Abstract
microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornece detalhes sobre a organização celular e ultra-estrutura. No entanto, a análise TEM de populações de células raras, especialmente as células em suspensão, tais como células estaminais hematopoiéticas (HSCs), permanece limitada devido à exigência de um elevado número de células durante a preparação da amostra. Há um cytospin ou monocamada algumas abordagens para a análise de MET a partir de amostras escassos, mas estas abordagens não conseguem obter os dados quantitativos significativos do número limitado de células. Aqui, uma abordagem alternativa e inovadora para preparação de amostras em estudos TEM é descrito para populações de células raras que permite a análise quantitativa.
Um número de células relativamente baixa, ou seja, 10.000 HSCs, foi utilizado com sucesso para a análise de TEM em comparação com os milhões de células, tipicamente utilizados para estudos TEM. Em particular, Evans azul coloração foi realizada após paraformaldeído-glutaraldeído (PFA-GA) de fixação para visualizar o pequeno pel celularvamos, o que facilitou a incorporação de agarose. Aglomerados de numerosas células foram observadas em seções ultra-finas. As células tinham uma morfologia bem conservada, e os detalhes de ultra-estruturais das mitocôndrias e vários complexos de Golgi eram visíveis. Este protocolo eficiente, fácil e reprodutível permite a preparação da amostra a partir de um número de células de baixo e pode ser usado para a análise TEM qualitativa e quantitativa sobre as populações de células raras a partir de amostras biológicas limitados.
Introduction
Detalhes ultra-estruturais e sub-organela das células foram revelados principalmente por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) estudos de tecidos ou pellets de células 1,2. peças sólidas de tecidos pode ser facilmente utilizada para estudos de microscopia electrónica. No entanto, análises de MET 1,3 em células em suspensão e necessitam de permanecer desafiador números elevados de células, isto é, milhões de células. Devido a isso, análises de ultra-estruturais das populações de células raras em suspensão, por exemplo, células estaminais hematopoiéticas (HSCs), não são facilmente avaliados. Várias tentativas para análise de TEM de amostras usando escassos cytospin ou monocamada abordagens não conseguem obter os dados quantitativos significativa do número limitado de células. Deste modo, a exigência de um elevado número de células limita a utilização desta ferramenta poderosa para compreender os detalhes ultraestruturais subcelulares de populações de células raras.
Uma limitação fundamental para estudos TEM com um número limitado de célulass em suspensão, é a localização das células para o processamento e, portanto, a partir de estudos TEM células limitadas com tamanhos especialmente pequenos permanecem desafiador. Várias abordagens alternativas foram adotadas para contrariar esta limitação: a BSA / bisacrilamida (BSA-BA) polimerização mediada de suspensão de células, a coloração das células com um corante para torná-los visíveis num suporte de película fina incluindo lamelas, e analisa MET a partir de preparações de Cytospin 4-6. No entanto, o sucesso muito limitado foi alcançado, como muito poucas células foram encontrados nas secções após ultra-seccionamento. O principal desafio de identificar células esparsas persiste porque a monocamada de células permanece praticamente invisível no gel solidificado para seccionamento. Além disso, a preparação Cytospin de células pode alterar a sua organização celular devido ao espalhamento das células e a fragilidade da estrutura celular. Por conseguinte, estes inconvenientes inerentes garante uma nova abordagem para a realização de estudos de MET a partir de populações de células raras com maisconsistência. Para ultrapassar este problema, nós descrevemos um método novo e preparação de amostras alternativa para estudos TEM de populações de células raras 7.
Aqui, descrevemos um protocolo de preparação da amostra eficiente para realizar TEM de amostras biológicas escassos com resultados qualitativos e quantitativos consistentes. O azul de Evans foi realizada a coloração após a fixação de localizar um pequeno agregado de células a partir de células baixo número, ou seja, 10.000 tronco hematopoiéticas da medula óssea e células progenitoras que de outra forma teriam permanecido invisível, e o sedimento foi incorporado em agarose antes de processos de desidratação e de resina de incorporação. Este método agrupa as células em conjunto e permite a análise eficiente da ultra-estrutura e organização subcelular das células estaminais hematopoiéticas (identificado como Lin - Sca-1 + c-kit + Flt3 - CD34 -; HSC), um raro 0,2 - população de células 0,5% na medula óssea. Este pro experimentalprotocolo pode ser útil para realizar estudos ultra-estruturais e obter resultados quantitativos sobre muitas populações raras, mas muito importantes.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê de animais institucional a Fundação de Pesquisa Infantil de Cincinnati. Para este estudo, as células estaminais hematopoiéticas foram isoladas a partir da medula óssea de ratinhos C57BL / 6 com idade consanguínea 2 - 4 meses. Separação de células utilizando FACS após coloração da BM com diferentes fabricantes de superfície, incluindo Linhagem, c-kit, Sca-1, Flt3 e CD34 foi utilizada para a purificação de HSC baseado em Lin Sca-1 + Flt3 c-kit + - estratégia gating - CD34 como protocolo padrão descrito anteriormente 8.
