Abstract
透過型電子顕微鏡（TEM）は、細胞、組織及び微細構造の詳細を提供します。しかしながら、このような造血幹細胞（HSC）などの希少細胞集団、懸濁液中で特に細胞のTEM分析は、によりサンプル調製時の高い細胞数の要件に制限されたままです。そこ希少試料からのTEM分析のためのいくつかのサイトスピンまたは単層のアプローチがありますが、これらのアプローチは、限られた数の細胞から重要な定量的なデータを取得するために失敗します。ここでは、TEM研究における試料調製のための代替的なおよび新規なアプローチは、定量的な分析を可能にする希少細胞集団のために記載されています。
比較的低い細胞数、 すなわち10,000のHSCは、正常通常はTEM研究のために使用される細胞の数百万人に比べTEM分析に使用しました。具体的には、エバンスブルー染色は、小さな細胞画素を可視化するために、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（PFA-GA）固定後に実施しましたアガロースに包埋促進する、しましょう。多数の細胞のクラスターは、超薄切片において観察されました。細胞はよく保存形態を有し、かつゴルジ複雑で、いくつかのミトコンドリアの超微細構造の詳細が表示されていました。この効率的で、簡単で再現可能なプロトコールは、低細胞数からの試料調製を可能にし、限られた生物学的サンプルから稀な細胞集団の定性的および定量的なTEM分析のために使用することができます。
Introduction
細胞の超構造的およびサブオルガネラ詳細は主に組織または細胞ペレット1,2の透過型電子顕微鏡（TEM）の研究によって明らかにされています。組織の固体片を容易に電子顕微鏡研究のために利用することができます。しかし、TEMは、懸濁液中の細胞に1,3を分析した細胞の数百万、厳しい状況が続くと高い細胞数を必要とする、 すなわち 。このため、懸濁液中の希少な細胞集団の超構造解析は、 例えば、造血幹細胞（HSC）は、容易に評価されません。サイトスピンまたは単層のアプローチを使用して、不足して試料からのTEM解析のために複数の試みは限られた数の細胞から重要な定量的なデータを取得するために失敗します。このように、高い細胞数の要件は、希少な細胞集団の細胞内超微細詳細を理解するために、この強力なツールの使用を制限します。
セルの数が限られているTEM研究のためのキーの制限懸濁液中のsが処理のために、細胞の局在であり、従って、特に小さいサイズの制限された細胞由来のTEM調査は困難なままです。いくつかの代替的なアプローチは、この制限に対抗するために採用されている：細胞懸濁液のBSA /ビスアクリルアミド（BSA-BA）媒介重合、細胞の染色を染料でカバースリップを含む薄いフィルム支持体上にそれらが表示されるように、 およびTEMは、サイトスピン調製物4-6から分析します。非常に少数の細胞が超切片後の節で見たようしかし、非常に限られた成功は、達成されました。細胞単層は、切片のために固化したゲル中の大部分が見えないままなので、スパース細胞を同定するの主要な課題は解消されません。さらに、細胞のサイトスピン調製を伴う細胞拡散、細胞構造の脆弱性への細胞の組織を変化させることができます。したがって、これらの固有の欠点は、より稀な細胞集団からのTEM調査を実行するための新規なアプローチを正当一貫性。この問題を克服するために、我々は、まれな細胞集団7からTEM研究のための新規かつ代替サンプル調製方法を記載しています。
ここでは、一貫性の定性的および定量的な結果と希少な生物学的サンプルからTEMを実行するための効率的なサンプル調製プロトコルを報告しています。エバンスブルー染色は、そうでなければ見えないままであったであろう数が少ない細胞、 すなわち 、万骨髄の造血幹細胞および前駆細胞から小さな細胞ペレットを局在化するために固定した後に行われた、そしてペレットを脱水し、樹脂包埋工程の前に、アガロースに包埋しました。この方法は、一緒に細胞をクラスタ化し、超微細構造と（林として識別- SCA-1 +のc-kit +のFlt3 - CD34 - ; HSC）造血幹細胞の細胞内、組織の効率的な解析が可能、稀0.2から0.5パーセントの細胞集団を骨髄インチこの実験的なプロトコールは、超構造研究を行うのに有用であると多くのまれではあるが非常に重要な集団の定量的な結果を得ることができます。
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Protocol
