Summary
Neutrofielen extracellulaire vallen (NET's) zijn netwerken van DNA, histonen en neutrofielen eiwitten. Hoewel een deel van de aangeboren immuunrespons zijn NET betrokken bij autoimmuniteit en trombose. Dit protocol beschrijft een eenvoudige werkwijze voor honden neutrofielen isolatie en kwantificering van netten met een microplaat fluorescentie assay.
Introduction
Er zijn meer dan 70 miljoen honden in de Verenigde Staten alleen al 1. Als gewaardeerde familieleden, deze dieren krijgen vaak cutting edge medische zorg. Net zo omdat ze onze omgeving delen, kunnen honden inzichten in de pathogenese en behandeling van ziekten bij de mens 1 te verstrekken. Echter, of het vertalen ontdekkingen in de menselijke geneeskunde in diergeneeskundige behandeling of vice versa, is het belangrijk om grondig te karakteriseren soorten variaties ook in sterk geconserveerde systemen zoals de aangeboren immuunrespons. Voorbeelden van verschillen tussen de hond en de menselijke aangeboren immuunsysteem onder hoge expressie CD4 bij de hond neutrofielen 2; het ontbreken van een functioneel homoloog van de cytoplasmatische flagelline sensor IPAF bij honden 3 en de expressie van caspase 1/4 hybride carnivoren 4.
Neutrofielen extracellulaire vallen (NET's) zijn een relatief recent ontdekte component van aangeboren immuniteit 5. NET zijn netwerks van DNA, nucleaire en granulaire eiwitten die in reactie op een groot aantal inflammatoire of infectieuze stimuli 6. NET-structuren aangetoond in vele soorten, waaronder kippen 7, vis 8, 9 en weekdieren acoelomates 10, maar er zijn soorten variaties. Bijvoorbeeld, muizen neutrofielen reageren langzamer op NETosis stimuli dan menselijke neutrofielen, en vormen minder diffuus NET 11. Er is een grote hoeveelheid bewijs uit meerdere soorten die netten vangen microben, en nog veel meer controversieel kan rechtstreeks worden betrokken bij het doden van ziekteverwekkers 12,13. Echter, NET componenten ook verbetering van weefselbeschadiging, het bevorderen van trombose en fungeren als autoantigenen 14,15. Het evenwicht tussen de positieve en schadelijke effecten van netten kunnen variëren tussen de verschillende ziekten en verschillende soorten aangeeft dat belangrijk NET zowel de soort en toestand van belang te onderzoeken.
Hier Wijbeschrijven een eenvoudig protocol voor het induceren en het meten van het vrijkomen van NET door honden neutrofielen. Deze methode is vergelijkbaar met die toegepast om neutrofielen 16 isoleren en induceren NETosis in andere soorten, maar omstandigheden zoals agonist concentratie en incubatietijd zijn geoptimaliseerd voor honden neutrofielen. Eenzelfde NET kwantificatie DNA afgifte test is ook beschreven in andere soorten, maar de hier gepresenteerde methode is ook geoptimaliseerd voor honden 8,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd met de ethische toestemming van de Universiteit Institutional Animal Care en gebruik Comite Iowa State.
1. bloedafname
- Trekken 9 ml bloed van een vena, cefale of halsader direct in anticoagulant (bijvoorbeeld ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 1,8 mg K 2 EDTA / ml bloed) vacutainers, of in een injectiespuit met onmiddellijke overbrenging naar EDTA bevattende bloedbuisjes. Schud of invertsuiker de bloedbuisjes voldoende menging van het bloed en anti-coagulant waarborgen.
2. neutrofielen Isolatie
- In een 50 ml conische buis, meng bloed met een gelijk volume steriele kamertemperatuur 3% dextran-500 (bereid in 0,9% steriele zoutoplossing) door voorzichtig omkeren. Laat rechtop gedurende 18-20 minuten bij kamertemperatuur. Breng de strokleurige bovenlaag naar een nieuwe buis tot hij niet meer kan worden verzameld zonder besmetting door de onderste rode laag. De erytrocyten in the originele tube kan worden weggegooid.
