Summary
pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont des réseaux d'ADN, les histones et les protéines de neutrophiles. Bien qu'une composante de la réponse immunitaire innée, TNE sont impliqués dans l'auto-immunité et de la thrombose. Ce protocole décrit une méthode simple pour l'isolement des cellules neutrophiles canins et la quantification de TNE en utilisant un dosage de fluorescence de microplaque.
Introduction
Il y a plus de 70 millions de chiens de compagnie aux Etats - Unis seuls 1. En tant que membres de la famille d'une valeur, ces animaux reçoivent souvent la fine pointe des soins médicaux. De même , car ils partagent notre environnement, les chiens peuvent fournir des indications sur la pathogenèse et le traitement des maladies humaines 1. Cependant, si la traduction des découvertes pour la médecine humaine dans les traitements vétérinaires ou vice-versa, il est important de caractériser complètement les espèces des variations, même dans des systèmes hautement conservés, tels que la réponse immunitaire innée. Des exemples de différences entre la canine et le système immunitaire inné humain comprennent une forte expression de CD4 sur les neutrophiles de chien 2; l'absence d'un homologue fonctionnel du capteur de flagelline cytoplasmique chez les chiens IPAF 3 et l'expression d'un hybride caspase 4/1 chez les carnivores 4.
Pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont une composante relativement récemment découvert de l' immunité innée 5. TNE sont réseaus de l' ADN, des protéines nucléaires et granulaires libérés en réponse à un large éventail de stimuli inflammatoires ou infectieuses 6. Structures NET comme il a été démontré dans de nombreuses espèces , y compris les poulets, les poissons 7 8, 9 et mollusques acoelomates 10, mais il y a des variations d'espèces. Par exemple, les neutrophiles murins réagissent plus lentement aux stimuli NETosis que les neutrophiles humains, et forment les TNE moins diffuses 11. Il y a un grand nombre de preuves à partir de plusieurs espèces TNE piègent microbes, et plus controversée peut être directement impliqué dans tuer les agents pathogènes 12,13. Cependant, les composants NET augmentent également des dommages aux tissus, favorisent la thrombose et d' agir comme autoantigènes 14,15. L'équilibre entre les effets bénéfiques et néfastes de TNE peuvent varier entre les différentes maladies et d'espèces différentes, ce qui suggère qu'il est important d'étudier les TNE tant dans les espèces et l'état de l'intérêt.
ici, nousdécrire un protocole simple pour induire et mesurer la libération de TNE par les neutrophiles canins. Cette méthode est similaire à celles utilisées pour isoler les 16 neutrophiles et d' induire NETosis chez d' autres espèces, mais les conditions telles que la concentration de l' agoniste et le temps d'incubation ont été optimisés pour les neutrophiles canins. Un essai de libération similaire d'ADN de quantification NET a également été décrit dans d' autres espèces , mais la méthode présentée ici est également optimisé pour les chiens 8,17,18.
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Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées avec la permission éthique du Comité de l'Université institutionnelle soin et l'utilisation des animaux Iowa State.
1. Collecte de sang
- Dessiner 9 ml de sang provenant d' un saphène, la veine céphalique ou jugulaires directement dans l' anticoagulant (par exemple, l' acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 1,8 mg de K 2 EDTA / ml de sang) vacutainers, ou dans une seringue avec un transfert immédiat des tubes de sang contenant de l' EDTA. rouler ou inverser les tubes de sang afin d'assurer un mélange adéquat du sang et l'anti-coagulant avec douceur.
2. neutrophiles Isolation
- Dans un tube conique de 50 ml, mélanger le sang avec un volume égal de la température ambiante, stérile, 3% de dextran-500 (composé dans une solution saline stérile à 0,9%) par inversion douce. Laisser reposer en position verticale pendant 18-20 min à température ambiante. Transférer la couleur paille couche supérieure dans un nouveau tube jusqu'à ce qu'il ne peut plus être collectées sans contamination par la couche inférieure rouge. Les érythrocytes ee tube d'origine peut être jeté.