CUIDADO: Vários produtos químicos altamente tóxicos são utilizados durante este procedimento. Estes são tóxico por inalação e contato com a pele. Por favor, use luvas e vestuário de protecção. Trabalhar no exaustor ao trabalhar com esses produtos químicos.
1. células, a fixação, coloração e Pré-incorporação
- Classificar 10.000 células-tronco hematopoéticas (usando Lin - Sca-1
- Girar HSCs ordenadas a 1.000 xg durante 10 min num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, utilizando uma centrífuga com baldes swing-out. Remova o meio por aspiração suave e deixar 200 � de meio nos tubos em cada etapa. Nesta fase, o sedimento celular permanece invisível no tubo.
- Fixar as células por adição de 0,2 ml de solução fixadora 2x à temperatura ambiente (TA) durante 1 h 1,9.
- Faça a solução fixadora fresco antes da utilização. Em 1x, a solução é composta por 3% de paraformaldeído e 2,5% de glutaraldeído em tampão de cacodilato 0,1 M.
- Centrifugar as células a 1000 xg durante 10 min a 30 ° C, utilizando uma centrífuga com baldes swing-out.
- Lavar as células com 600 uL de tampão de 0,1 M de cacodilatousando centrifugação e deixar tampão 200 ul no tubo após centrifugação.
- Corar as células fixadas pela adição de 200 ul de solução de 2 mg / ml de azul de Evans em tampão cacodilato e incubar durante 20 min à TA. As células serão de cor azul.
- Lavar as células 3 vezes com 600 ul de tampão de cacodilato 0,1 M utilizando a centrifugação e deixar tampão 200 ul no tubo de cada vez.
- Re-suspender as células em 200 ul de tampão e transferir a suspensão de células para um tubo de 0,5 ml. Centrifugar a 1.000 xg durante 10 min usando uma centrífuga de bancada. Remover tampão suavemente, sem perturbar o sedimento celular pequena agora visível, e deixar tampão 50 ul no tubo.
- Adicionar 200 mg de baixo ponto de fusão de agarose a 5 ml de tampão de cacodilato 0,1 M no tubo de 15 ml de uma solução de agarose a 4%. Derreter a agarose por transferência do tubo de água fervente em uma garrafa de vidro de 100 ml e manter morno até ser utilizado.
- Adicionar 200 mL de 4% baixo ponto de fusão agarose dissolvido em cacodyla 0,1 Mtampão TE para a suspensão de células em tubos de 0,5 ml e imediatamente centrifugar a 1000 xg durante 10 min a 30 ° C usando uma centrífuga de bancada.
- Depois de confirmar que as células sedimentadas no fundo do tubo de 0,5 ml em agarose semi-sólida após a centrifugação, transferir imediatamente o tubo a 4 ° C ou de gelo durante 20 minutos para solidificar a agarose. Este passo é muito crítica, como um pequeno agregado de células visíveis nesta etapa resulta num bom grupo de células sob o microscópio electrónico.
- Transferir cuidadosamente a agarose solidificada contendo o sedimento de células a partir do tubo de plástico para uma placa de Petri de 35 mm contendo tampão usando uma agulha de 27 G 3,10.
- Aparar a agarose solidificadas contendo o sedimento de células em um pedaço de cerca de 1 - 2 mm com um bisturi. Transferir o pedaço de agarose contendo o sedimento de células para um novo tubo de 1,5 mL.
- Lave 2 - 3 vezes usando 600 ul de tampão de 0,1 M de cacodilato, adicionando e removendo tampão que usa a pipeta sem centrifugação. Use este pedaço de agarose contendo o sedimento de células para o próximo passo. Nesta etapa, a amostra pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite, antes de passar ao passo seguinte.
2. Osmification, desidratação, Embedding
- Remover o tampão de cacodilato a partir do tubo de 1,5 ml com o sedimento celular contendo agarose, utilizando uma pipeta. Adicionar 1,0 ml de 1% de tetróxido de ósmio (OsO4) solução num exaustor de fumos, e incubar durante 1 hora a 4 ° C.
- Lavar três vezes com 600 ul de tampão de cacodilato 0,1 M e transferir a amostra para um frasco de cintilação de 20 ml de vidro com uma tampa.
- Processar a amostra para a desidratação, infiltração e embutir em resina (por exemplo, LX-112) com as mudanças de série dos seguintes soluções em uma placa de 6 bem. Mover a peça de agarose de células-pellet usando uma pinça.
- Imergir a amostra em 25% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min.