- Centrifugeer de supernatant bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Trekken uit en gooi het supernatant. Handmatig resuspendeer de celpellet in 10 ml kamertemperatuur steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Merk op dat vortexen mag niet worden gebruikt om opnieuw te schorten neutrofielen in elk stadium van dit protocol. Handmatig aftappen, in plaats van het gieten uit supernatanten wordt ook aanbevolen in het hele protocol naar cel opbrengst te maximaliseren.
- Voeg 10 ml kamertemperatuur polysucrose en natrium diatrizoaat celscheiding oplossing (bijvoorbeeld Histopaque 1077) naar een 50 ml conische buis. laag voorzichtig de celbevattende oplossing via celscheiding oplossing. Merk op dat het gebruik van mobiele scheiding oplossing die niet heeft op kamertemperatuur kunnen cel opbrengst te verminderen.
- Centrifugeer bij 300 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur met de rem uitgeschakeld.
- Als neutrofielen zijn in de onderste laag van de helling, trekken af en gooi de UPPEr 3 lagen, bestaande uit een bovenlaag van plasma en bloedplaatjes, een smalle witte band van mononucleaire cellen en een heldere laag van de dichtheidsgradiënt medium.
- Om eventuele resterende erytrocyten te lyseren, resuspendeer de neutrofielen pellet in 10 ml water op kamertemperatuur.
- Na 30 sec, herstellen toniciteit door toevoeging van 10 ml van steriele kamertemperatuur 1,8% natriumchloride en meng door voorzichtig omkeren.
- Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Teken van de bovendrijvende en gooi.
- Als de pellet is nog steeds rood, herhaalt u de lysis stap. Indien de pellet wit (of lysis is al twee keer uitgevoerd) voorzichtig resuspendeer cellen in 10 ml steriel PBS.
- Aantal cellen met behulp van een geautomatiseerde teller of een hemocytometer. Typische opbrengsten ten minste 10 6 cellen per ml bloed.
- Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Teken van de bovendrijvende en gooi.
- Resuspendeer cellen om de gewenste concentratie in steriel PBS kamertemperatuur. for de DNA-afgifte test beschreven in hoofdstuk 2, hersuspenderen in 5 x 10 6 cellen per ml.
- Desgewenst overdracht een klein volume van cellen direct of met behulp van een cytocentrifuge een glasplaatje. Sta cellen drogen en vlek met een snelle fixatie en kleuring kit volgens de fabrikanten "instructies. Wanneer neutrofielen isolatie succesvol is geweest bij onderzoek onder de microscoop ten minste 95% van de cellen met kernen moet granulocyten (neutrofielen, basofielen, eosinofielen) met minimale verontreiniging erytrocyten.
3. DNA-afgifte assay
- Het opzetten van de DNA-afgifte test direct na neutrofielen isolement.
- Als cel klonteren aanwezig is op het onderzoek van de voorraad oplossing door het licht microscopie is, passeren de celsuspensie door een steriele 70 urn steriel filter onmiddellijk voor het opzetten van de test.
- Om elke test putje van een steriele 96 well plaat, voeg 5 x 10 4 cellen / putje; agonist en Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI) medium zonder fenolrood en aangevuld met 0,5% door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum tot een uiteindelijk volume van 100-200 gl. Ten minste twee blanco's per agonist waarin de neutrofiel voorraadoplossing wordt vervangen door een gelijk volume PBS. Merk op dat het opzetten van lege putten voor elke agonist is belangrijk bij het uitsluiten van DNA verontreiniging van de agonist of inmenging van de agonist met de fluorescentie-assay.
- Incubeer bij 39 ° C gedurende 30 min in een koolstofdioxide (4%) incubator.
- agonisten voeg op gewenste concentraties en een mobiele ondoordringbare nucleïnezuur kleurstof. Let op de optimale concentratie van cellen ondoordringbare kleurstof variëren tussen de verschillende nucleïnezuur kleurstoffen. Niet-gestimuleerde controles waarin agonisten worden vervangen door een gelijk volume medium moet worden opgenomen in elk experiment.