- Centrifuger le surnageant à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer et jeter le surnageant. Manuellement remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml température ambiante phosphate stérile saline tamponnée (PBS). Notez que tourbillonnement ne doit pas être utilisée pour remettre en suspension les neutrophiles à tout stade de ce protocole. dessin manuellement, plutôt que de verser de surnageants est également recommandé tout au long du protocole pour maximiser le rendement des cellules.
- Ajouter 10 ml d'une solution de séparation de cellule de polysaccharose température ambiante et du diatrizoate de sodium (par exemple Histopaque 1077) dans un tube conique de 50 ml. couche soigneusement la solution contenant des cellules au cours de la solution de séparation de cellules. On notera que en utilisant une solution de séparation de cellules qui n'a pas équilibrée à la température ambiante peut réduire le rendement des cellules.
- Centrifuger à 300 xg pendant 30 min à température ambiante avec le frein off.
- Comme les neutrophiles sont dans la couche la plus basse de la pente, aspirer et éliminer l'upper 3 couches, composé d'une couche supérieure de plasma et de plaquettes, une étroite bande blanche de cellules mononucléaires et une couche claire du milieu de gradient de densité.
- Lyser tous les érythrocytes restants, remettre en suspension le culot de cellules neutrophiles dans 10 ml d'eau à température ambiante.
- Après 30 secondes, rétablir la tonicité en ajoutant 10 ml de la température ambiante de 1,8% de chlorure de sodium stérile et mélanger par inversion douce.
- Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et le jeter.
- Si la pastille est toujours rouge, répéter l'étape de lyse. Si la pastille est blanche (ou si la lyse a déjà été effectuée deux fois), doucement remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS stérile.
- Compter les cellules en utilisant un compteur automatisé ou un hémocytomètre. Les rendements typiques sont d' au moins 10 6 cellules par ml de sang.
- Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et le jeter.
- Remettre en suspension les cellules à la concentration désirée dans la température ambiante de PBS stérile. for le test ADN de libération décrit dans la section 2, resuspendre à 5 x 10 6 cellules par ml.
- Si on le désire, transférer un faible volume de cellules directement ou à l'aide d'une cytocentrifugeuse sur une lame de verre. Laisser les cellules à sécher et les taches en utilisant un kit de fixation et une coloration rapide en fonction de la fabrique 'instructions. Si l'isolement des cellules neutrophiles a été couronnée de succès, lorsqu'il est examiné au microscope au moins 95% des cellules nucléées doit être granulocytes (neutrophiles, éosinophiles, basophiles) avec une contamination minimale érythrocytaire.
3. Essai de libération d'ADN
- Mettre en place le test ADN de libération immédiatement après l'isolement des neutrophiles.
- Si l'agglutination cellulaire est présent sur l'examen de la solution mère par microscopie optique, passer la suspension de cellules à travers un filtre stérile de 70 um stérile immédiatement avant la mise en place du test.
- Pour chaque puits d'essai d'une plaque à 96 puits stérile, ajouter 5 x 10 4 cellules / puits; agoniste et Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI) un milieu sans rouge de phénol et supplémenté avec 0,5% de sérum foetal de veau inactivé par la chaleur à un volume final de 100-200 ul. Inclure au moins deux puits blancs par agoniste dans lequel la solution de neutrophiles de stock est remplacé par un volume égal de PBS. A noter que la mise en place des puits vides pour chaque agoniste est important pour exclure une contamination par l'ADN de l'agoniste ou de l'interférence par l'agoniste avec le dosage par fluorescence.
- Incuber à 39 ° C pendant 30 min dans un dioxyde de carbone (4%) incubateur.
- Ajouter des agonistes à des concentrations désirées et d'un colorant d'acide nucléique cellulaire imperméable. Noter que la concentration optimale de colorant imperméable aux cellules peut varier entre les différents colorants acides nucléiques. témoins non stimulés dans lesquels les agonistes sont remplacés par un volume égal de milieu devraient être inclus dans chaque expérience.