全ての実験手順は、シンシナティ小児研究財団の機関の動物委員会によって承認されました。 4ヶ月 - この研究のために、造血幹細胞は、2高齢のC57Bl / 6近交系マウスの骨髄から単離しました。リネージュ含む異なる表面メーカーとBMの染色後にFACSを用いて細胞選別、c-キット、SCA-1、のFlt3およびCD34は、LIN-SCA-1 +のc-kit +のFlt3に基づいてHSCの精製に使用した- CD34 -ゲーティング戦略標準プロトコルとして8の前に説明しました。
注意：いくつかの非常に毒性の強い化学薬品は、この手順の間に使用されています。これらは、吸入および皮膚接触によって有毒です。手袋や防護服を着用してください。これらの化学物質での作業中にヒュームフードで働いています。
1.細胞、固定、染色およびプリ埋め込み
- 林を使用してソート万造血幹細胞（ - SCA-1
- スイングアウトバケットと遠心機を用いて1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中で10分間千×gでソートされたHSCをスピンダウン。穏やかな吸引によって培地を除去し、各ステップでチューブに200μlの培地を残します。この段階では、細胞ペレットがチューブで目に見えないまま。
- 1時間1,9、室温（RT）で2倍固定溶液の0.2ミリリットルを追加することにより、細胞を固定。
- 使用前に固定溶液は新鮮なことを確認します。 1Xでは、溶液を、0.1Mカコジル酸緩衝液中の3％パラホルムアルデヒドおよび2.5％グルタルアルデヒドで構成されています。
- 遠心スイングアウトバケットと遠心機を用いて30℃で10分間1,000×gでの細胞。
- 0.1 Mカコジル酸緩衝液の600μlの細胞を洗浄遠心分離を用いて、遠心分離した後、チューブに200μlのバッファーを残します。
- カコジル酸緩衝液中にエバンスブルーを2mg / mlの溶液200μlを添加することによって、固定された細胞を染色し、室温で20分間インキュベートします。細胞は青色に着色されます。
- 遠心分離を用いて、0.1Mカコジル酸緩衝液の600μlの3倍の細胞を洗浄し、チューブ内の各時間を200μlのバッファーを残します。
- 200μlの緩衝液中で細胞を再懸濁し、0.5 mlチューブに細胞懸濁液を転送します。テーブルトップ遠心機を用いて10分間1,000×gで遠心。今目に見える小さな細胞ペレットを乱すことなく静かにバッファを外し、チューブに50μlのバッファーを残します。
- 4％アガロース溶液15 mlのチューブに0.1 Mカコジル酸緩衝液5mlにアガロースを200mgに低融点を追加します。 100ミリリットルのガラス瓶に沸騰したお湯にチューブを転送することによって、アガロースを溶融し、使用するまでぬるま湯続けます。
- アガロース0.1 M cacodylaに溶解し、4％の低融点の200μLを加えますTEバッファー0.5ミリリットルチューブ中の細胞懸濁液に、すぐにテーブルトップ遠心機を用いて30℃で10分間千×gで遠心します。
- 細胞は、遠心分離後の半固体アガロースに0.5ミリリットルチューブの底にペレット化していることを確認した後、すぐにアガロースを固化する20分間、4℃にチューブや氷を移します。このステップは、電子顕微鏡下での細胞の良好なクラスタのこのステップの結果に小さな目に見える細胞ペレットとして、非常に重要です。
- 慎重に27 G針3,10を使用してバッファを含む35ミリメートルのプラスチックシャーレにチューブから細胞ペレットを含む固化したアガロースを転送します。
- メスで2ミリメートル - 約1の1片に細胞ペレットを含む固化したアガロースをトリミング。新しい1.5 mlチューブに細胞ペレットを含有するアガロース片を転送します。
- 遠心分離することなく、ピペットを用いて緩衝液を添加し、除去することによって、0.1Mカコジル酸緩衝液600μlのを使用して3回 - 2を洗います。次のステップのために、細胞ペレットを含むこのアガロース片を使用してください。このステップでは、サンプルは、次のステップに移動する前に、4℃で一晩保存することができます。
2.オスミウム酸染色法、脱水、埋め込み
- ピペットを用いてアガロース含む細胞ペレットに1.5mlチューブからカコジル酸緩衝液を除去します。 1％の四酸化オスミウム（のOsO 4）ヒュームフード内の溶液の1.0ミリリットルを追加し、4℃で1時間インキュベートします。
- 0.1 Mカコジル酸緩衝液の600μlの3回洗浄し、キャップで20mlのガラスシンチレーションバイアルにサンプルを移します。
- 脱水、浸透のためのサンプルを処理し、樹脂への埋め込み（ 例えば 、LX-112）6ウェルプレート中で、以下の溶液の連続変化しています。鉗子を用いて細胞ペレットアガロース片を移動します。
- 室温で15分間、25％エタノールで試料を浸します。
- 室温で15分間、50％エタノールで試料を浸します。
- 75パーセントにサンプルを浸し15分間室温でエタノール。
