Abstract
संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) सेलुलर संगठन और फैटी की जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, इस तरह hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) के रूप में दुर्लभ सेल आबादी, विशेष रूप से निलंबन में कोशिकाओं के मंदिर विश्लेषण, नमूना तैयार करने के दौरान एक उच्च सेल नंबर की आवश्यकता के कारण सीमित रहता है। वहाँ दुर्लभ नमूनों से मंदिर विश्लेषण के लिए कुछ cytospin या monolayer दृष्टिकोण हैं, लेकिन इन तरीकों कोशिकाओं की सीमित संख्या से महत्वपूर्ण मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने में विफल है। इधर, मंदिर के अध्ययन में नमूना तैयार करने के लिए एक वैकल्पिक और उपन्यास दृष्टिकोण दुर्लभ सेल आबादी है कि मात्रात्मक विश्लेषण में सक्षम बनाता है के लिए वर्णित है।
एक अपेक्षाकृत कम सेल नंबर, यानी, 10,000 एचएससी, सफलतापूर्वक मंदिर विश्लेषण कोशिकाओं को आमतौर पर मंदिर अध्ययन के लिए इस्तेमाल के लाखों लोगों की तुलना के लिए इस्तेमाल किया गया था। विशेष रूप से, इवांस नीले धुंधला paraformaldehyde-glutaraldehyde के बाद किया गया था (पीएफए-जीए) निर्धारण छोटे सेल PEL कल्पना करने के लिएचलो, जो agarose में embedding मदद की। कई कोशिकाओं के समूहों अति पतली वर्गों में मनाया गया। कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से संरक्षित आकृति विज्ञान था, और Golgi जटिल और कई माइटोकॉन्ड्रिया की अल्ट्रा संरचनात्मक विवरण दिखाई दे रहे थे। यह कुशल, आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल एक कम सेल नंबर से नमूना तैयार करने की अनुमति देता है और सीमित जैविक नमूने से दुर्लभ सेल आबादी पर गुणात्मक और मात्रात्मक मंदिर विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
कोशिकाओं की अल्ट्रा संरचनात्मक और उप organelle विवरण मुख्य रूप से संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) ऊतकों या सेल छर्रों 1,2 से अध्ययन से खुलासा किया गया है। ऊतकों की ठोस टुकड़ों को आसानी से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के अध्ययन के लिए उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, मंदिर का विश्लेषण करती है 1,3 निलंबन में कोशिकाओं पर चुनौतीपूर्ण बने हुए हैं और उच्च सेल नंबर, यानी, कोशिकाओं के लाखों लोगों की जरूरत है। इस वजह से, निलंबन में दुर्लभ सेल आबादी के अल्ट्रा संरचनात्मक विश्लेषण, जैसे, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी), आसानी से मूल्यांकन नहीं कर रहे हैं। cytospin या monolayer तरीकों का उपयोग दुर्लभ नमूनों से मंदिर विश्लेषण के लिए कई प्रयासों कोशिकाओं की सीमित संख्या से महत्वपूर्ण मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने में विफल है। इस प्रकार, एक उच्च सेल नंबर की आवश्यकता इस शक्तिशाली उपकरण के उपयोग के दुर्लभ सेल आबादी के subcellular ultrastructural विवरण को समझने के लिए सीमा।
सेल की एक सीमित संख्या के साथ मंदिर अध्ययन के लिए एक प्रमुख सीमानिलंबन में प्रसंस्करण के लिए कोशिकाओं का स्थानीयकरण है और इस प्रकार, विशेष रूप से छोटे आकार के साथ सीमित कोशिकाओं से मंदिर के अध्ययन चुनौतीपूर्ण रहेगा। कई वैकल्पिक तरीकों इस सीमा मुकाबला करने के लिए अपनाया गया है: बीएसए / bisacrylamide (बीएसए बीए) सेल निलंबन की मध्यस्थता polymerization, एक डाई के साथ कोशिकाओं उन्हें coverslips सहित एक पतली फिल्म के समर्थन पर दिखाई बनाने के लिए की धुंधला हो जाना, और मंदिर cytospin तैयारियों 4-6 से विश्लेषण करती है। हालांकि, बहुत सीमित सफलता हासिल की थी, के रूप में बहुत कुछ कोशिकाओं अल्ट्रा सेक्शनिंग के बाद वर्गों में पाए गए। विरल