Abstract
Transmissie elektronen microscopie (TEM) geeft details van de cellulaire organisatie en ultrastructuur. Echter, TEM analyse van zeldzame celpopulaties, met name cellen in suspensie zoals hematopoietische stamcellen (HSCs) blijft beperkt door de eis van een hoog aantal cellen tijdens de voorbehandeling. Er zijn enkele cytospin of monolaag benaderingen TEM analyse van schaarse monsters, maar deze benaderingen niet significante kwantitatieve gegevens uit het beperkte aantal cellen. Hier wordt een alternatieve en nieuwe benadering voor de monstervoorbereiding in TEM studies beschreven voor zeldzame celpopulaties dat kwantitatieve analyse mogelijk maakt.
Een relatief laag aantal cellen, dat wil zeggen, 10.000 HSCs, werd met succes gebruikt voor TEM analyse werden de miljoenen cellen doorgaans gebruikt voor TEM studies. In het bijzonder werd Evans blauw kleuring uitgevoerd na paraformaldehyde-glutaaraldehyde fixatie (PFA-GA) naar het kleine cel pel visualiserenlaat die gefaciliteerd inbedding in agarose. Clusters van talrijke cellen waargenomen in ultra-dunne secties. De cellen hadden een goed bewaard morfologie en de ultra-structurele details van het Golgi complex en verschillende mitochondriën toegankelijk. Deze efficiënte, eenvoudige en reproduceerbare protocol maakt monstervoorbereiding van geringe aantal cellen en kan worden gebruikt voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van TEM zeldzame celpopulaties van biologische monsters beperkt.
Introduction
Ultra-structurele en suborganel data van cellen zijn voornamelijk aangetoond door transmissie- elektronenmicroscopie (TEM) studies weefsels of celpellets 1,2. Stevige stukjes weefsel kan eenvoudig worden gebruikt voor elektronenmicroscopie studies. Echter, TEM analyse 1,3 op cellen in suspensie blijven uitdagend en vereisen hoge celaantallen, dwz miljoenen cellen. Hierdoor ultra-structurele analyses van zeldzame celpopulaties in suspensie, bijvoorbeeld hematopoietische stamcellen (HSC) worden niet gemakkelijk beoordeeld. Meerdere pogingen voor TEM analyse van schaarse monsters met behulp van cytospin of monolaag benaderingen niet aan belangrijke kwantitatieve gegevens te krijgen van het beperkte aantal cellen. Zo is de eis van een hoog aantal cellen beperkt het gebruik van deze krachtige instrument om de subcellulaire ultrastructurele data van zeldzame celpopulaties begrijpen.
Een belangrijke beperking voor TEM studies met een beperkt aantal van de cels in suspensie is de lokalisatie van de cellen voor verwerking en dus TEM onderzoeken van beperkte cellen met bijzonder kleine afmetingen blijven uitdagend. Verschillende alternatieve benaderingen zijn genomen om deze beperking tegen te gaan: de BSA / bisacrylamide (BSA-BA) gemedieerde polymerisatie van celsuspensie, de kleuring van cellen met een kleurstof ze zichtbaar op een dunne film-ondersteuning, inclusief dekglaasjes te maken, en TEM analyses van cytospinpreparaten 4-6. Echter, was zeer beperkt succes, als zeer weinig cellen werden gevonden in de secties na ultra-snijden. De belangrijkste uitdaging voor het identificeren van schaarse cellen blijft bestaan, omdat de cel monolaag grotendeels onzichtbaar in de gestolde gel voor het snijden blijft. Bovendien kunnen cytospine bereiding van cellen hun cellulaire organisatie veranderen door celspreiding en de kwetsbaarheid van de celstructuur. Vandaar dat deze inherente nadelen rechtvaardigen een nieuwe benadering voor TEM studies uit te voeren vanaf zeldzame celpopulaties met meerconsistentie. Om dit probleem op te lossen, hebben we een nieuwe en alternatieve monstervoorbereiding methode beschreven voor TEM studies zeldzame celpopulaties 7.
