Summary
trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son redes de ADN, histonas y proteínas de neutrófilos. Aunque un componente de la respuesta inmune innata, redes están implicados en la autoinmunidad y la trombosis. Este protocolo describe un método simple para el aislamiento de neutrófilos canino y cuantificación de los TNE utilizando un ensayo de fluorescencia de microplacas.
Introduction
Hay más de 70 millones de perros en los EE.UU. solamente 1. Como miembros de la familia valorados, estos animales a menudo reciben la atención médica de corte borde. Del mismo modo, ya que comparten nuestro medio ambiente, los perros pueden ayudar a comprender la patogénesis y el tratamiento de las enfermedades humanas 1. Sin embargo, si la traducción de los descubrimientos en la medicina humana en tratamientos veterinarios o viceversa, es importante para caracterizar completamente las variaciones de especies incluso en sistemas altamente conservadas tales como la respuesta inmune innata. Ejemplos de diferencias entre el canino y el sistema inmune innato humano incluyen una alta expresión de CD4 en perros neutrófilos 2; la ausencia de un homólogo funcional del sensor flagelina citoplásmica IPAF en perros 3 y la expresión de un híbrido de la caspasa 1/4 en los carnívoros 4.
Trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son un componente relativamente reciente descubrimiento de la inmunidad innata 5. Las redes son la reds de ADN, las proteínas nucleares y granulares libera en respuesta a una amplia gama de estímulos inflamatorios o infecciosos 6. Estructuras en forma de red se han demostrado en muchas especies incluyendo pollos 7, peces, moluscos 8 9 y 10 acoelomates, pero hay variaciones de especies. Por ejemplo, los neutrófilos murinos responden más lentamente a los estímulos NETosis que los neutrófilos humanos, y forman TNE menos difusas 11. Hay una gran cantidad de evidencia de múltiples especies que las redes atrapan los microbios, y más polémica puede estar directamente involucrados en la eliminación de patógenos 12,13. Sin embargo, los componentes de red también aumentan el daño tisular, promueven la trombosis y actúan como autoantígenos 14,15. El equilibrio entre los efectos beneficiosos y perjudiciales de redes pueden variar entre diferentes enfermedades y las diferentes especies, lo que sugiere que es importante investigar TNE tanto en la especie y condición de interés.
Aquí nosotrosdescribir un protocolo sencillo para inducir y medir la liberación de los TNE por los neutrófilos caninos. Este método es similar a los utilizados para aislar los neutrófilos 16 e inducir NETosis en otras especies, pero las condiciones tales como la concentración de agonista y tiempo de incubación han sido optimizados para los neutrófilos caninos. Un ensayo de liberación de ADN cuantificación NET similares también se ha descrito en otras especies, pero el método que aquí se presenta también está optimizado para perros 8,17,18.
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Protocol
Todos los experimentos se llevaron a cabo con el permiso del Comité de ética de la Universidad Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Estado de Iowa.
1. Recolección de Sangre
- Dibuje 9 ml de sangre de un safena, la vena cefálica o yugular directamente en anticoagulante (por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1,8 mg K 2 EDTA / ml de sangre) vacutainers, o en una jeringa con transferencia inmediata a tubos de sangre que contenían EDTA. rodar suavemente o invertir los tubos de sangre para asegurar una mezcla adecuada de la sangre y anti-coagulante.
2. Aislamiento de neutrófilos
- En un tubo cónico de 50 ml, mezclar la sangre con un volumen igual de la temperatura ambiente estéril 3% de dextrano-500 (hecho en 0,9% de solución salina estéril) por inversión suave. Dejar reposar en posición vertical durante 18-20 minutos a temperatura ambiente. La transferencia de la capa superior de color paja a un tubo fresco hasta que ya no puede ser recogido sin contaminación por la capa roja inferior. Los eritrocitos en THtubo original, e puede ser desechada.