कोशिकाओं की पहचान की प्रमुख चुनौती बनी रहती है क्योंकि सेल monolayer ज्यादातर सेक्शनिंग के लिए जम जेल में अदृश्य रहता है। इसके अलावा, कोशिकाओं के cytospin तैयारी सेल प्रसार और सेल संरचना की कमजोरी के कारण उनके सेलुलर संगठन बदल सकता है। इसलिए, इन निहित कमियों के एक उपन्यास दृष्टिकोण अधिक के साथ दुर्लभ सेल आबादी से मंदिर अध्ययन करने के लिए वारंटस्थिरता। इस समस्या को दूर करने के लिए, हम दुर्लभ सेल आबादी 7 से मंदिर के अध्ययन के लिए एक उपन्यास और वैकल्पिक नमूना तैयार विधि का वर्णन किया है।
यहाँ, हम लगातार गुणात्मक और मात्रात्मक परिणाम के साथ दुर्लभ जैविक नमूने से मंदिर प्रदर्शन करने के लिए एक कुशल नमूना तैयार प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। इवांस नीले धुंधला कम संख्या कोशिकाओं, यानी, 10,000 अस्थि मज्जा hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं है कि अन्यथा अदृश्य बना रहा होगा से एक छोटे से सेल गोली स्थानीय बनाना निर्धारण के बाद किया गया था, और गोली से पहले निर्जलीकरण और राल embedding प्रक्रियाओं agarose में एम्बेडेड था। इस विधि कोशिकाओं को एक साथ समूहों और फैटी और hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की subcellular संगठन (लिन के रूप में पहचान - SCA-1 + C-किट + FLT3 - CD34 -; एचएससी) के कुशल विश्लेषण में सक्षम बनाता है, एक दुर्लभ 0.2 - 0.5% सेल की आबादी अस्थि मज्जा में। इस प्रयोगात्मक समर्थकtocol अल्ट्रा संरचनात्मक अध्ययन करते हैं और कई दुर्लभ लेकिन अत्यधिक महत्वपूर्ण आबादी पर मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
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Protocol
सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं सिनसिनाटी बच्चों के रिसर्च फाउंडेशन में संस्थागत पशु समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। 4 महीने - इस अध्ययन के लिए, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं C57BL / 6 जन्मजात आयु वर्ग के 2 चूहों की अस्थि मज्जा से अलग थे। CD34 - - gating रणनीति सेल वंश, सी-किट, SCA -1 सहित विभिन्न सतह निर्माताओं के साथ बी.एम. का धुंधला के बाद FACS का उपयोग छँटाई, FLT3 और CD34 एचएससी की शुद्धि Lin- Sca -1 + C-किट + FLT3 के आधार पर के लिए इस्तेमाल किया गया था के रूप में मानक प्रोटोकॉल 8 से पहले का वर्णन किया।
चेतावनी: कई अत्यधिक जहरीले रसायनों इस प्रक्रिया के दौरान किया जाता है। ये साँस लेना और त्वचा के संपर्क से विषाक्त कर रहे हैं। कृपया दस्ताने और सुरक्षात्मक कपड़े पहनते हैं। धूआं हुड में काम इन रसायनों के साथ काम करते हुए।
1. कोशिकाओं, फिक्सेशन, धुंधला और पूर्व एम्बेडिंग
- क्रमबद्ध 10,000 hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (लिन का उपयोग कर - SCA-1
- स्विंग बाहर बाल्टी के साथ एक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 10 मिनट के लिए 1,000 XG पर हल एचएससी स्पिन। कोमल आकांक्षा से मध्यम निकालें और हर कदम पर ट्यूबों में 200 μl मध्यम छोड़ दें। इस स्तर पर, सेल गोली ट्यूब में अदृश्य रहता है।
- 1 घंटा 1,9 के लिए कमरे के तापमान (आर टी) में 2x लगानेवाला समाधान के 0.2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें।
- लगानेवाला समाधान उपयोग करने से पहले ताजा बनाओ। 1x पर, समाधान 0.1 एम cacodylate बफर में 3% paraformaldehyde और 2.5% glutaraldehyde के शामिल है।
- अपकेंद्रित्र 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,000 XG पर कोशिकाओं स्विंग बाहर बाल्टी के साथ एक अपकेंद्रित्र का उपयोग कर।
- 0.1 एम cacodylate बफर के 600 μl के साथ कोशिकाओं को धो लेंcentrifugation का उपयोग और centrifugation के बाद ट्यूब में 200 μl बफर छोड़ दें।