LET OP: Het is wenselijk om agonisten in soortgelijke volumes kweekmedium verdunnen tot consistente voorwaarden tussen de putten te handhaven. Final goed volumes van 200 &# 181; l zijn met succes gebruikt en als dit wordt veranderd, ook de volumes moeten identiek zijn voor alle omstandigheden blijven. Forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA) (eindconcentratie ≥0.1 uM) of bloedplaatjes activerende factor (PAF) (eindconcentratie uM ≥31) kan worden gebruikt als positieve controles. Agonisten moet worden gemeten ten minste in tweevoud. - Incubeer bij 39 ° C. Meten fluorescentie met behulp van een microplaat lezer na 2 uur of op gewenste tijdstippen. Merk op dat optimale tijdsintervallen zal variëren met agonisten gebruikt.
OPMERKING: golflengte hangt af toegepaste kleurstof. - Aftrekken leeg fluorescentie vóór de berekening van gemiddelde fluorescentie.
- Om een vergelijking tussen individuen en tussen de platen mogelijk maken, berekenen voudige verandering in fluorescentie wordt door het gemiddelde fluorescentie gestimuleerde putten door de gemiddelde fluorescentie van niet-gestimuleerde putjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met dit protocol, moet veel voudige verandering in fluorescentie na stimuleren van neutrofielen met de positieve controles, PMA en PAF zijn. Zoals weergegeven in figuur 1B, stimulering van honden neutrofielen met 31 uM PAF gedurende 1 uur resulteert in een gemiddeld 4,0-voudige toename in fluorescentie in vergelijking met niet-gestimuleerde cellen (traject 2,0-5,8, n = 5 honden) 18. PMA bij 0,1 pM (Figuur 1A) is een langzamere agonist die niet leidt tot een toename in fluorescentie tot 2 uur maar uiteindelijk in eenzelfde voudige toename in fluorescentie (gemiddelde: 3,3, range 1,36-5,4, n = 5 honden) 18. Ondanks de langzamere kinetiek, zijn er voordelen om PMA als positieve controle: het is relatief goedkoop in vergelijking met een hoge concentratie van PAF en is op grote schaal gebruikt in muriene en humane studies.
Fluorescentie van nucleïnezuur kleurstoffen niet sSPECIFIEKE voor NET formatie zal ook optreden als er celdood door andere mechanismen of als reagentia worden verontreinigd met DNA. Zoals getoond in figuur 2, een commercieel preparaat LPS geproduceerd zeer hoge fluorescentie in de afwezigheid van neutrofielen, vermoedelijk als gevolg van verontreiniging met bacterieel DNA. Bevestiging netvorming via andere methoden zoals immunofluorescentie aanbevolen.
Figuur 1: PMA en PAF toename fluorescentie van een cel ondoordringbare nucleïnezuur kleurstof met verschillende kinetiek Neutrofielen werden gestimuleerd met 0,1 uM PMA (A) of 31 pM PAF (B) in aanwezigheid van de cel ondoordringbare nucleïnezuur kleurstof.. Fluorescentie werd gemeten op intervallen van een uur en de voudige verandering in fluorescentie van gestimuleerde cellen vergeleken met niet-gestimuleerde cellen berekend. fluorescentietoenamed aanzienlijk tussen 1 en 2 uur voor PMA (herhaalde metingen one-way ANOVA gevolgd door meerdere t-testen met correctie Bonferroni's, veelvoud aangepaste p = 0,04; fout bars zijn gemiddelde ± standaardafwijking voor 5 personen), maar had al voor PAF plateaued door 1 uur. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Jeffery U, et al Honden cast NETs ook:. Canine neutrofielen extracellulaire vallen in de gezondheidszorg en immuun-gemedieerde hemolytische anemie. Veterinaire Immunologie en Immunopathologie, 168 (3-4), 262-8, doi:. 10.1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Blank putten zijn belangrijk om uit te sluiten DNA verontreiniging of inmenging van de agonist Een commerciële bron van LPS.werd een cellulaire putjes met RPMI toegevoegd. Een grote voudige verandering in fluorescentie in vergelijking met putjes die niet-gestimuleerde neutrofielen suggereert besmetting van de agonist met bacteriële DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De DNA-afgifte assay gepresenteerd een gemakkelijk meetbare test voor extracellulair DNA. De methode werd aangepast van soortgelijke technieken gebruikt om netvorming beoordelen andere soorten, maar centrifugatie snelheden agonist concentraties en incubatietijden zijn gewijzigd volgens de methode te optimaliseren met canine neutrofielen 8,17,18. Soortgelijke aanpassingen kunnen worden aangebracht in de werkwijze voor andere soorten passen. De test is eenvoudig en goedkoop in vergelijking met andere werkwijzen voor het meten NETosis zoals flowcytometrie of beeldanalyse. De werkwijze ook geen antilichamen tegen NET componenten nodig, dus ideaal voor gebruik bij honden waarvoor commercieel geproduceerde, gevalideerde species-reactieve antilichamen zijn vaak niet beschikbaar.