- Centrifugar el sobrenadante a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar y descartar el sobrenadante. Manualmente volver a suspender el sedimento celular en 10 ml de solución salina tamponada temperatura ambiente estéril de fosfato (PBS). Tenga en cuenta que vórtex no se debe utilizar para volver a suspender los neutrófilos en cualquier etapa de este protocolo. dibujo manualmente, en lugar de verter fuera sobrenadantes también se recomienda durante todo el protocolo para maximizar el rendimiento celular.
- Añadir 10 ml de una solución de separación de células polisucrosa temperatura ambiente y diatrizoato de sodio (por ejemplo, Histopaque 1077) a un tubo cónico de 50 ml. capa cuidadosamente la solución que contiene células sobre la solución de separación de células. Tenga en cuenta que la solución de separación celular mediante el cual no se haya equilibrado a temperatura ambiente pueden reducir el rendimiento de la célula.
- Centrifugar a 300 xg durante 30 min a temperatura ambiente con el freno.
- A medida que los neutrófilos se encuentran en la capa más baja de la pendiente, extraer y desechar la upper 3 capas, compuestas de una capa superior de plasma y plaquetas, una banda blanca estrecha de células mononucleares y una capa clara del medio de gradiente de densidad.
- Para lisar los eritrocitos ningún restantes, vuelva a suspender el sedimento de neutrófilos en 10 ml de agua a temperatura ambiente.
- Después de 30 segundos, restaurar la tonicidad mediante la adición de 10 ml de cloruro de sodio 1,8% estéril temperatura ambiente y mezclar suavemente por inversión.
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Trasvasar el sobrenadante y desechar.
- Si la pastilla es todavía roja, repetir la etapa de lisis. Si la pastilla es de color blanco (o si la lisis ya se ha realizado dos veces), suavemente las células volver a suspender en 10 ml de PBS estéril.
- Recuento de células utilizando un contador automatizado o un hemocitómetro. Los rendimientos típicos son al menos 10 6 células por ml de sangre.
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Trasvasar el sobrenadante y desechar.
- células a la concentración deseada en la temperatura ambiente PBS estéril resuspender. for el ensayo de liberación de ADN descrita en la sección 2, se vuelve a suspender en 5 x 10 6 células por ml.
- Si se desea, la transferencia de un pequeño volumen de células directamente o usando una citocentrífuga a un portaobjetos de vidrio. Permiten que las células se sequen y las manchas utilizando un kit de fijación y la tinción rápida de acuerdo con la fabrica 'instrucciones. Si el aislamiento de neutrófilos ha sido exitosa, cuando se examinan bajo el microscopio al menos 95% de las células nucleadas debe ser granulocitos (neutrófilos, basófilos, eosinófilos) con mínima contaminación de eritrocitos.
3. Ensayo de liberación de ADN
- Configurar el ensayo de liberación de ADN inmediatamente después del aislamiento de neutrófilos.
- Si la aglutinación de células está presente en el examen de la solución madre por microscopía de luz, pasar la suspensión celular a través de un filtro estéril de 70 micras estéril inmediatamente antes de establecer el ensayo.
- A cada pocillo de ensayo de una placa estéril 96, añadir 5 x 10 4 células / pocillo; agonista y Memo Roswell Parkrial Institute-1640 (RPMI) medio sin rojo fenol y suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 0,5% para un volumen final de 100 a 200 l. Incluir al menos dos pocillos de blanco por agonista en la que la solución de neutrófilos de stock se sustituye por un volumen igual de PBS. Tenga en cuenta que la creación de pozos en blanco para cada agonista es importante para descartar la contaminación del ADN del agonista o interferencia por parte del agonista con el ensayo de fluorescencia.
- Incubar a 39 ° C durante 30 min en un incubador de dióxido de carbono (4%).
- Añadir agonistas a concentraciones deseadas y un colorante de ácido nucleico impermeable a las células. Tenga en cuenta la concentración óptima de colorante impermeable a las células variará entre diferentes tintes de ácidos nucleicos. controles no estimuladas con agonistas en el que se sustituyen por un volumen igual de medios de comunicación deben ser incluidos en cada experimento.