- cacodylate बफर में इवांस ब्लू के 2 मिलीग्राम / एमएल समाधान के 200 μl जोड़कर तय कोशिकाओं दाग और आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। कोशिकाओं नीले रंग का हो जाएगा।
- कोशिकाओं centrifugation का उपयोग 0.1 एम cacodylate बफर के 600 μl के साथ 3 बार धोएं और ट्यूब में हर बार 200 μl बफर छोड़ दें।
- 200 μl बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और एक 0.5 मिलीलीटर ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण। एक तालिका के शीर्ष सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर 10 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र। धीरे अब दिखाई छोटे सेल गोली परेशान बिना बफर निकालें, और ट्यूब में 50 μl बफर छोड़ दें।
- 200 मिलीग्राम कम पिघलने एक 4% agarose समाधान के लिए 15 मिलीलीटर ट्यूब में 0.1 एम cacodylate बफर के 5 मिलीलीटर agarose जोड़ें। एक 100 मिलीलीटर कांच की बोतल में उबलते पानी के लिए ट्यूब के हस्तांतरण से agarose पिघला और गुनगुने रखना जब तक इस्तेमाल किया।
- जोड़ें 4% कम पिघलने के 200 μl agarose 0.1 एम cacodyla में भंग0.5 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन और तुरंत ते बफर एक तालिका के शीर्ष सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
- इस बात की पुष्टि है कि कोशिकाओं centrifugation के बाद अर्द्ध ठोस agarose में 0.5 मिलीलीटर ट्यूब के नीचे pelleted के बाद, तुरंत agarose जमना करने के लिए 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूब या बर्फ हस्तांतरण। यह कदम एक बहुत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की एक अच्छी क्लस्टर में इस कदम के परिणामों पर एक छोटा सा दिखाई सेल गोली के रूप में महत्वपूर्ण है।
- ध्यान से एक 27 जी सुई का उपयोग कर 3,10 बफर युक्त एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए ट्यूब से सेल गोली युक्त जम agarose हस्तांतरण।
- एक छुरी के साथ 2 मिमी - लगभग 1 में से एक टुकड़ा में सेल गोली युक्त जम agarose ट्रिम। एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब agarose सेल गोली युक्त टुकड़ा स्थानांतरण।
- उनका कहना है और centrifugation बिना पिपेट का उपयोग बफर हटाने के द्वारा 3 0.1 एम cacodylate बफर के 600 μl का उपयोग करते हुए बार - 2 धो। इस agarose अगले कदम के लिए सेल गोली युक्त टुकड़ा का प्रयोग करें। इस चरण में, नमूना रात भर अगले कदम के लिए जाने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
2. Osmification, निर्जलीकरण, एम्बेडिंग
- सेल गोली agarose युक्त एक पिपेट का उपयोग के साथ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब से cacodylate बफर निकालें। एक धूआं हुड में (Oso 4) समाधान 1% आज़मियम tetraoxide के 1.0 मिलीलीटर जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
- 0.1 एम cacodylate बफर के 600 μl के साथ तीन बार धोएं और एक टोपी के साथ एक 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी के लिए नमूना हस्तांतरण।
- निर्जलीकरण, घुसपैठ के लिए नमूना प्रक्रिया और राल में embedding (जैसे, LX-112) एक 6 अच्छी तरह से थाली में निम्नलिखित समाधान के धारावाहिक बदलाव के साथ। सेल गोली agarose संदंश का उपयोग टुकड़ा ले जाएँ।
- 15 मिनट के लिए आरटी पर 25% इथेनॉल में नमूना विसर्जित कर दिया।
- 15 मिनट के लिए आरटी पर 50% इथेनॉल में नमूना विसर्जित कर दिया।
- 75% में विसर्जित कर दिया नमूना15 मिनट के लिए आरटी पर इथेनॉल।
- 15 मिनट के लिए आरटी पर 95% इथेनॉल में नमूना विसर्जित कर दिया।
- 15 मिनट के लिए आरटी पर 100% इथेनॉल में नमूना विसर्जित कर दिया, दो बार।
