Abstract
Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) содержит подробную информацию о клеточной организации и ультраструктуры. Тем не менее, ПЭМ анализ популяций редких клеток, особенно клеток в суспензии, таких как кроветворные стволовые клетки (ГСК), остается ограниченным из-за требования большого количества клеток при подготовке пробы. Есть несколько цитоспина или однослойные подходы для анализа ПЭМ из дефицитных образцов, но эти подходы не в состоянии получить значительные количественные данные из ограниченного числа клеток. Здесь, альтернативный и новый подход для подготовки проб в исследованиях ТЕМ описан для популяций редких клеток, что дает возможность количественного анализа.
Относительно низкое число клеток, то есть 10000 ГСК, был успешно применен для анализа ПЭМ по сравнению с миллионами клеток , обычно используемых для исследований ПЭМ. В частности, Эванс синий окрашивание проводили после того, как параформальдегид-глутаральдегид (PFA-GA) фиксации визуализировать крошечные ячейки PELпусть, что облегчало вложение в агарозы. наблюдались скопления многочисленных клеток в ультра-тонких срезов. Клетки были хорошо сохранившийся морфологии, и ультра-структурные детали комплекса Гольджи и несколько митохондрий были видны. Это эффективный, простой и воспроизводимый протокол позволяет Пробоподготовка из ряда низких клеток и могут быть использованы для качественного и количественного анализа ПЭМ на редких клеточных популяций из ограниченных биологических образцов.
Introduction
Ультра-структурные и суб-органелл клеток детали были в основном выявлены с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) исследований из тканей или клеточных гранул 1,2. Твердые куски ткани могут быть легко использованы для исследований методами электронной микроскопии. Тем не менее, анализ ТЭМ 1,3 на клетках в суспензии остаются сложными и требуют высокого числа клеток, то есть миллионы клеток. Из - за этого, ультра-структурный анализ популяций редких клеток в суспензии, например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), которые не так легко оценить. Многочисленные попытки анализа ПЭМ из дефицитных образцов с использованием цитоспина или однослойных подходы не в состоянии получить значительные количественные данные, из-за ограниченного количества клеток. Таким образом, требование высоким числом клеток ограничивает использование этого мощного инструмента для понимания субклеточных ультраструктурным детали популяций редких клеток.
Ключевым ограничением для ПЭМ с ограниченным числом клетокs в суспензии является локализация клеток для обработки и, таким образом, ПЭМ исследования из ограниченных ячеек с особо малыми размерами оставаться сложной. Несколько альтернативных подходов были приняты для борьбы с этим ограничение: БСА / бисакриламида (БСА-BA) опосредованного полимеризации клеточной суспензии, окрашивание клеток с красителем, чтобы сделать их видимыми на тонкой пленки поддержки, включая покровные, и ПЭМ анализы из цитоспиновых препаратов 4-6. Тем не менее, весьма ограниченный успех был достигнут, так как очень немногие клетки были обнаружены в секциях после ультра-секционирования. Основная задача идентификации разреженные клеток сохраняется, поскольку клеточный монослой остается в основном невидимым в затвердевшего геля для секционирования. Кроме того, цитоспина подготовка клеток может изменить свою клеточную организацию из-за распространения клеток и хрупкости клеточной структуры. Следовательно, эти недостатки, присущие гарантирует новый подход к выполнению исследований ПЭМ из популяций редких клеток с болееконсистенции. Чтобы преодолеть эту проблему, мы описали новый и способ получения альтернативный образец для исследований ПЭМ из редких клеточных популяций 7.
Здесь мы сообщаем эффективный протокол подготовки образца для выполнения ПЭМ из дефицитных биологических образцов с последовательными качественных и количественных результатов. Эванс синий окрашивание проводили после фиксации , чтобы локализовать крошечное осадок клеток из клеток с низким числом, то есть 10000 костного мозга и гемопоэтических стволовых клеток - предшественников , которые в противном случае остались невидимы, и осадок вкладывается в агарозе до того обезвоживания и смолы внедрения процессов. Этот метод кластеров клетки вместе и позволяет проводить эффективный анализ ультраструктуры и субклеточных организации гемопоэтических стволовых клеток (обозначенном как Lin - Sca-1 + C-Kit + Flt3 - CD34 -; ГСК), редкий 0,2 - 0,5% популяции клеток в костном мозге. Этот экспериментальный протокол может быть полезным для выполнения ультра-структурных исследований и получить количественные результаты на многих редких, но очень важных групп населения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были одобрены институциональном животных комитета при исследовательского фонда Цинциннати детей. Для этого исследования, гемопоэтические стволовые клетки были выделены из костного мозга мышей C57BL / 6 инбредных мышей в возрасте 2 - 4 мес. Сортировки клеток с помощью FACS после окрашивания БМ с различными производителями поверхности , включая Lineage, C-Kit, Sca-1, Flt3 и CD34 использовали для очистки HSC на основе лингвист Sca-1 + с-Kit + Flt3 - CD34 - стробирования стратегии в качестве стандартного протокола описано выше 8.