- 室温で15分間、95％エタノールで試料を浸します。
- 二回、15分間、室温で100％エタノールで試料を浸します。
- エタノール中でサンプルを浸す：樹脂（3：1）室温で30分間。
- エタノール中でサンプルを浸す：樹脂（1：1）、室温で30分間。
- エタノール中でサンプルを浸す：樹脂（1：3）室温での30分間。
- 二回、60分間、室温で純樹脂試料を浸します。
- 慎重にピンセットを用いてピラミッド先端形状のゴム型の底にサンプルを移し、金型を埋めるために、試料の上に、より純粋な樹脂を追加します。樹脂重合のための72時間、60℃でサンプルをインキュベートします。
- ゴム型をねじることによって金型から重合樹脂ピラミッドを削除します。先に7説明したように細胞の小さな黒いクラスタは、重合樹脂ピラミッドに見えるはずです。シアノアクリレートを用いた実装シリンダーに重合樹脂ピラミッドを取り付けます。
- カミソリの刃や超ミクロトームでブロックを搭載した後、ダイヤモンドナイフでピラミッドのブロックをトリム。トップとショート広い台形形状と互いにブロック並列の底部を作成し、均等に傾斜した側面を有します。ピラミッドのこの形状は、連続切片のために役立ちます。
- さらに、ダイヤモンドナイフで細胞ペレットの周りのブロックをトリミングし、細胞ペレットアガロース片の周りのプラスチック部分を削除します。
- ウルトラミクロトームを用いて1μmのセクションをカット。まつげツールと以前に7報告されているように金属ループツールを使用してスライドガラスに水上ボートから1μmのセクションを移動します。乾燥のためのホットプレート（37℃）にスライド移動スライド上の転送部。
- 0.22μmのフィルターを備えたシリンジを使用してセクションへのトルイジンブルー溶液の液滴を加え、3分間インキュベートします。蒸留水およびlでスライドをすすぎますらのセクションでは、乾燥させます。細胞の位置を特定するために光学顕微鏡で確認してください。
- ダイヤモンドナイフを使用して - （100 nmの70）超薄切片をカット。まつげのツールを用いてガラスシャーレに水ボートから200メッシュのグリッド上の3つのセクション - 2を移動します。
- 30分間のセクションを乾燥させるために30℃のホットプレートにセクションを持つグリッドを含むガラスシャーレを転送します。
- 室温で10分間、1％酢酸ウラニルの液滴でグリッドを染色した後、蒸留水ですすぎ6 - 8回。 8回 - レイノルズとのステインは、6を室温で5分間、クエン酸鉛、蒸留水ですすいでください。セクションを乾燥させるために37℃のホットプレートにグリッドを含むガラスシャーレを転送します。
- 80 kVの7で、電子顕微鏡でセクションを分析します。
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Representative Results
セルの数が少ないからTEM分析を行うための試料調製のための効率的かつ一貫性のあるプロトコルが記載されています。エバンスブルーおよび0.5 mlのマイクロ遠心チューブに細胞の移動と定着後の染色は小さな細胞ペレット7を視覚化する助けました。アガロース中の四酸化オスミウムとオスミウム酸染色法は、脱水および埋め込み時に暗い細胞ペレットを容易に検出につながりました。
小さな細胞ペレットを含むブロックから半薄切片は、一緒になった （ 図1A及び1B）を多数の細胞のクラスターが確認されました。超薄切片は、細胞クラスタ領域から切断し、電子顕微鏡（ 図1C）で分析しました。これらの細胞の形態および超構造がよく（ 図1D）保存しました。個々の細胞の電子顕微鏡写真は、細胞内での高詳細を示しました超構造（ 図1E）。また、高倍率（50,000X）の画像がよく保存された構造と、そのようなミトコンドリア（ 図1F）などのサブ細胞小器官の完全性を示しました。
図1： 画像解析の下では光と電子顕微鏡。 （A）光顕微鏡下で厚さ1μmのトルイジンブルー染色切片の代表的な視野の低倍率画像。（B）を1μm厚切片のトルイジンブルー染色した後、クラスタ内の細胞の無傷の形態を示す光学顕微鏡像。 （C）酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した後、電子顕微鏡で観察された細胞クラスタの概要フィールド（D）単LT-HSC電子顕微鏡（E）より高いmagnifHSPCからミトコンドリアの細胞内構造を示すHSCのicationイメージ。（F）より高い倍率画像。スケールバー：A / B、100ミクロン; C、10ミクロン; D、2ミクロン; E / F、500ナノメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この方法では、脱水中に小さな細胞ペレットをローカライズするために埋め込むエバンスブルー染色し、アガロースを用いて樹脂の埋め込みやプロセスを区画することにより、低細胞数のTEM分析を可能にします。重要なことは、それが一緒に細胞塊を維持し、データの定量化のための複数のセルを検査することが望ましい細胞の超構造を保存します。