- 30 मिनट के लिए आरटी पर इथेनॉल में विसर्जित कर दिया नमूना: राल (1) 3।
- 30 मिनट के लिए आरटी पर इथेनॉल में विसर्जित कर दिया नमूना: राल (1: 1)।
- 30 मिनट के लिए आरटी पर इथेनॉल में विसर्जित कर दिया नमूना: राल (3 में 1)।
- 60 मिनट के लिए आरटी पर शुद्ध राल में नमूना विसर्जित कर दिया, दो बार।
- पिरामिड के आकार का टिप रबर संदंश सावधानी का उपयोग कर मोल्ड के नीचे करने के लिए नमूना हस्तांतरण और नमूना के शीर्ष पर अधिक शुद्ध राल जोड़ने मोल्ड भरने के लिए। राल polymerization के लिए 72 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं।
- रबर मोल्ड घुमा द्वारा नए नए साँचे से polymerized राल पिरामिड निकालें। जैसा कि पहले 7 वर्णित कोशिकाओं के एक छोटे से काले क्लस्टर, polymerized राल पिरामिड में दिखाई जानी चाहिए। बढ़ते सिलेंडर cyanoacrylate के प्रयोग पर polymerized राल पिरामिड संलग्न।
- एक रेजर ब्लेड और एक अति microtome पर ब्लॉक बढ़ते के बाद एक हीरे की चाकू के साथ पिरामिड ब्लॉक ट्रिम। शीर्ष और एक दूसरे के समानांतर ब्लॉक के नीचे के साथ एक छोटी विस्तृत trapezoidal आकार बनाओ, और समान रूप से angled पक्षों के साथ। पिरामिड के आकार इस धारावाहिक सेक्शनिंग के लिए मदद करता है।
- इसके अलावा, हीरे की चाकू के साथ सेल गोली चारों ओर ब्लॉक ट्रिम और सेल गोली agarose टुकड़ा आसपास प्लास्टिक वर्गों को हटा दें।
- एक अल्ट्रा microtome का उपयोग कर 1 माइक्रोन वर्गों में कटौती। एक बरौनी उपकरण और एक धातु पाश उपकरण के रूप में पहले से सूचना दी 7 का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड के लिए पानी नाव से 1 माइक्रोन वर्गों ले जाएँ। स्लाइड और गर्म प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस) सुखाने के लिए करने के लिए स्थानांतरण स्लाइड पर स्थानांतरण वर्गों।
- 0.22 माइक्रोन फिल्टर से लैस है और 3 मिनट के लिए सेते एक सिरिंज का उपयोग वर्गों के लिए toluidine नीले समाधान की एक बूंद जोड़ें। आसुत जल और एल के साथ स्लाइड कुल्लाएट वर्गों सूखी। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ की जाँच कोशिकाओं की स्थिति की पहचान करने के लिए।
- (- 100 एनएम 70) एक हीरे की चाकू का उपयोग अति पतली वर्गों में कटौती। एक बरौनी उपकरण का उपयोग कर एक गिलास पेट्री डिश के लिए पानी नाव से 200 जाली ग्रिड पर 3 वर्गों - 2 ले जाएँ।
- 30 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली करने के लिए वर्गों के साथ ग्रिड युक्त गिलास पेट्री डिश स्थानांतरण 30 मिनट के लिए वर्गों को सुखाने के लिए।
- 10 मिनट के लिए आरटी पर 1% uranyl एसीटेट की बूंदों के साथ ग्रिड के दाग और फिर 6 आसुत पानी में कुल्ला - 8 बार। रेनॉल्ड्स के साथ दाग 5 मिनट के लिए साइट्रेट नेतृत्व, आरटी पर और 6 आसुत पानी में कुल्ला - 8 बार। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली करने के लिए ग्रिड से युक्त गिलास पेट्री डिश स्थानांतरण वर्गों को सुखाने के लिए।
- एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ वर्गों का विश्लेषण, 80 केवी 7 बजे।
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Representative Results
नमूना तैयार करने के लिए एक कुशल और लगातार प्रोटोकॉल मंदिर विश्लेषण से कोशिकाओं की कम संख्या वर्णन किया गया है करने के लिए। इवांस नीले और एक 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब कोशिकाओं के हस्तांतरण के साथ पोस्ट-निर्धारण धुंधला छोटे सेल गोली 7 कल्पना में मदद की। agarose में आज़मियम tetraoxide साथ Osmification निर्जलीकरण और embedding के दौरान अंधेरे सेल गोली का एक आसान का पता लगाने के लिए नेतृत्व किया।
