjældne cellepopulationer, især celler i suspension, såsom bloddannende stamceller (HSC'er), fortsat begrænset på grund af kravet om en høj celletal under forberedelsen. Der er et par cytospin eller monolag tilgange til TEM-analyse fra knappe prøver, men disse metoder ikke får betydelige kvantitative data fra det begrænsede antal celler. Her er en alternativ og ny tilgang til prøveforberedelse i TEM undersøgelser beskrevet for sjældne cellepopulationer som muliggør kvantitativ analyse.
Et forholdsvis lavt celleantal, dvs. 10.000 HSC'er, blev med succes anvendt til TEM-analyse sammenlignet med millioner af celler, der typisk anvendes til TEM undersøgelser. Især blev Evans blue-farvning udført efter paraformaldehyd-glutaraldehyd (PFA-GA) fiksering at visualisere den lille celle pellad, som lettet indlejring i agarose. Klynger af talrige celler blev observeret i ultra-tynde sektioner. Cellerne havde en velbevaret morfologi, og ultra-strukturelle detaljer i Golgi komplekse og flere mitokondrier var synlige. Denne effektive, nem og reproducerbar protokol tillader prøveforberedelse fra et lavt celleantal og kan anvendes til kvalitativ og kvantitativ TEM analyse på sjældne cellepopulationer af begrænsede biologiske prøver.
Introduction
Ultra-strukturelle og sub-organel detaljer i celler er blevet hovedsageligt afsløret af transmission (TEM) undersøgelser fra væv eller cellepellets 1,2. Faste stykker af væv kan nemt udnyttes til elektronmikroskopi undersøgelser. Men TEM analyser 1,3 på celler i suspension forbliver udfordrende og nødvendiggøre høje celletal, dvs. millioner af celler. På grund af dette, ultra-strukturelle analyser af sjældne cellepopulationer i suspension, fx hæmatopoietiske stamceller (HSC'er), er ikke let vurderes. Flere forsøg for TEM-analyse fra knappe prøver ved anvendelse af cytospin eller monolag tilgange ikke får betydelige kvantitative data fra det begrænsede antal celler. Kravet om en høj celletal begrænser således anvendelsen af dette kraftfulde værktøj til at forstå de subcellulære ultrastrukturelle detaljer i sjældne cellepopulationer.
En vigtig begrænsning for TEM undersøgelser med et begrænset antal celles i suspension er lokaliseringen af cellerne for behandling og dermed TEM undersøgelser fra begrænsede celler med især små størrelser forbliver udfordrende. Der er vedtaget en række alternative tilgange til at imødegå denne begrænsning: BSA / bisacrylamid (BSA-BA) medieret polymerisering cellesuspension, farvning af celler med et farvestof for at gøre dem synlige på en tynd film støtte, herunder dækglas, og TEM analyser fra cytospinpræparater 4-6. Imidlertid blev meget begrænset succes opnået, som meget få celler blev fundet i sektionerne efter ultra-skæring. Den centrale udfordring at identificere sparsomme celler vedvarer fordi cellemonolaget forbliver det meste usynlige i det størknede gel til sektionering. Endvidere kan cytospin fremstilling af celler ændrer deres cellulære organisation grund cellespredning og sårbarheden af cellestrukturen. Derfor er disse iboende ulemper berettiger en ny tilgang til at udføre TEM undersøgelser af sjældne cellepopulationer med merekonsistens. For at overvinde dette problem har vi beskrevet en hidtil ukendt og alternativ prøveforberedelse fremgangsmåde til TEM undersøgelser fra sjældne cellepopulationer 7.
Her rapporterer vi en effektiv prøveforberedelse protokol til at udføre TEM fra knappe biologiske prøver med konsekvente kvalitative og kvantitative resultater. Evans blue-farvning blev udført efter fiksering for at lokalisere en lille cellepellet fra lavt antal celler, dvs. 10.000 knoglemarv hæmatopoietisk stamceller og progenitorceller, som ellers ville være forblevet usynlige, og pelleten blev indlejret i agarose før dehydrerings- og harpiks indlejring processer. Denne metode klynger cellerne sammen og muliggør effektiv analyse af ultrastruktur og subcellulær tilrettelæggelse af hæmatopoietiske stamceller (identificeret som Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -, HSC), en sjælden 0,2 - 0,5% cellepopulation i knoglemarven. Denne eksperimentelle proprotokol kan være nyttigt at udføre ultra-strukturelle studier og opnå kvantitative resultater på mange sjældne, men meget vigtige bestande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af den institutionelle dyr udvalget ved Cincinnati Children 's Research Foundation. Til denne undersøgelse blev bloddannende stamceller isoleret fra knoglemarv fra C57BI / 6 indavlede mus alderen 2 - 4 måneder. Cellesortering under anvendelse af FACS efter farvning af BM med forskellige overflade beslutningstagere herunder Lineage, c-Kit, Sca-1, blev Flt3 og CD34 anvendes til oprensning af HSC baseret på Lin- Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating strategi som standard protokollen beskrevet før 8.