NOTA: Es deseable diluir agonistas en volúmenes similares de medio de cultivo para mantener condiciones consistentes entre los pozos. así volúmenes finales de 200 y# 181; l se han utilizado con éxito y si esto se altera, así volúmenes debe permanecer idéntica para todas las condiciones. Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (concentración final ≥0.1 M) o factor activador de plaquetas (PAF) (concentración final ≥31 M) se puede utilizar como controles positivos. Agonistas deben medirse al menos por duplicado. - Se incuba a 39 ° C. Medir la fluorescencia usando un lector de microplacas después de 2 horas o a intervalos deseados. Tenga en cuenta que los intervalos de tiempo óptimos variarán con agonistas utilizados.
NOTA: Longitud de onda dependerá de colorante empleada. - Restar la fluorescencia en blanco antes de calcular la fluorescencia media.
- Para permitir la comparación entre los individuos y entre las placas, calcular un factor de cambio en la fluorescencia dividiendo la fluorescencia media de los pocillos estimulados por la fluorescencia media de los pocillos no estimulados.
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Representative Results
Usando este protocolo, debería haber un cambio veces fuerte en la fluorescencia después de la estimulación de los neutrófilos con los controles positivos, PMA y PAF. Como se ilustra en la Figura 1B, la estimulación de los neutrófilos caninos con 31 mM de PAF para 1 hr resultados en un aumento de 4,0 veces en la fluorescencia media en comparación con las células no estimuladas (rango 2,0 a 5,8, n = 5 perros) 18. PMA a 0.1 M (Figura 1A) es un agonista más lenta, que no da lugar a un aumento de fluorescencia hasta las 2 h, pero en última instancia produce un aumento similar veces en la fluorescencia (media: 3,3, rango de 1,36 a 5,4, n = 5 perros) 18. A pesar de sus cinética más lenta, hay ventajas a PMA como control positivo: es relativamente barato en comparación con altas concentraciones de PAF y se ha utilizado ampliamente en murinos y los estudios en humanos.
La fluorescencia de los tintes de ácidos nucleicos no es sESPECÍFICOS para la formación de NET, ya que también se producirá si existe la muerte celular por otros mecanismos o si los reactivos están contaminados con ADN. Como se muestra en la Figura 2, una preparación de LPS comercial producido muy alta de fluorescencia en ausencia de neutrófilos, presumiblemente debido a la contaminación con ADN bacteriano. Se recomienda que confirma la formación de red a través de otros métodos, como la inmunofluorescencia.
Figura 1: PMA y PAF aumento de fluorescencia de un colorante de ácido nucleico impermeable a las células con diferentes cinéticas Los neutrófilos fueron estimulados con 0,1 M PMA (A) o 31 mM PAF (B) en presencia del colorante de ácido nucleico impermeable a las células.. La fluorescencia se midió a intervalos de una hora y el pliegue del cambio en la fluorescencia de las células estimuladas en comparación con células no estimuladas calculados. aumento de fluorescenciad significativamente entre 1 y 2 horas para el PMA (medidas repetidas ANOVA de una vía seguido de múltiples pruebas t con corrección de Bonferroni, multiplicidad ajustado p = 0,04; barras de error son la media ± error estándar para 5 personas), pero ya habían alcanzado una meseta de PAF por 1 hr. Esta cifra ha sido modificado a partir de Jeffery T, et al Perros atarrayas también:. Trampas extracelulares de neutrófilos canina en la salud y la anemia hemolítica inmunomediada. Veterinaria Inmunología e inmunopatología, 168 (3-4), 262-8, doi:. 10.1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los pocillos testigo son importantes para descartar la contaminación de ADN o interferencia por parte del agonista Una fuente comercial de LPS.se añadió a los pocillos acelulares que contienen RPMI. Un gran factor de cambio en la fluorescencia en comparación con los pozos que contienen los neutrófilos no estimulados sugiere la contaminación del agonista con ADN bacteriano. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El ensayo de liberación de ADN presentada es un ensayo fácilmente cuantificables para el ADN extracelular. El método fue adaptado de técnicas similares que se utilizan para evaluar la formación neta de otras especies, pero la velocidad de centrifugación, las concentraciones de agonistas y los tiempos de incubación han sido alterados para optimizar el método para su uso con los neutrófilos caninos 8,17,18. ajustes similares podrían hacerse para adaptar el método para otras especies. El ensayo es sencillo y de bajo costo en comparación con otros métodos para medir NETosis tales como citometría de flujo o análisis de imagen. El método también no requiere anticuerpos contra componentes de red, por lo que es ideal para su uso en perros para quien producido en el comercio, especies reactivas de anticuerpos validados menudo no están disponibles.