एक छोटे से सेल गोली युक्त ब्लॉक से अर्ध-पतली वर्गों को एक साथ कई कोशिकाओं का एक समूह (चित्रा 1 ए और 1 बी) की पुष्टि की। अल्ट्रा पतली वर्गों सेल क्लस्टर क्षेत्र से कटौती और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 सी) के तहत विश्लेषण किया गया। आकृति विज्ञान और इन कोशिकाओं की अल्ट्रा संरचना अच्छी तरह से संरक्षित किया गया (चित्रा -1)। अलग-अलग सेल के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ intracellular पर उच्च विवरण से पता चलाअल्ट्रा संरचनाओं (चित्रा 1E)। इसके अलावा, उच्च बढ़ाई (50,000X) छवियों को एक अच्छी तरह से संरक्षित संरचना और इस तरह के माइटोकॉन्ड्रिया (चित्रा 1F) के रूप में उप सेलुलर अंगों, की अखंडता को दिखाया।
चित्रा 1: छवि विश्लेषण के तहत प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप। (ए) प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत 1 माइक्रोन मोटाई की एक toluidine नीला दाग खंड के एक प्रतिनिधि क्षेत्र के कम बढ़ाई छवि। (बी) प्रकाश माइक्रोस्कोप 1 माइक्रोन मोटाई खंड के toluidine नीले रंग धुंधला के बाद क्लस्टर में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान बरकरार दिखा छवि। (सी) uranyl एसीटेट के साथ धुंधला हो जाना और साइट्रेट का नेतृत्व करने के बाद इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के नीचे देखा सेल क्लस्टर का अवलोकन क्षेत्र। (डी) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत एक भी LT-एचएससी। (ई) उच्च magnifएचएससी की ication की छवि subcellular संरचनाओं दिखा। (एफ) HSPC से माइटोकॉन्ड्रिया के उच्च बढ़ाई छवि। स्केल पट्टी: ए / बी, 100 माइक्रोन; सी, 10 माइक्रोन; डी, 2 माइक्रोन; ई / एफ, 500 एनएम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस विधि को कम सेल नंबर पर मंदिर विश्लेषण में सक्षम बनाता है, इवांस नीले धुंधला का उपयोग और agarose निर्जलीकरण, राल एम्बेडिंग के दौरान एक छोटे से सेल गोली स्थानीय बनाना embedding और प्रक्रियाओं सेक्शनिंग द्वारा। महत्वपूर्ण बात है, यह सेल समूहों को एक साथ रखता है और सेल अल्ट्रा संरचना है, जो डेटा की मात्रा का ठहराव के लिए कई कोशिकाओं की जांच करने के लिए वांछनीय है बरकरार रखता है।
मंदिर के अध्ययन में, एक सेल कोशिकाओं के लाखों युक्त गोली अक्सर कुशल embedment के लिए एक agarose / जिलेटिन मैट्रिक्स में और washes, निर्जलीकरण और घुसपैठ के लिए कई कोशिकाओं से डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। शोधकर्ताओं ने एक बीएसए bisacrylamide polymerized राल में सेल निलंबन के स्थिरीकरण को गोद लिया है, कम सेल नंबर / दुर्लभ नमूने 4-6 पर मंदिर विश्लेषण के लिए एक पतली समर्थन पर monolayers, या cytospins का धुंधला हो जाना। हालांकि, यह स्थानीय बनाना और मैट्रिक्स के भीतर कोशिकाओं की विरल वितरण की वजह से मंदिर के नीचे कोशिकाओं में कटौती करने के लिए एक कठिन काम रहता है औरसेल आकृति विज्ञान के संभावित परिवर्तन, प्रसार और cytospin तैयारी के दौरान कोशिकाओं है कि अक्सर सेक्शनिंग से पहले फिर से एम्बेडिंग की आवश्यकता के बीच एक दरार की वजह से। इसके अलावा, monolayer 11 सेक्शनिंग के लिए स्थानीय बनाना चुनौती बनी हुई है। इस प्रकार, यहां तक कि कम सेल नंबर की दुर्लभ जैविक नमूने से एक सेल गोली मंदिर विश्लेषण 1 के लिए बहुत आसान है।