- Imergir a amostra em 50% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min.
- Imergir a amostra em 75%etanol à temperatura ambiente durante 15 min.
- Imergir a amostra em 95% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min.
- Imergir a amostra em 100% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min, duas vezes.
- Imergir a amostra em etanol: resina (3: 1) à temperatura ambiente durante 30 min.
- Imergir a amostra em etanol: resina (1: 1) à temperatura ambiente durante 30 min.
- Imergir a amostra em etanol: resina (1: 3) à temperatura ambiente durante 30 min.
- Imergir a amostra de resina pura à temperatura ambiente durante 60 min, duas vezes.
- Transferir a amostra para a parte inferior da ponta em forma de pirâmide do molde de borracha com a pinça e cuidadosamente adicionar mais resina pura no topo da amostra para encher o molde. Incubar a amostra a 60 ° C durante 72 horas, para a polimerização da resina.
- Retirar a pirâmide de resina polimerizada a partir dos moldes, torcendo o molde de borracha. Um pequeno aglomerado negro de células devem ser visíveis na pirâmide resina polimerizada, conforme descrito anteriormente 7. Anexar a pirâmide de resina polimerizada no cilindro de montagem usando cianoacrilato.
- Apare o bloco de pirâmide com uma lâmina de barbear e uma faca de diamante após a montagem do bloco em um ultra-micrótomo. Adicione uma forma trapezoidal de largura curto com a parte superior e a parte inferior do bloco paralelas entre si, e com os lados uniformemente inclinada. Esta forma de pirâmide ajuda para o seccionamento em série.
- Além disso, cortar o bloco em torno do pellet celular com a faca de diamante e remover os perfis de plástico ao redor do pedaço de agarose pellet celular.
- Corte 1 mm seções usando um ultra-micrótomo. Mova os 1 mm seções do barco da água para uma lâmina de vidro usando uma ferramenta de cílios e uma ferramenta alça de metal conforme relatado anteriormente 7. seções de transferência em slides e slides de transferência para a placa de aquecimento (37 ° C) para a secagem.
- Adicionar uma gota de solução de azul de toluidina para as secções, utilizando uma seringa equipada com filtro de 0,22 um e incubar durante 3 min. Lavar as lâminas com água destilada e let as secções secar. Verifique com um microscópio de luz para identificar a posição das células.
- Cortar seções ultra-finas (70 - 100 nm) usando uma faca de diamante. Mova 2 - 3 seções sobre grelhas de 200 malha do barco da água para uma placa de Petri de vidro usando uma ferramenta de cílios.
- Transferir a placa de Petri de vidro contendo grades com secções sobre uma placa quente a 30 ° C para secar secções durante 30 min.
- Corar as grades com gotas de 1% de acetato de uranilo à TA durante 10 min e, em seguida, lavar em água destilada 6 - 8 vezes. Mancha com citrato de chumbo de Reynolds, à TA, durante 5 min e lavar em água destilada 6 - 8 vezes. Transferir a placa de Petri de vidro contendo as grades sobre uma placa quente a 37 ° C para secar secções.
- Analisar as seções com um microscópio eletrônico, a 80 kV 7.
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Representative Results
Um protocolo eficiente e consistente para a preparação da amostra para realizar a análise TEM de baixo número de células é descrito. Coloração pós-fixação com azul de Evans e da transferência de células para um tubo de 0,5 ml de microcentrífuga ajudou a visualizar o pequeno pellet celular 7. Osmification com tetróxido de ósmio em agarose levou a uma detecção fácil do sedimento celular escuro durante a desidratação e a incorporação.
Secções semi-finas dos blocos que contêm um aglomerado de células pequenas confirmou um aglomerado de várias células em conjunto (Figura 1A e 1B). Seções ultra-finas foram cortadas da área do cluster de células e analisado sob microscopia eletrônica (Figura 1C). A morfologia e ultra-estrutura destas células foram bem preservadas (Figura 1D). A micrografia eletrônica de célula individual mostrou alto nível de detalhes sobre o intracelularultra-estruturas (Figura 1E). Além disso, as imagens (50,000X) elevada ampliação, mostraram uma estrutura bem preservados e a integridade de organelos subcelulares, tais como mitocôndrias (Figura 1F).