Hier melden wij een efficiënte monstervoorbereiding protocol om TEM uit te voeren vanaf schaarse biologische monsters met consistente kwalitatieve en kwantitatieve resultaten. Evans blauw kleuring werd uitgevoerd na bevestiging aan een kleine cel pellet van lage aantal cellen, dat wil zeggen, 10.000 beenmerg hematopoietische stamcellen en stamcellen die anders onzichtbaar zou zijn gebleven lokaliseren, en de pellet werd ingebed in agarose voor uitdroging en hars inbedding processen. Deze methode bundelt de cellen elkaar en maakt een efficiënte analyse van de ultrastructuur en subcellulaire organisatie van hematopoietische stamcellen (aangeduid als Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -, HSC), een zeldzame 0,2-0,5% celpopulatie in het beenmerg. Deze experimentele proprotocol kan nuttig zijn om ultra-structurele studies uit te voeren en de kwantitatieve resultaten op vele zeldzame, maar zeer belangrijke populatie te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de institutionele dier commissie bij Research Foundation de Cincinnati Children's. Voor dit onderzoek werden hematopoietische stamcellen uit het beenmerg van C57BL / 6 inteeltmuizen leeftijd 2-4 maanden. Celsortering middels FACS na kleuring van BM met verschillende oppervlakte makers zoals Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 en CD34 werd gebruikt voor zuivering van HSC op basis Lin- Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating strategie standaard protocol beschreven vóór 8.
LET OP: Een aantal zeer giftige chemicaliën worden gebruikt tijdens deze procedure. Deze zijn giftig bij inademing en contact met de huid. Draag handschoenen en beschermende kleding. Werken in zuurkast tijdens het werken met deze chemicaliën.
1. Cellen, Fixatie, vlekken en pre-inbedding
- Sorteren 10.000 hematopoietische stamcellen (middels Lin - Sca-1
- Spin down gesorteerde HSCs bij 1000 g gedurende 10 min in een 1,5 ml microcentrifugebuis met een centrifuge met swing-out emmers. Verwijder medium door behoedzame aspiratie en laat 200 ul medium in de buizen bij elke stap. In dit stadium de celpellet onzichtbaar blijft in de buis.
- Fixeer de cellen door toevoeging van 0,2 ml 2x fixeeroplossing bij kamertemperatuur (KT) gedurende 1 uur 1,9.
- Maak de fixerende oplossing vers voor gebruik. Bij 1x wordt de oplossing bestaat uit 3% paraformaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaatbuffer.
- Centrifugeer de cellen bij 1000 xg gedurende 10 min bij 30 ° C onder toepassing van een centrifuge met swing-out emmers.
- Was de cellen met 600 pi 0,1 M cacodylaatbuffermiddels centrifugatie en laat 200 pl buffer in de buis na centrifugeren.
- Vlekken op de gefixeerde cellen door toevoeging van 200 ui 2 mg / ml oplossing van Evans Blue in cacodylaatbuffer en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. De cellen zullen blauw gekleurd.
- Was de cellen 3 maal met 600 ui 0,1 M cacodylaatbuffer middels centrifugatie en laat 200 pl buffer in de buis telkens.
- Resuspendeer de cellen in 200 ul buffer en breng de celsuspensie aan een 0,5 ml buis. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min met behulp van een tafelblad centrifuge. Verwijder voorzichtig buffer zonder de nu zichtbaar kleine celpellet en laat 50 pl buffer in de buis.
- Voeg 200 mg laagsmeltende agarose 5 ml 0,1 M cacodylaatbuffer in de 15 ml buis voor een 4% agarose-oplossing. Smelt de agarose door de overdracht van de buis aan kokend water in een 100 ml glazen fles en blijf lauw tot gebruik.