ADVARSEL: Flere meget giftige kemikalier anvendes under denne procedure. Disse er giftig ved indånding og ved kontakt med huden. Venligst bære handsker og beskyttelsesdragt. Arbejde i stinkskab, mens du arbejder med disse kemikalier.
1. Celler, Fiksering, Farvning og Pre-embedding
- Sorter 10.000 bloddannende stamceller (ved hjælp af Lin - Sca-1
- Spin ned sorterede HSC'er på 1000 xg i 10 minutter i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved hjælp af en centrifuge med swing-out spande. Fjern medium ved forsigtig aspiration og efterlade 200 pi medium i rørene på hvert trin. På dette stadium cellepelleten forbliver usynlig i røret.
- Fikseres cellerne ved tilsætning af 0,2 ml 2x fiksativ opløsning ved stuetemperatur (RT) i 1 time 1,9.
- Gør fikseringsopløsning frisk før brugen. På 1x opløsningen består af 3% paraformaldehyd og 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M cacodylatbuffer.
- Centrifuger cellerne ved 1000 xg i 10 minutter ved 30 ° C under anvendelse af en centrifuge med swing-out spande.
- Vask cellerne med 600 pi 0,1 M cacodylatbufferanvendelse af centrifugering og efterlade 200 pi buffer i røret efter centrifugering.
- Farv de fikserede celler ved tilsætning af 200 pi 2 mg / ml opløsning af Evans Blå i cacodylatbuffer og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur. Cellerne vil blive farvet blå.
- Vask cellerne 3 gange med 600 pi 0,1 M cacodylatbuffer ved hjælp af centrifugering og efterlade 200 pi buffer i røret hver gang.
- Resuspender cellerne i 200 pi buffer og overføre cellesuspensionen til en 0,5 ml rør. Centrifuger ved 1.000 xg i 10 minutter under anvendelse af en bordcentrifuge. Fjern buffer forsigtigt uden at forstyrre nu synlig lillebitte celle pellet, og lad 50 pi buffer i røret.
- Tilsæt 200 mg lavtsmeltende agarose til 5 ml 0,1 M cacodylatbuffer i 15 ml rør til et 4% agaroseopløsning. Smelt agarose ved at overføre røret til kogende vand i en 100 ml glasflaske og holde lunken indtil anvendelse.
- Der tilsættes 200 pi 4% lavtsmeltende agarose opløst i 0,1 M cacodylaTE-puffer til cellesuspensionen i 0,5 ml rør og straks centrifugere ved 1000 xg i 10 minutter ved 30 ° C under anvendelse af en bordcentrifuge.
- Efter bekræftelse af, at cellerne pelleteret ved bunden af 0,5 ml rør ind i halvfast agarose efter centrifugering, som straks flyttes røret til 4 ° C eller is i 20 minutter for at størkne agarosen. Dette trin er en meget kritisk, da en lille synlig cellepellet på dette trin resulterer i en god klynge af celler under elektronmikroskop.
- Overføre omhyggeligt den størknede agarose indeholdende cellepelleten fra røret til en 35 mm plastik petriskål indeholdende puffer under anvendelse af en 27 G nål 3,10.
- Trimme det størknede agarose indeholdende cellepelleten i ét stykke på ca. 1 - 2 mm med en skalpel. Overfør agarose stykke indeholdende cellepelleten i et nyt 1,5 ml rør.
- Vask 2 - 3 gange under anvendelse 600 pi 0,1 M cacodylatbuffer ved at tilføje og fjerne puffer under anvendelse pipette uden centrifugering. Brug denne agarose stykke indeholdende cellepelleten i det næste trin. På dette trin kan prøven opbevares ved 4 ° C natten over før flytning til næste trin.
2. Osmification, Dehydrering, Embedding
- Fjern cacodylatbuffer fra 1,5 ml rør med cellepelleten indeholdende agarose anvendelse af en pipette. Tilsættes 1,0 ml 1% osmiumtetraoxid (OSO 4) opløsning i et stinkskab, og der inkuberes i 1 time ved 4 ° C.
- Der vaskes tre gange med 600 pi 0,1 M cacodylatbuffer og overføre prøven til et 20 ml glasscintillationshætteglas med en hætte.
- Behandl prøven til dehydrering, infiltration og indlejring i resin (f.eks LX-112) med serielle ændringer af følgende løsninger i en 6 brønds plade. Flyt celle-pellet agarose stykke med en pincet.