NOTE: Il est souhaitable de diluer les agonistes des volumes similaires de milieu de culture pour maintenir des conditions cohérentes entre les puits. volumes de puits final de 200 &# 181; l ont été utilisés avec succès et si cela est altéré, bien des volumes devrait rester identique pour toutes les conditions. Phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) (concentration finale ≥0.1 uM) ou facteur d'activation plaquettaire (PAF) (concentration finale ≥31 uM) peut être utilisée en tant que témoins positifs. Les agonistes devraient être mesurés au moins en double. - Incuber à 39 ° C. Mesurer la fluorescence en utilisant un lecteur de microplaques après 2 heures ou à des intervalles souhaités. A noter que les intervalles de temps optimaux varieront en fonction des agonistes utilisés.
NOTE: Wavelength dépendra de colorant utilisé. - Soustraire fluorescence vierge avant de calculer la fluorescence moyenne.
- Pour permettre une comparaison entre les individus et entre les plaques, calculer un facteur de variation de la fluorescence en divisant la moyenne de fluorescence des puits stimulés par la fluorescence moyenne des puits non stimulés.
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Representative Results
En utilisant ce protocole, il devrait y avoir un changement de pli fort en fluorescence après stimulation neutrophiles avec les contrôles positifs, PMA et PAF. Comme le montre la figure 1B, la stimulation des neutrophiles canins avec 31 uM PAF pour 1 résultats hr dans une augmentation de 4,0 fois de la fluorescence moyenne par rapport aux cellules non stimulées (plage de 2,0 à 5,8, n = 5 chiens) 18. PMA à 0,1 uM (figure 1A) est un agoniste plus lent qui ne se traduit pas par une augmentation de la fluorescence jusqu'à 2 h , mais produit en fin de compte une augmentation similaire de pliage de la fluorescence (moyenne: 3,3, plage de 1,36 à 5,4, n = 5 chiens) 18. En dépit de sa cinétique plus lente, il y a des avantages à le PMA en tant que témoin positif, il est relativement peu coûteux en comparaison avec des concentrations élevées de PAF et il a été largement utilisé dans les études murines et humaines.
La fluorescence des colorants acides nucléiques ne spécifique pour la formation NET comme il sera également se produire si la mort cellulaire par d'autres mécanismes ou si les réactifs sont contaminés avec de l'ADN. Comme on le voit sur la figure 2, une préparation de LPS produit commercial très forte fluorescence en l'absence de neutrophiles, probablement due à une contamination par de l' ADN bactérien. Confirmant la formation NET par d'autres méthodes telles que l'immunofluorescence est recommandé.
Figure 1: PMA et PAF augmentation de la fluorescence d'un imperméable colorant d'acide nucléique cellulaire avec des cinétiques différentes cellules neutrophiles ont été stimulées avec 0,1 uM de PMA (A) ou 31 uM de PAF (B) en présence du colorant d'acide nucléique cellulaire imperméable.. La fluorescence a été mesurée à intervalles d'une heure et le facteur de variation de la fluorescence des cellules stimulées par rapport aux cellules non stimulées calculées. augmentation de la fluorescenceD de manière significative entre 1 et 2 h pour PMA (mesures répétées ANOVA à une voie suivie par plusieurs tests t avec correction de Bonferroni, p ajusté multiplicité = 0,04; les barres d'erreur sont la moyenne ± erreur standard pour 5 personnes) mais avaient déjà atteint un plateau pour le PAF par 1 h. Ce chiffre a été modifié depuis Jeffery U, et al Chiens Éperviers aussi:. Neutrophiles Canine pièges extracellulaires dans la santé et l' anémie hémolytique auto-immune. Veterinary Immunologie et immunopathologie, 168 (3-4), 262-8, doi:. 10.1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Les puits à blanc sont importants pour éliminer la contamination ou d' interférence ADN par l'agoniste Une source commerciale de LPS.On a ajouté aux puits contenant RPMI acellulaire. Un grand facteur de variation de la fluorescence par rapport aux puits contenant des neutrophiles non stimulées suggère une contamination de l'agoniste avec de l' ADN bactérien. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le test ADN de libération présentée est un test facilement quantifiables pour l'ADN extracellulaire. La méthode a été adaptée à partir des techniques similaires utilisées pour évaluer la formation NET dans d' autres espèces, mais des vitesses de centrifugation, des concentrations agonistes et des temps d'incubation ont été modifiés afin d' optimiser le procédé pour une utilisation avec des neutrophiles canins 8,17,18. Des ajustements similaires pourraient être faits pour adapter la méthode pour les autres espèces. Le dosage est simple et peu coûteux en comparaison avec d'autres méthodes de mesure telles que NETosis cytométrie en flux ou analyse d'image. La méthode ne nécessite pas d'anticorps contre les composants NET, est donc idéal pour une utilisation chez les chiens pour qui produit commercialement, les espèces-réactifs validés anticorps sont souvent indisponibles.