- Voeg 200 ui 4% laagsmeltende agarose opgelost in 0,1 M cacodylaTE-buffer aan de celsuspensie in 0,5 ml buis direct gecentrifugeerd bij 1000 xg gedurende 10 min bij 30 ° C met een tafelblad centrifuge.
- Na bevestiging dat cellen gepelleteerd onderaan de 0,5 ml buis in de halfvaste agarose na centrifugatie geeft de buis 4 ° C of ijs overdragen gedurende 20 min om de agarose stollen. Deze stap is zeer kritisch, als een kleine toegankelijk celpellet in deze stap resulteert in een goede cluster van cellen onder de elektronenmicroscoop.
- Breng voorzichtig de gestolde agarose met de celpellet van de buis naar een 35 mm plastic petrischaal met buffer met behulp van een 27 G naald 3,10.
- Trim de gestolde agarose met de celpellet in een stuk van ongeveer 1-2 mm met een scalpel. Breng de agarose stuk met de celpellet om een nieuwe 1,5 ml buis.
- Was 2-3 maal van 600 gl 0,1 M cacodylaatbuffer door het toevoegen en verwijderen van buffer met een pipet zonder centrifugeren. Gebruik deze agarose stuk waarin de cel pellet voor de volgende stap. Bij deze stap kan het monster worden bewaard bij 4 ° C geïncubeerd alvorens naar de volgende stap.
2. Osmification, Uitdroging, Embedding
- Verwijder de cacodylaatbuffer van 1,5 ml buis met de celpellet met agarose met een pipet. Voeg 1,0 ml van 1% osmiumtetraoxide (OsO 4) oplossing in een zuurkast, en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Was driemaal met 600 ui 0,1 M cacodylaatbuffer en overbrengen van het monster naar een 20 ml glazen scintillatiebuisje met een kap.
- Verwerk de steekproef voor uitdroging, infiltratie en het integreren hars (bijv LX-112) met periodieke veranderingen van de volgende oplossingen in een 6-wells plaat. Verplaats de cel-pellet agarose stuk behulp van een tang.
- Dompel het monster in 25% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Dompel het monster in 50% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Dompel het monster in 75%ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Dompel het monster in 95% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Dompel het monster in 100% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min, tweemaal.
- Dompel het monster in ethanol: resin (3: 1) bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Dompel het monster in ethanol: resin (1: 1) bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Dompel het monster in ethanol: resin (1: 3) bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Dompel het monster in zuivere hars bij kamertemperatuur gedurende 60 min, tweemaal.
- Breng het monster op de bodem van de piramide tip vormige rubber mal met behulp van een tang zorgvuldig en voeg meer pure hars op de top van het monster om de mal te vullen. Incubeer het monster bij 60 ° C gedurende 72 uur voor polymerisatie hars.
- Verwijder de gepolymeriseerde hars piramide van de mallen door het verdraaien van de rubberen mal. Een kleine zwarte cluster van cellen moet zichtbaar zijn in de gepolymeriseerde hars piramide, zoals eerder 7 beschreven. Bevestig de gepolymeriseerde hars piramide op de montage van de cilinder met behulp van cyanoacrylaat.
- Knip het piramideblok met een scheermesje en een diamanten mes na montage het blok op een ultra-microtoom. Voeg een korte brede trapeziumvorm met de bovenkant en de onderkant van het blok evenwijdig aan elkaar en bij gelijkmatig schuine kanten. Deze vorm van de piramide helpt voor seriële snijden.
- Verder, trim het blok rond de cel pellet met de diamant mes en verwijder de plastic delen rond de cel pellet agarose stuk.
- Snijd 1 micrometer secties met behulp van een ultra-microtoom. Verplaats de 1 micrometer secties uit het water boot naar een glasplaatje met behulp van een wimper gereedschap en een metalen lus gereedschap zoals eerder gemeld 7. Transfer secties op objectglaasjes en overdracht objectglaasjes hete plaat (37 ° C) te drogen.