De belangrijkste beperking van de methode is het gebrek aan specificiteit van cel-impermeabele nucleïnezuur kleurstoffen voor netvorming. Deze kleurstoffen voer ook dode en stervende cellen, binden DNA en fluoresceren. Daarom flfluorescentie is niet specifiek voor NET formatie. Het gebruik van andere technieken (bijvoorbeeld immunofluorescentie) parallel met de kwantitatieve assay visueel bevestigen agonisten netvorming induceren dan andere vormen van celdood wordt sterk aanbevolen. De test kan ook eventueel worden gebruikt als een algemene screening assay voor celdood, bijvoorbeeld als middel kwantificeren cytotoxiciteit ex vivo.
Het protocol is eenvoudig, maar er kritische stappen nodig om succes te garanderen. Ten eerste, zoals vermeld in het protocol, overmatig celverlies tijdens neutrofielen isolatie is het belangrijk dat supernatanten met een pipet verwijderd door het omkeren buizen zijn opgesteld in plaats van voorkomen. Ten tweede succes van de assay berust op de niet-gestimuleerde controlecellen nog in een levensvatbare en rusttoestand gedurende de incubatie. Neutrofielen kunnen worden geactiveerd op elk moment tijdens het protocol, dus zorgvuldige aandacht moet worden besteed aan atraumatische bloedafname technique en voorkomen van traumatische behandeling (bijv vortexen) in neutrofiel isolatie. Het is ook belangrijk om te onthouden dat neutrofielen een beperkte levensduur Vertragingen bij het isoleren cellen of het opzetten van de test worden vermeden 19. Indien langdurige incubatie met agonisten wordt getracht moeten levensvatbaarheid van de niet-gestimuleerde cellen in deze periode worden bevestigd.
Zoals getoond in figuur 1, is er aanzienlijke variatie tussen de honden in hun reactie op NET agonisten. Toch moet de test redelijk consistent tussen herhalingen van hetzelfde dier, een intra-assay variatie van 9% op basis van 10 18 dupliceert. Als er grote verschillen tussen de herhalingen, cel klonteren is waarschijnlijk verantwoordelijk. Maatregelen om de cel klonteren te verminderen omvatten het handhaven van cellen in PBS in plaats van een calcium-bevattende buffer voorafgaand aan het opzetten van de DNA-test, het behandelen van cellen voorzichtig in heel isolatie, en het filteren van de cel stocksuspensie voorafgaand aan uitplaten cellen.
Indien deze stappen worden gevolgd, dit protocol maakt kwantificering van netvorming als reactie op een groot aantal experimentele condities en agonisten. Dergelijke studies kunnen ons begrip van de rol van de netten voor honden gezondheid en ziekte te verdiepen. Bijvoorbeeld, deze techniek maakt het mogelijk de vergelijking van NET vrijlating tussen gezonde honden en mensen met immunosuppressieve of auto-immuunziekten waarbij NETosis kan verminderd of versterkt. Als alternatief, in combinatie met andere technieken, zoals immunofluorescentie, kan de test worden gebruikt om nieuwe agonisten teweeg kunnen NETosis en nieuwe remmers van NETosis identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore? Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D.
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