इस विधि को सीमित नमूनों से गुणात्मक और मात्रात्मक अल्ट्रा संरचनात्मक विश्लेषण के मामले में पिछले प्रकाशित तरीकों 4,5 करने के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ का प्रतिनिधित्व करता है। साथ में, इस प्रोटोकॉल के मंदिर के लिए सेल छर्रों इवांस नीले, जो आसान कम सेल नंबर से नमूना प्रसंस्करण बनाता मंदिर गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा विश्लेषण सक्षम करने के लिए उपयोग कर स्थानीय बनाना करने के लिए एक कारगर तरीका बताता है। आमतौर पर, मंदिर के लिए नमूना तैयार करने में क्योंकि नमूना प्रसंस्करण च कई कदम की, जो आमतौर पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक है की तुलना में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता हैया मंदिर और सही स्थिति 1,10 पर काटने के लिए सेल ब्लॉक के समुचित उन्मुखीकरण।
यह ज्ञात है कि बाद के निर्धारण osmification झिल्ली और ग्लाइकोजन कणों के उन लोगों के लिए विशेष रूप से एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप 9, और आगे समर्थन धुंधला uranyl एसीटेट, प्रोटीन के लिए एक अपेक्षाकृत गैर विशिष्ट दाग के साथ तहत, छवियों में एक बेहतर विपरीत प्रदान करता है, और साइट्रेट है कि दाग नेतृत्व झिल्ली, न्यूक्लिक एसिड और ग्लाइकोजन। हालांकि, osmification सेक्शनिंग और मैट्रिक्स काला दौरान नमूना नुकसान की उच्च संभावना के कारण बीएसए बीए में पूर्व एम्बेड करने के बाद निलंबन में दुर्लभ जैविक नमूनों के साथ प्रदर्शन करने के लिए लगभग असंभव है। इस प्रकार इलेक्ट्रॉन micrographs की गुणवत्ता में पिछले अध्ययनों 4,9 में समझौता किया था। Osmification यहाँ agarose के रंग में मामूली बदलाव के साथ सेल गोली का काला करने के लिए नेतृत्व किया। इस प्रकार, वर्तमान प्रोटोकॉल क्रम में agarose में पूर्व embedding मंदिर im में अच्छा विपरीत प्रदान करने के बाद osmification की अनुमति देता हैउम्र।
सेल समूहों काफी इस पद्धति का उपयोग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ विश्लेषण करने के लिए आसान थे। इवांस नीले रंग के साथ प्री-धुंधला उप organelle सेल विवरण को प्रभावित किए बिना नमूना तैयार करने के दौरान छोटे सेल छर्रों स्थानीयकरण करने में मदद की। इस विधि के लिए नमूना तैयार करने के लिए सफलतापूर्वक कम सेल नंबर से मंदिर विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है। (- 8 माइक्रोन 5) इस विधि में, मंदिर विश्लेषण प्रभावी रूप से एक छोटे आकार की कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। इस प्रकार, इस दृष्टिकोण आसानी से ऐसे fibroblasts और endothelial कोशिकाओं के रूप में बड़ा कोशिकाओं के भी कम सेल नंबर (~ 1000 कोशिकाओं) के साथ अपनाया जा सकता है। हालांकि इवांस नीले वर्तमान अध्ययन में उप organelle सेल विवरण को प्रभावित नहीं किया, कम सेल नंबर के साथ इम्युनो-सोने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए इवांस नीले रंग का उपयोग परीक्षण नहीं किया गया है।
साथ में, नमूना तैयार करने के लिए एक कारगर तरीका है एक कम सेल नंबर से मंदिर अध्ययन करने के लिए वर्णित है। मंदिर के अध्ययन के महत्वपूर्ण प्रकट करने के लिए आवश्यक हैंआकृति विज्ञान और कोशिकाओं की अल्ट्रा संरचनाओं पर एल जानकारी। इसलिए, अल्ट्रा संरचनात्मक जानकारी अक्सर विभिन्न दुर्लभ सेल आबादी पर याद आ रही है। यह वैकल्पिक और नमूना तैयार करने के लिए उपन्यास दृष्टिकोण किसी भी दुर्लभ सेल की आबादी से मंदिर अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा। इसके अलावा, इस विधि सेल समूहों के विश्लेषण से गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा की अनुमति देता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेल अल्ट्रा संरचना और संगठन के नायाब विवरण प्रदान करता है के रूप में, इस विधि काफी, सेल आबादी कुंजी पर कई जैविक प्रक्रियाओं को समझने के लिए उपयोगी है, लेकिन दुर्लभ हो जाएगा।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic Petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
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