- Fordybe prøven i 25% ethanol ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Fordybe prøven i 50% ethanol ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Fordyb prøven i 75%ethanol ved stuetemperatur i 15 min.
- Fordybe prøven i 95% ethanol ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Fordybe prøven i 100% ethanol ved stuetemperatur i 15 minutter, to gange.
- Fordybe prøven i ethanol: harpiks (3: 1) ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Fordybe prøven i ethanol: harpiks (1: 1) ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Fordybe prøven i ethanol: harpiks (1: 3) ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Fordybe prøven i ren harpiks ved stuetemperatur i 60 minutter, to gange.
- Overfør prøven til bunden af pyramiden spids formet gummi støber med pincet omhyggeligt og tilføje mere ren harpiks oven på prøven for at fylde formen. Prøven inkuberes ved 60 ° C i 72 timer for harpiks polymerisation.
- Fjern den polymeriserede harpiks pyramide fra formene ved at dreje gummi formen. En lille sort klynge af celler skal være synlige i den polymeriserede harpiks pyramide, som beskrevet tidligere 7. Fastgør den polymeriserede harpiks pyramide på montering cylinder hjælp cyanoacrylat.
- Trim pyramiden blok med et barberblad og en diamant kniv efter montering blokken på en ultra-mikrotom. Foretag en kort bred trapezform med toppen og bunden af blokken parallelt med hinanden, og med jævnt vinklede sider. Denne form af pyramiden hjælper til seriel sektionering.
- Endvidere trimme blokken omkring cellepelleten med diamant kniv og fjern plast sektioner omkring cellepelleten agarose stykke.
- Skær 1 um snit under anvendelse af en ultra-mikrotom. Flyt 1 um snit fra vandet båd til et objektglas under anvendelse af en øjenvippe værktøj og et metal loop værktøj som tidligere rapporteret 7. Overleveringsstrækningerne på objektglas og overføre objektglas varmepladen (37 ° C) til tørring.
- Tilføj en dråbe toluidinblåt løsning på de sektioner ved hjælp af en sprøjte med 0,22 um filter og inkuberes i 3 min. Skyl objektglassene med destilleret vand og let sektionerne tørre. Check med et lysmikroskop til at identificere positionen af cellerne.
- Skær ultra-tynde sektioner (70 - 100 nm) under anvendelse af en diamant kniv. Flyt 2 - 3 sektioner på 200-mesh net fra vandet båd til et glas petriskål ved anvendelse af en øjenvipper værktøj.
- Overfør glasset petriskål indeholdende net med sektioner til en varm plade ved 30 ° C for at tørre sektioner i 30 minutter.
- Farv gitrene med dråber af 1% uranylacetat ved stuetemperatur i 10 minutter og derefter skylles i destilleret vand 6 - 8 gange. Pletten med Reynolds blycitrat, ved stuetemperatur i 5 minutter og skyl i destilleret vand 6 - 8 gange. Overfør glasset petriskål indeholdende nettene til en varm plade ved 37 ° C for at tørre sektioner.
- Analyser afsnittene med et elektronmikroskop, ved 80 kV 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En effektiv og konsekvent protokol til prøveforberedelse at udføre TEM analyse fra lavt antal celler er beskrevet. Post-fiksering farvning med Evans blå og overførsel af celler til en 0,5 ml mikrocentrifugerør hjalp visualisere den lille cellepellet 7. Osmification med osmiumtetraoxid i agarose ført til en let påvisning af det mørke cellepellet i løbet af dehydrering og forankring.
Semi-tynde sektioner fra blokkene indeholder en lille cellepellet bekræftede en klynge af talrige celler sammen (figur 1A og 1B). Ultra-tynde snit blev skåret fra cellelokaliteten grupperet område og analyseret under elektronmikroskopi (figur 1C). Morfologien og ultra-strukturen af disse celler blev godt bevaret (figur 1D). Den elektronmikroskop af enkelte celle udviste høje detaljer på den intracellulæreultra-strukturer (figur 1E). Desuden viste stor forstørrelse (50,000X) billeder en velbevaret struktur og integriteten af sub-cellulære organeller, såsom mitochondrier (figur 1F).
Figur 1: Billedanalyse Under Lys og Electron Microscope. (A) lav forstørrelse billede af en repræsentativ felt i en toluidinblåt farvede afsnit af 1 um tykkelse under lysmikroskop. (B) Light mikroskop billede, der viser den intakte morfologi af celler i klyngen efter toluidinblåt farvning af 1 um tykkelse sektion. (C) En oversigt område af cellen klynge observeret under elektronmikroskop efter farvning med uranylacetat og blycitrat. (D) En enkelt LT-HSC under elektronmikroskop. (E) Højere magnifgement billede af HSC viser subcellulære strukturer. (F) Højere forstørrelse billede af mitokondrier fra HSPC. Målestok: A / B, 100 um; C, 10 um; D, 2 um; E / F, 500 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode gør det muligt for TEM-analyse på lave celle numre, ved hjælp af Evans blå farvning og agarose indlejring at lokalisere en lille celle pellet under dehydrering, harpiks indlejring og sektionering processer. Vigtigere, det fastholder celleklynger sammen og bevarer celle ultra-struktur, hvilket er ønskeligt at undersøge flere celler til kvantificering af data.