- Een druppeltje toluïdineblauw oplossing van de secties met een spuit met 0,22 urn filter en incubeer gedurende 3 min. Spoel de dia's met gedestilleerd water en let de secties drogen. Controleren met een lichtmicroscoop om de positie van de cellen te identificeren.
- Snijd ultra-dunne secties (70-100 nm) met een diamanten mes. Move 2-3 secties op 200-mesh netten uit het water boot naar een glazen petrischaal met behulp van een wimper tool.
- Breng de glazen petrischaal met netten sectie om een hete plaat bij 30 ° C te drogen secties 30 min.
- Vlekken op de roosters met dalingen van 1% uranylacetaat bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en spoel in gedestilleerd water 6-8 tijden. Vlek met Reynolds loodcitraat bij kamertemperatuur 5 minuten en spoel in gedestilleerd water 6-8 keer. Breng de glazen petrischaal met de roosters een hete plaat bij 37 ° C te drogen secties.
- Analyseer de secties met een elektronenmicroscoop bij 80 kV 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een efficiënte en consistente protocol voor monstervoorbereiding tot TEM analyse van een gering aantal cellen wordt beschreven uit te voeren. Post-fixatie kleuren met Evans blauw en de overdracht van cellen naar een 0,5 ml microcentrifugebuis geholpen visualiseren kleine celpellet 7. Osmification met osmiumtetraoxide in agarose geleid tot een eenvoudige detectie van het donkere celpellet gedurende de dehydratie en inbedding.
Semi-dunne secties van de blokken met daarin een kleine cel pellet bevestigde een cluster van een groot aantal cellen samen (Figuur 1A en 1B). Ultradunne secties werden de cellen geclusterde gebied gesneden en onder elektronenmicroscopie (figuur 1C) geanalyseerd. De morfologie en ultra-structuur van deze cellen waren goed geconserveerd (Figuur 1D). De electronen microscoop van de individuele cel toonde hoge details over de intracellulaireultra-constructies (figuur 1E). Verder is de hoge vergroting (50.000) beelden toonden een goed geconserveerde structuur en de integriteit van subcellulaire organellen, zoals mitochondriën (Figuur 1F).
Figuur 1: Image Analysis Onder Licht en Electron Microscope. (A) laag vergroting van een gebied van een representatieve toluïdine blauw gekleurde coupe van 1 urn dikte onder lichtmicroscoop. Opname van een lichtmicroscoop toont de intacte morfologie van cellen in cluster na toluidine blauwkleuring van 1 urn dik deel (B). (C) Een overzicht gebied van de cluster cellen waargenomen onder elektronenmicroscoop na kleuren met uranylacetaat en loodcitraat. (D) Eén LT-HSC onder elektronenmicroscoop. (E) Hogere magnificatie beeld van HSC tonen subcellulaire structuren. (F) Hogere image vergroting van de mitochondriën van HSPC. Schaal bar: A / B, 100 pm; C, 10 micrometer; D, 2 micrometer; E / F, 500 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode maakt het mogelijk TEM analyse van laag aantal cellen, met behulp van Evans blauwe vlekken en agarose inbedding een kleine cel pellet te lokaliseren tijdens de uitdroging, hars inbedding en snijden processen. Belangrijk stelt zij celgroepen elkaar en behoudt de cel ultra-structuur, hetgeen wenselijk om meerdere cellen voor het kwantificeren van data worden onderzocht.
In TEM onderzoeken, wordt een celpellet met miljoenen cellen vaak vereist voor een efficiënte inbedding in een agarose / gelatine matrix en wassen, dehydratatie en infiltratie gegevens zoveel cellen te verkrijgen. Onderzoekers hebben immobilisatie van de celsuspensie genomen in een BSA-bisacrylamide gepolymeriseerde hars, kleuring van monolagen op een dunne drager of cytospins voor TEM analyse van lage celaantallen / schaars monsters 4-6. Echter blijft het een vervelende baan te lokaliseren en snijd cellen onder de TEM door het schaarse verdeling van de cellen in de matrix eneventuele wijzigingen van de cel morfologie, als gevolg van spreiding en een splitsing tussen de cellen tijdens cytospin voorbereiding die vaak nodig re-embedding voordat snijden. Bovendien is de monolaag blijft een uitdaging om te lokaliseren voor snijden 11. Aldus is een celpellet zelfs schaarse biologische monsters van lage aantal cellen is veel gemakkelijker voor TEM analyse 1.