Figura 1: Análise de Imagem sob a luz e Microscópio Eletrônico. (A) imagem de baixa ampliação uma área representativa de uma secção corada com azul de toluidina de uma m de espessura sob microscópio de luz. Imagem de microscópio de luz que mostra a morfologia das células intactas em conjunto, após coloração com azul de toluidina de uma secção de espessura iM (B). (C) Um campo de visão geral do grupo de células observadas ao microscópio de electrões, após coloração com acetato de uranilo e citrato de chumbo. (D) Um único LT-HSC sob microscópio eletrônico. (E) magnif Superiorimagem icação de HSC mostrando estruturas subcelulares. (F) imagem Maior ampliação de mitocôndrias de HSPC. Barra de escala: de A / B, 100 ^ M; C, 10 ^ M; D, 2? M; E / F, a 500 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este método permite a análise TEM em números de celulares de baixo, usando Evans coloração azul e agarose a incorporação de localizar um pellet de células pequenas durante a desidratação, inclusão em resina e seccionamento processos. É importante notar que mantém agrupamentos de células em conjunto e preserva a ultra-estrutura celular, o que é desejável para examinar várias células para quantificação de dados.
Em estudos TEM, um sedimento celular, contendo milhões de células é muitas vezes necessária para embebimento eficiente em uma matriz de agarose / gelatina e para lavagens, desidratação e infiltração para obter dados a partir de numerosas células. Os investigadores adoptaram imobilização da suspensão de células em uma resina polimerizada BSA-bisacrilamida, coloração de monocamadas sobre um suporte fino, ou citospinas para análise de TEM em baixos números de células / escassos amostras 4-6. No entanto, continua a ser um trabalho entediante para localizar e cortar as células sob a ETM, devido à distribuição escassa das células dentro da matriz epossíveis alterações da morfologia celular, devido à divulgação e uma clivagem entre as células durante a preparação cytospin que muitas vezes necessários reincorporação antes do corte. Além disso, a monocamada continua sendo um desafio para localizar para seccionamento 11. Assim, um agregado de células, mesmo a partir de amostras biológicas escassos do número de células de baixa é muito mais fácil para a análise TEM 1.
Este método representa uma vantagem significativa para os métodos publicados anteriores 4,5 em termos de análise ultra-estrutural qualitativa e quantitativa de amostras limitadas. Juntos, este protocolo descreve uma maneira eficiente para localizar os sedimentos celulares para TEM utilizando azul de Evans, o que torna o processamento de amostras de números de celulares de baixo fáceis para TEM para permitir a análise de dados qualitativos e quantitativos. Tipicamente, a preparação de amostras para TEM requer um maior número de células do que o que é geralmente necessário para a microscopia de luz, por causa dos múltiplos passos de processamento da amostra Fou TEM e orientação correta do bloco de celas para o corte na posição correta 1,10.
Sabe-se que o pós-fixação osmification fornece um melhor contraste nas imagens, particularmente aqueles de membranas e partículas de glicogênio sob um microscópio electrónico de 9, e ainda mais coloração suporte com acetato de uranilo, uma mancha relativamente não específico para as proteínas, e citrato de chumbo que mancha membranas, ácidos nucleicos e glicogénio. No entanto, osmification é quase impossível de realizar com amostras biológicas escassos em suspensão após pré-incorporação em BSA-BA devido à alta probabilidade de perda de amostra durante o corte e escurecimento da matriz. Assim, a qualidade das micrografias electrónicas foi comprometida em estudos anteriores 4,9. Osmification aqui levou ao escurecimento do sedimento celular com uma mudança mínima na cor da agarose. Assim, o presente protocolo permite osmification após pré-incorporação em agarose, de modo a proporcionar um bom contraste em MET imas idades.
grupos de células foram bastante fácil de analisar com microscopia eletrônica utilizando este método. O pré-coloração com azul de Evans ajudou a localizar pequenas pelotas de células durante a preparação da amostra sem afetar sub-organela detalhes celulares. Este método oferece uma abordagem alternativa para a preparação de amostras para realizar com êxito a partir de análise de TEM números celulares baixas. Neste método, a análise TEM foi efectivamente realizada utilizando células de um tamanho pequeno (5-8 um). Assim, esta abordagem pode facilmente ser adoptada com o número de células ainda mais baixa (~ 1.000 células) de células maiores, tais como fibroblastos e as células endoteliais. Apesar de azul de Evans não afetou detalhes celulares sub-organela no presente estudo, o uso de azul de Evans para microscopia eletrônica de imuno-ouro com o número de células baixas não foi testada.
Em conjunto, um método eficiente para a preparação de amostras para realizar estudos de MET a partir de um número de células de baixo está descrito. TEM estudos são necessários para revelar Critical informações sobre a morfologia e as ultra-estruturas de células. Por isso, a informação ultra-estrutural é muitas vezes ausente em várias populações de células escassos. Esta alternativa e nova abordagem para a preparação da amostra será útil para realizar estudos TEM de qualquer população de células raras. Além disso, este método permite que os dados qualitativos e quantitativos da análise de agrupamentos de células. Como microscopia eletrônica oferece detalhes inigualáveis da ultra-estrutura e organização celular, este método vai ser muito útil para compreender muitos processos biológicos na chave, mas raro, populações de células.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic Petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
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