La principal limitación de este método es la falta de especificidad de los tintes de ácidos nucleicos de células impermeable para la formación de NET. Estos colorantes también entran en las células muertas y moribundas, el ADN se unen y presentan fluorescencia. Por lo tanto, flfluorescencia no es específico para la formación de NET. Se recomienda el uso de otras técnicas (por ejemplo, inmunofluorescencia) en paralelo con el ensayo cuantitativo para confirmar visualmente agonistas están induciendo la formación de NET en lugar de otras formas de muerte celular. El ensayo puede también, potencialmente, ser utilizado como un ensayo de cribado general para la muerte celular, por ejemplo, como un medio de cuantificar la citotoxicidad ex vivo.
El protocolo es simple, pero hay pasos críticos necesarios para asegurar el éxito. En primer lugar, como se ha indicado en el protocolo, para evitar la pérdida excesiva de células durante el aislamiento de neutrófilos es importante que los sobrenadantes se extraen con una pipeta en lugar de desecharse mediante la inversión de los tubos. En segundo lugar, el éxito del ensayo se basa en las células de control no estimulados restantes en un estado viable y descansando a lo largo de la incubación. Los neutrófilos pueden llegar a ser activado en cualquier momento durante el protocolo de manera cuidadosa atención debe prestarse a la extracción de sangre no traumática technique y evitar la manipulación traumática (por ejemplo, agitación) durante el aislamiento de los neutrófilos. También es importante recordar que los neutrófilos tienen una vida útil limitada por lo que el retraso en el aislamiento de células o la creación de la prueba debe ser evitado 19. Si se intenta la incubación prolongado con agonistas, la viabilidad de las células no estimuladas durante este período de tiempo debe ser confirmada.
Como se muestra en la Figura 1, existe una variación considerable entre los perros en su respuesta a los agonistas de NET. Sin embargo, el ensayo debe ser razonablemente coherentes entre repeticiones del mismo animal, con una variación intra-ensayo del 9% sobre la base de 10 duplica 18. Si hay grandes variaciones entre las réplicas, la aglutinación de células es probable responsable. Medidas para reducir la aglutinación de células incluyen el mantenimiento de las células en PBS en lugar de un tampón que contiene calcio antes de establecer el ensayo de ADN, el tratamiento de las células con suavidad a lo largo aislamiento, y filtrando la población de célulassuspensión antes de placas células.
Si se siguen estos pasos, este protocolo permite la cuantificación de la formación de NET en respuesta a una amplia gama de condiciones experimentales y los agonistas. Tales estudios pueden profundizar nuestra comprensión del papel de las redes en la salud y la enfermedad canina. Por ejemplo, esta técnica permite la comparación de la liberación neta entre perros sanos y aquellos con enfermedades inmunosupresoras o autoinmunes en las que NETosis podría ser alterada o mejorada. Alternativamente, cuando se combina con otras técnicas tales como la inmunofluorescencia, el ensayo se puede utilizar para identificar nuevos agonistas capaces de inducir NETosis y nuevos inhibidores de NETosis.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
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