Deze werkwijze vormt een belangrijk voordeel eerdere gepubliceerde methoden 4,5 in termen van kwalitatieve en kwantitatieve ultra-structurele analyse van monsters beperkt. Samen is dit protocol beschrijft een efficiënte manier om de cel pellets voor TEM gebruik van Evans blauw, waarbij het monster verwerking maakt van lage aantal cellen gemakkelijk voor TEM kwalitatieve en kwantitatieve data-analyse mogelijk te maken te lokaliseren. Typisch is de monstervoorbereiding voor TEM vereist een groter aantal cellen dan gewoonlijk lichtmicroscopie vereist, vanwege de verschillende stappen van verwerking fof TEM en de juiste oriëntatie van de cel blok voor het snijden in de juiste positie 1,10.
Het is bekend dat na fixatie osmification een beter contrast in beelden, met name die van membranen en glycogeen deeltjes onder een elektronenmicroscoop 9 en verdere ondersteuning kleuring met uranyl acetaat, een relatief niet-specifieke kleuring van eiwitten en loodcitraat dat vlekken membranen, nucleïnezuren en glycogeen. Echter, osmification vrijwel onmogelijk kan worden uitgevoerd met schaarse biologische monsters in suspensie na pre-inbedding in BSA-BA vanwege de hoge kans op verlies van monster tijdens het snijden en matrix donkerder. Waardoor de kwaliteit van de elektronen microfoto werd gecompromitteerd in eerdere studies 4,9. Osmification hier tot donker worden van de celpellet met minimale veranderingen in de kleur van de agarose. De onderhavige protocol maakt osmification na pre-inbedding in agarose om goede contrast in TEM im biedenleeftijden.
Celclusters waren vrij eenvoudig te analyseren met elektronenmicroscopie met deze methode. De pre-kleuring met Evans blauwe geholpen om kleine cel pellets tijdens de voorbehandeling te lokaliseren zonder dat sub-cel organel details. Deze methode biedt een alternatieve benadering voor het monster voorbereiding op TEM-analyse met succes uit te voeren vanaf lage cel aantallen. In deze werkwijze werd TEM analyse effectief uitgevoerd cuvetten met een klein formaat (5-8 um). Daarom is deze benadering kan eenvoudig met nog lagere celaantal (~ 1000 cellen) van grotere cellen zoals fibroblasten en endotheelcellen aangenomen. Hoewel Evans blauw had geen invloed suborganel celdetails in deze studie is het gebruik van Evans blauw voor immuno-goud elektronenmicroscopie met lage celaantallen niet getest.
Samen, is een efficiënte methode voor het monster voorbereiding op TEM studies uit te voeren vanuit een laag aantal cellen beschreven. TEM studies zijn nodig om critica onthullenl informatie over de morfologie en de ultra-structuren cellen. Daarom wordt ultra-structurele informatie vaak ontbreekt op verschillende schaarse celpopulaties. Deze alternatieve en nieuwe benadering voor de bereiding van de monsters zal nuttig zijn om TEM studies uit te voeren vanaf elke zeldzame celpopulatie. Bovendien maakt deze werkwijze kwalitatieve en kwantitatieve gegevens van de analyse van celgroepen. Zoals elektronenmicroscopie biedt onovertroffen data van de cel ultra-structuur en organisatie, zal deze werkwijze zeer nuttig voor vele biologische processen belangrijkste begrijpen, maar zelden, celpopulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic Petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D.
- Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
- Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
- Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
- Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
- Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
- Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
- Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
- Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).