TEM試験では、細胞の数百万を含む細胞ペレットは、多くの場合、多数のセルからデータを得るために、アガロース/ゼラチンマトリックス中および洗浄、脱水及び浸透のための効率的な埋め込みのために必要とされます。研究者らは、希少なサンプル/低細胞数のTEM分析のためにBSA-ビスアクリルアミド重合樹脂、薄い支持体上の単層の染色、またはサイトスピンで4-6を細胞懸濁液の固定化を採用しています。しかし、それはマトリックス内にあるため、細胞のまばらな分布のTEM下で細胞をローカライズし、カットする退屈な仕事のままであり、拡散と、多くの場合、切片の前に再埋め込みを必要とサイトスピン調製中の細胞間の切断に対する細胞形態の可能な変更、。さらに、単層は11を区画するためにローカライズするために依然として厳しいです。このように、低くても細胞数の希少生物学的サンプルから細胞ペレットは、TEM分析1のためにはるかに簡単です。
この方法は、限られたサンプルからの定性的および定量的な超構造解析の面で以前公開された方法4,5に重要な利点を表しています。一緒に、このプロトコルは、TEMは、定性および定量データ分析を可能にする低細胞数からサンプル処理が容易になりエバンスブルーを使用して、TEM用の細胞ペレットをローカライズするための効率的な方法を説明します。典型的に、TEMのためのサンプル調製が原因サンプル処理Fの複数のステップの、通常光学顕微鏡のために必要とされるものよりも、細胞の多数を必要としますTEMと右の位置1,10に切断するためのセルブロックの正しい向きか。
後固定オスミウム酸染色法は、特に膜およびグリコーゲン粒子のそれらの酢酸ウラニル、タンパク質の比較的非特異的な染色で電子顕微鏡9、さらに支持染色の下で、画像内のより良いコントラストを提供することが知られており、染色クエン酸鉛れます膜、核酸およびグリコーゲン。しかし、オスミウム酸染色法が原因黒ずみを区画し、マトリックス中のサンプル損失の可能性が高いにBSA-BAで事前に埋め込んだ後、懸濁液中の希少な生物学的サンプルを用いて実行することはほとんど不可能です。従って、電子顕微鏡写真の品質は以前の研究4,9で妥協しました。ここオスミウム酸染色法は、アガロースの色の変化が最小限であると細胞ペレットの黒ずみにつながりました。このように、本プロトコルは、TEMイムで良好なコントラストを提供するために、アガロースで事前に埋め込んだ後オスミウム酸染色法を可能にします年齢。
細胞クラスターは、この方法を使用して電子顕微鏡で分析するのは非常に容易でした。エバンスブルーによる前染色は、サブ細胞小器官の細胞の詳細に影響を与えることなく、試料調製中に小さな細胞ペレットをローカライズするのに役立ちました。この方法は、正常、低細胞数からTEM分析を行うための試料調製のための別のアプローチを提供します。 （ - 8ミクロン5）この方法では、TEM分析は、効果的に小型の細胞を用いて行きました。したがって、このアプローチは、容易にそのような線維芽細胞および内皮細胞のような、より大きな細胞のより低い細胞数（〜1,000細胞）で採用することができます。エバンスブルーは、本研究では、サブ細胞小器官の細胞の詳細に影響を及ぼさなかったが、細胞数が少ない免疫金電子顕微鏡用のエバンスブルーの使用がテストされていません。
一緒に、低い細胞数のTEM調査を実行するための試料調製のための効率的な方法が記載されています。 TEMの研究はcriticaを明らかにするために必要とされます細胞の形態と超構造上リットル情報。したがって、超構造情報は、多くの場合、様々な希少な細胞集団に欠落しています。この代替と試料調製のための新規のアプローチは、任意の希少な細胞集団からTEM研究を行うために役立つであろう。さらに、この方法は、セルクラスタの分析から定性的および定量的データを可能にします。電子顕微鏡は、細胞の超構造と組織の卓越した詳細を提供していますように、この方法は、キーが、希少細胞集団上の多くの生物学的プロセスを理解するのに非常に有用であろう。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic Petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
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