I TEM undersøgelser, er en celle pellet indeholder millioner af celler ofte kræves til effektiv forankring i en agarose / gelatine matrix og for vask, dehydrering og infiltration at indhente data fra mange celler. Forskere har vedtaget immobilisering af cellesuspensionen i en BSA-bisacrylamid polymeriseret harpiks, farvning af monolag på en tynd support eller cytospins til TEM-analyse på lave celleantal / knappe prøver 4-6. Men det er stadig en kedelig opgave, at lokalisere og skære celler under TEM grund af den sparsomme fordeling af cellerne i matrixen ogmulige ændringer i cellens morfologi, som skyldes at sprede og en spaltning mellem cellerne under cytospin forberedelse, som ofte krævede re-indlejring før sektionering. Endvidere monolaget stadig en udfordring at lokalisere til sektionering 11. Således er en cellepellet selv fra knappe biologiske prøver af lav celleantal er meget lettere for TEM-analyse 1.
Denne fremgangsmåde udgør en betydelig fordel til tidligere publicerede metoder 4,5 med hensyn til kvalitativ og kvantitativ ultra-strukturel analyse fra begrænsede prøver. Sammen denne protokol beskriver en effektiv måde at lokalisere cellepellets for TEM hjælp Evans blå, hvilket gør prøve behandling fra lave celleantal let for TEM at muliggøre kvalitativ og kvantitativ dataanalyse. Typisk prøvefremstilling for TEM kræver et større antal celler end det, der normalt kræves til lysmikroskopi på grund af de mange trin i prøve behandling feller TEM og korrekt orientering af cellen blok til skæring i rette position 1,10.
Det er kendt, at post-fiksering osmification giver en bedre kontrast i billeder, især dem af membraner og glykogen partikler under et elektronmikroskop 9, og yderligere støtte farvning med uranylacetat, en relativt ikke-specifik farvning for proteiner, og blycitrat som farver membraner, nukleinsyrer og glycogen. Men osmification er næsten umuligt at udføre med knappe biologiske prøver i suspension efter forbehandlingen indlejring i BSA-BA grund af den høje risiko for prøven tab under sektionering og matrix mørkfarvning. Således kvaliteten af elektronmikrofotografier blev kompromitteret i tidligere undersøgelser 4,9. Osmification her førte til mørkfarvning af cellepelleten med en minimal ændring i farven på agarose. Den foreliggende protokol tillader således osmification efter præ-indlejring i agarose for at give god kontrast i TEM imaldre.
Cell klynger var ganske let at analysere med elektronmikroskopi ved hjælp af denne metode. Den præ-farvning med Evans blå bidraget til at lokalisere bittesmå cellepellets under prøveforberedelse uden at påvirke sub-organel celle detaljer. Denne metode giver en alternativ fremgangsmåde til prøveforberedelse at kunne udføre TEM analyse fra lave celleantal. Ved denne metode blev TEM-analyse effektivt udført ved anvendelse af celler af en lille størrelse (5 - 8 um). Således kan denne fremgangsmåde let vedtages med endnu lavere celleantal (~ 1000 celler) af større celler, såsom fibroblaster og endotelceller. Selvom Evans blue ikke påvirkede sub-organel celle detaljer i den foreliggende undersøgelse, er anvendelsen af Evans blue for immuno-guld elektronmikroskopi med lave celleantal ikke blevet testet.
Sammen beskrives en effektiv fremgangsmåde til prøvefremstilling at udføre TEM undersøgelser fra et lavt celleantal. TEM undersøgelser er at afsløre critical oplysninger om morfologi og de ultra-strukturer i celler. Derfor er ultra-strukturel information ofte mangler på forskellige knappe cellepopulationer. Dette alternativ og ny tilgang til prøveforberedelse vil være nyttigt at udføre TEM undersøgelser fra enhver sjælden cellepopulation. Desuden er denne fremgangsmåde tillader kvalitative og kvantitative data fra analysen af celleklynger. Som elektronmikroskopi uovertruffen detaljer af cellen ultra-struktur og organisation, vil denne metode være ganske nyttigt at forstå mange biologiske processer på tasten, men sjældne, cellepopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic Petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D.
- Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
- Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
- Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
- Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
- Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
- Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
- Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
- Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).