ВНИМАНИЕ: Некоторые высокотоксичные химикаты используются во время этой процедуры. Они являются токсичными при вдыхании и попадании на кожу. Пожалуйста, носите перчатки и защитную одежду. Работа в вытяжном шкафу при работе с этими химическими веществами.
1. Клетки, Закрепление, Окрашивание и Pre-вложения
- Сортировать 10000 гемопоэтические стволовые клетки ( с использованием Lin - Sca-1
- Спин вниз отсортированные ГСК при 1000 мкг в течение 10 мин в микроцентрифуге пробирку объемом 1,5 мл с использованием центрифуги с откидными ковшами. Удалить среду путем осторожного аспирации и оставить 200 мкл среды в пробирках при каждом шаге. На этой стадии осадок клеток остается невидимой в трубке.
- Зафиксировать клетки, добавляя 0,2 мл 2Х раствора закрепителя при комнатной температуре (КТ) в течение 1 часа 1,9.
- Сделайте раствор закрепителя свежим перед использованием. На 1х, раствор состоит из 3% параформальдегида и 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М какодилатный буфер.
- Центрифуга клеток при 1000 мкг в течение 10 мин при 30 ° С с использованием центрифуги с поворотно-откидной ведрами.
- Вымойте клеток с 600 мкл 0,1 М буфера какодилатномс помощью центрифугирования и оставить 200 мкл буфера в трубке после центрифугирования.
- Пятно фиксированные клетки путем добавления 200 мкл 2 мг / мл раствора синего Эванса в какодилатном буфере и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки будут окрашены в синий цвет.
- Мыть клетки 3 раза с помощью 600 мкл 0,1 М какодилата буфера с помощью центрифугирования и оставить 200 мкл буфера в пробирку каждый раз.
- Повторное приостановить клеток в 200 мкл буфера и передачи клеточной суспензии в 0,5 мл пробирку. Центрифуга при 1000 мкг в течение 10 мин с использованием настольную центрифугу. Удалить буфер осторожно, не нарушая наблюдаемую сейчас крошечные клеточный осадок, и оставьте 50 мкл буфера в пробирку.
- Добавить 200 мг с низкой температурой плавления агарозы в 5 мл 0,1 М какодилатный буфера в 15 мл пробирку для 4% раствора агарозы. Расплавления агарозы путем переноса трубки в кипящей воде в стеклянной бутылке емкостью 100 мл, и держать тепл до использования.
- Добавьте 200 мкл 4% низкой температурой плавления агарозы, растворенного в 0,1 М cacodylaТЕ буфера к суспензии клеток в 0,5 мл пробирку и сразу же центрифугировать при 1000 х г в течение 10 мин при 30 ° С, используя настольную центрифугу.
- После подтверждения того, что клетки осаждали при нижней части 0,5 мл трубки в полутвердой агарозы после центрифугирования, немедленно передать трубку до 4 ° С или лед в течение 20 мин, чтобы закрепить агарозы. Этот шаг является очень критично, как небольшой видимый клеточный осадок на этом этапе приводит к хорошему кластером клеток под электронным микроскопом.
- Аккуратно перенести затвердевшей агарозы , содержащий осадок клеток из трубки до 35 мм пластиковые чашки Петри , содержащие буфер , с использованием 27 г иглы 3,10.
- Обрежьте затвердевшей агарозы, содержащие осадок клеток в одну часть около 1 - 2 мм с помощью скальпеля. Перенести в агарозном кусок, содержащий осадок клеток в новый 1,5 мл трубки.
- Вымойте 2 - 3 раза с помощью 600 мкл 0,1 М какодилатном буфера путем добавления и удаления буфера с помощью пипетки без центрифугирования, Используйте эту агарозном кусок, содержащий осадок клеток для следующего шага. На этом этапе, образец можно хранить при температуре 4 ° С в течение ночи, прежде чем перейти к следующему шагу.
2. Osmification, Обезвоживание, встраивание
- Удалить буфер какодилат из 1,5 мл трубки с Клеточный осадок, содержащий агарозы с помощью пипетки. Добавить 1,0 мл 1% -ного тетраоксида осмия (OSO 4) раствор в вытяжном шкафу, и инкубировать в течение 1 часа при температуре 4 ° С.
- Промыть три раза с 600 мкл 0,1 М какодилатный буфер и переноса образца в стекл нный сцинтилл ционный флакон на 20 мл с крышкой.
- Процесс образец для обезвоживания, инфильтрации и встраивания в смолу (например, LX-112) с последовательными изменениями следующих растворов в 6 - луночного планшета с. Перемещение клеток гранул агарозы кусок с помощью щипцов.