La principale limitation de cette méthode est le manque de spécificité des colorants acides nucléiques imperméable aux cellules pour la formation de NET. Ces colorants entrent également les cellules mortes et mourantes, l'ADN se lient et fluorescence. Par conséquent, fluorescence est pas spécifique pour la formation NET. L' utilisation d'autres techniques (par exemple, immunofluorescence) en parallèle avec l'analyse quantitative pour confirmer visuellement les agonistes induisent la formation NET plutôt que d' autres formes de mort cellulaire est fortement recommandé. Le dosage peut également être potentiellement utilisé comme test de criblage général pour la mort cellulaire, par exemple , comme un moyen de quantifier la cytotoxicité ex vivo.
Le protocole est simple, mais il y a des étapes critiques nécessaires pour assurer le succès. Tout d'abord, comme indiqué dans le protocole, pour éviter une perte excessive de cellules lors de l'isolement des cellules neutrophiles, il est important que les surnageants sont aspirés avec une pipette plutôt que mis au rebut par inversion des tubes. D'autre part, la réussite du test repose sur les cellules témoins non stimulées qui restent dans un état viable et en appui tout au long de l'incubation. Les neutrophiles peuvent être activés à tout moment au cours du protocole d'attention si attentif devrait être accordée à atraumatique collecte de sang technique et en évitant la manipulation traumatique (par exemple, tourbillonnement) lors de l' isolement des neutrophiles. Il est également important de se rappeler que les neutrophiles ont une durée de vie limitée de façon retard dans l' isolement des cellules ou la mise en place du test doit être évité 19. Si une incubation prolongée avec des agonistes est tentée, la viabilité des cellules non stimulées pendant cette période de temps devrait être confirmée.
Comme on le voit sur la figure 1, il existe une variation considérable entre les chiens dans leur réponse à des agonistes NET. Cependant, le dosage doit être raisonnablement uniforme entre les répétitions du même animal, avec une variation intra-dosage de 9% sur la base de 10 duplique 18. S'il y a de grandes variations entre les répétitions, l'agglutination cellulaire est probablement responsable. Mesures visant à réduire l'agglutination des cellules comprennent le maintien des cellules dans PBS plutôt qu'un calcium contenant un tampon avant la mise en place du test d'ADN, le traitement des cellules en douceur tout au long de l'isolement, et en filtrant le stock de cellulessuspension avant étalement des cellules.
Si ces étapes sont suivies, ce protocole permet la quantification de la formation nette en réponse à une large gamme de conditions expérimentales et les agonistes. De telles études peuvent approfondir notre compréhension du rôle des TNE en santé canine et de la maladie. Par exemple, cette technique permet la comparaison de la libération NET entre les chiens en bonne santé et ceux souffrant de maladies auto-immunes ou immunosuppresseurs dans lequel NETosis peut être altérée ou améliorée. En variante, lorsqu'il est combiné avec d'autres techniques telles que l'immunofluorescence, le dosage peut être utilisé pour identifier des agonistes de nouveaux capables d'induire NETosis et de nouveaux inhibiteurs de NETosis.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
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