- Погрузить образец в 25% этаноле при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Погрузите образец в 50% этанола при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Погрузите образец в 75%этанол при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Погрузить образец в 95% -ном этаноле при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Погрузить образец в 100% этанола при комнатной температуре в течение 15 мин, дважды.
- Погрузить образец в этаноле: смолы (3: 1) при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Погрузить образец в этаноле: смолу (1: 1) при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Погрузить образец в этаноле: смолу (1: 3) при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Погрузить образец в чистой смолы при комнатной температуре в течение 60 мин, дважды.
- Переноса образца в нижней части пирамиды наконечника в форме резиновую форму тщательно с помощью щипцов и добавьте более чистую смолу на верхней части образца, чтобы заполнить форму. Инкубируйте образца при 60 ° С в течение 72 ч для полимеризации смолы.
- Удалите полимеризованный пирамиду смолы из пресс-форм путем скручивания резиновой пресс-формы. Маленький черный скопление клеток должна быть видна в полимеризованной пирамиды смолы, как описано выше 7. Прикрепите полимеризованный пирамиду смолы на монтажном цилиндре с использованием Цианоакрилат.
- Обрежьте блок пирамиды с бритвенным лезвием и алмазного ножа после установки блока на ультра-микротома. Сделать короткую широкую трапециевидную форму с верхней и нижней части блока параллельно друг другу, и с равномерно наклонные стороны. Такая форма пирамиды помогает для последовательного секционирования.
- Кроме того, обрезать блок вокруг клеточного осадка с алмазным ножом и удалите пластиковые секции вокруг ячейки гранул агарозы кусок.
- Вырезать секции 1 мкм с использованием ультра-микротом. Перемещение секций 1 мкм из воды лодки на предметное стекло , используя инструмент наращивания ресниц и инструмент металлическая петля , как сообщалось ранее 7. секции передачи на слайдах и передачи слайдов к горячей плите (37 ° C) для сушки.
- Добавить каплю раствора толуидиновым синим в секциях с использованием шприца, укомплектованный фильтр 0,22 мкм и инкубировать в течение 3 мин. Промыть слайды с дистиллированной водой и ли др секции сохнуть. Проверка с помощью оптического микроскопа, чтобы определить положение клеток.
- Вырезать ультратонкие срезы (70 - 100 нм) с использованием алмазного ножа. Move 2 - 3 секции по 200 меш сетки из воды лодки в стеклянную чашку Петри с использованием инструмента наращивания ресниц.
- Перенести стеклянную чашку Петри, содержащую сетки с секциями на горячей плите при температуре 30 ° C, чтобы высушить участки в течение 30 мин.
- Пятно сетки с каплями 1% ацетата уранила при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем промыть в дистиллированной воде 6 - 8 раз. Пятно с Рейнольдс цитратом свинца, при комнатной температуре в течение 5 мин и промыть в дистиллированной воде 6 - 8 раз. Перенести стеклянную чашку Петри, содержащую сетки на горячей плите при температуре 37 ° С для сушки секций.
- Анализировать разделы с помощью электронного микроскопа, при 80 кВ 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эффективный и последовательный протокол для подготовки проб для проведения анализа ПЭМ от низкого числа клеток описана. После фиксации окрашивания Эванс синий и передачи клеток в 0,5 мл трубки микроцентрифужных помогла визуализировать крошечные осадок клеток 7. Osmification с тетраоксида осмия в агарозе привело к легкому обнаружению темной клеточного осадка в процессе дегидратации и встраивание.
Semi-шлифы из блоков , содержащих крошечные осадок клеток подтвердили скопление многочисленных ячеек вместе (рис 1А и 1В). Ультратонкие срезы из клеточной кластерные области и проанализированы при электронной микроскопии (рис 1C). Морфология и ультра-структура этих клеток хорошо сохранились (рис 1D). Электронная микрофотография отдельной клетки показали высокие детали на внутриклеточныеультра-структуры (рис. 1д) Кроме того, высокое увеличение () изображения 50000 показал , хорошо сохранившуюся структуру и целостность субклеточных органелл, таких , как митохондрии (рис 1F).
Рисунок 1: Анализ изображений под действием света и электронный микроскоп. (A) Низкий коэффициент увеличения изображения репрезентативного поля толуидиновым синим окрашенного сечения толщиной 1 мкм под световым микроскопом. (B) светового микроскопа изображение , показывающее нетронутыми морфологии клеток в кластере после окрашивания толуидиновым синим толщиной 1 мкм секции. (С) Обзор поля кластера клеток наблюдают под электронным микроскопом после окрашивания уранилацетате и цитратом свинца. (D) Одиночная LT-ГСК под электронным микроскопом. (Е) Высшее magnification образ HSC показывая субклеточных структур. (F) более высокое увеличение изображения митохондрий из HSPC. Шкала бар: A / B, 100 мкм; С, 10 мкм; D, 2 мкм; E / F, 500 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод позволяет проводить анализ ПЭМ на низких числа клеток, с помощью синего Эванса окрашивания и агарозы вложения, чтобы локализовать крошечное клеточный осадок во время дегидратации, смолы и вложении секционирования процессов. Важно то, что он поддерживает кластеры клеток вместе и сохраняет ультраструктуру клетки, что желательно, чтобы исследовать множество ячеек для количественной оценки данных.
В исследованиях на ТЕМ, клеточный осадок, содержащий миллионы клеток часто требуется для эффективной заделки в агарозном / матрице желатина и для стирок, дегидратации и инфильтрации для получения данных из многочисленных ячеек. Исследователи приняли омертвление клеточной суспензии в БСА-бис - акриламида полимеризованной смолы, окрашивание монослоев на тонкой поддержки или cytospins для анализа ПЭМ на низких числа клеток / дефицитные образцов 4-6. Тем не менее, она остается утомительную работу по локализации и вырезать клетки под ТЭМ из-за разреженного распределения клеток в матрице ивозможные изменения морфологии клеток, из-за распространения и в расщеплении между клетками во время цитоспина подготовки, которая часто требуется повторное вложение, прежде чем секционирования. Кроме того, монослой остается сложной локализации для секционирования 11. Таким образом, клеточный осадок даже от дефицитных биологических образцов низкого числа клеток намного проще для анализа ПЭМ 1.
Этот метод представляет собой значительное преимущество по сравнению с предыдущими опубликованными способами 4,5 с точки зрения качественного и количественного ультра-структурного анализа из ограниченных образцов. Вместе, этот протокол описывает эффективный способ локализовать гранул клеток для ТЭМ с использованием синего Эванса, что делает обработку образца с низким числом клеток легких для ТЭМ, чтобы позволить качественный и количественный анализ данных. Как правило, подготовка проб для ПЭМ требует большего количества клеток, чем то, что обычно требуется для световой микроскопии, из-за нескольких этапов обработки образцов Fили TEM и правильной ориентации блока ячейки для резки в правильном положении 1,10.
Известно , что после фиксации osmification обеспечивает лучшую контрастность изображения, особенно мембран и частиц гликоген под электронным микроскопом 9 и дальнейшей поддержки окрашивания уранилацетате, относительно неспецифической пятна для белков, и цитратом свинца , который окрашивает мембраны, нуклеиновые кислоты и гликоген. Тем не менее, osmification практически невозможно выполнить с дефицитных биологических образцов в суспензии после предварительного вложения в БСА-БА из-за высокой вероятности потери образца в процессе секционирования и матрицы потемнения. Таким образом, качество электронных микрофотографий была скомпрометирована в предыдущих исследованиях 4,9. Osmification здесь привело к потемнению гранулы клетки с минимальным изменением цвета агарозы. Таким образом, настоящий протокол позволяет osmification после предварительного встраивания в агарозы для того, чтобы обеспечить хороший контраст в TEM имвозрастов.
Клеточные скопления были довольно легко проанализировать с помощью электронной микроскопии с использованием этого метода. Предварительно окрашивание с синим Эванса помогли локализовать крошечных гранул клеток во время подготовки образца, не затрагивая суб-органеллы детали ячейки. Этот метод предлагает альтернативный подход для подготовки проб для успешного выполнения анализа ПЭМ из недостаточного количества клеток. В этом методе анализа ПЭМ эффективно проводили с использованием клеток небольшого размера (5 - 8 мкм). Таким образом, этот подход может быть легко принят с еще более низким числом клеток (~ 1000 клеток) больших клеток, таких как фибробласты и эндотелиальные клетки. Хотя Эванс синий не влияет на суб-органелл клеток детали в настоящем исследовании, использование Эванса синего для иммуно-золотой электронной микроскопии с низким числом клеток не был проверен.
Вместе эффективный метод для подготовки проб для проведения исследований ПЭМ из ряда низких клеток описана. ПЭМ исследования необходимы для выявления Criticaл информацию о морфологии и ультра-структуры клеток. Следовательно, ультра-структурная информация часто отсутствует на различных популяциях дефицитных клеток. Этот вариант и новый подход для подготовки проб будет полезно проводить исследования ПЭМ из любой редкой популяции клеток. Кроме того, этот метод позволяет качественные и количественные данные анализа клеточных кластеров. Как электронная микроскопия предлагает непревзойденные детали клеточного ультра-структуры и организации, этот метод будет весьма полезным для понимания многих биологических процессов на ключ, но редко, клеточные популяции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic Petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D.
- Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
- Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
- Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
- Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
- Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
- Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
- Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
- Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).
