Summary
न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (जाल) डीएनए, histones और न्युट्रोफिल प्रोटीन का नेटवर्क रहे हैं। सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के एक घटक हालांकि, जाल औतोइम्मुिनित थ्रोम्बोसिस में फंसा रहे हैं। इस प्रोटोकॉल कुत्ते न्युट्रोफिल अलगाव और एक microplate प्रतिदीप्ति परख का उपयोग नेट की मात्रा का ठहराव के लिए एक सरल विधि का वर्णन है।
Introduction
वहाँ अकेले 1 संयुक्त राज्य अमेरिका में 70 लाख से अधिक पालतू कुत्ते हैं। मूल्यवान परिवार के सदस्यों के रूप में, इन जानवरों अक्सर बढ़त चिकित्सा देखभाल काटने प्राप्त करते हैं। समान रूप से, क्योंकि वे हमारे पर्यावरण का हिस्सा है, कुत्तों रोगजनन और मानव रोग 1 के उपचार में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। हालांकि, पशु चिकित्सा उपचार या ठीक इसके विपरीत में मानव चिकित्सा के क्षेत्र में खोजों के अनुवाद चाहे, यह महत्वपूर्ण है अच्छी तरह से इस तरह के सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में प्रजातियों भी अत्यधिक संरक्षित सिस्टम में बदलाव को चिह्नित करने के लिए है। कुत्ते और मानव सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच मतभेद के उदाहरण कुत्ते न्यूट्रोफिल 2 पर उच्च अभिव्यक्ति सीडी 4 शामिल हैं; कुत्तों 3 में cytoplasmic flagellin सेंसर IPAF के एक कार्यात्मक Homolog के अभाव और मांसाहारी 4 में एक कस्पासे 1/4 संकर की अभिव्यक्ति।
न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (जाल) जन्मजात प्रतिरक्षा में 5 की एक अपेक्षाकृत हाल ही में पता चला घटक हैं। जाल नेटवर्क रहे हैंडीएनए, परमाणु और बारीक भड़काऊ या संक्रामक उत्तेजनाओं 6 की एक विस्तृत श्रृंखला के जवाब में जारी प्रोटीन के एस। नेट संरचनाओं की तरह मुर्गियों 7, 8 मछली, घोंघे 9 और 10 acoelomates सहित कई प्रजातियों भर में प्रदर्शन किया गया है, लेकिन वहाँ प्रजातियों बदलाव कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, murine न्यूट्रोफिल मानव न्यूट्रोफिल से NETosis उत्तेजनाओं को अधिक धीरे धीरे जवाब है, और कम फैलाना जाल 11 के रूप में। वहाँ कई प्रजातियों कि जाल रोगाणुओं फंसाने, और अधिक विवादास्पद सीधे रोगजनकों 12,13 हत्या में शामिल किया जा सकता से सबूत की एक बड़ी संस्था है। हालांकि, नेट घटक भी, ऊतकों को नुकसान बढ़ाने घनास्त्रता और अधिनियम को बढ़ावा देने के रूप में autoantigens 14,15। नेट की लाभकारी और हानिकारक प्रभाव के बीच संतुलन विभिन्न रोगों और विभिन्न प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकते हैं, सुझाव है कि यह दोनों प्रजातियों और ब्याज की हालत में नेट की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है।
यहाँ हमउत्प्रेरण और कुत्ते न्यूट्रोफिल द्वारा नेट की रिहाई को मापने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन। इस विधि न्यूट्रोफिल 16 अलग और अन्य प्रजातियों में NETosis प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए इसी तरह की है, लेकिन इस तरह के एगोनिस्ट एकाग्रता और ऊष्मायन समय के रूप में की स्थिति कुत्ते न्यूट्रोफिल के लिए अनुकूलित किया गया है। इसी तरह की एक नेट मात्रा का ठहराव डीएनए रिहाई परख भी अन्य प्रजातियों में वर्णित किया गया है, लेकिन यहां प्रस्तुत विधि भी कुत्तों 8,17,18 के लिए अनुकूलित है।
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Protocol
सभी प्रयोगों आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति से नैतिक अनुमति के साथ प्रदर्शन किया गया।
1. रक्त संग्रह
- सीधे थक्कारोधी में एक saphenous, मस्तक या गले नस से खून की 9 मिलीलीटर ड्रा (जैसे, ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 1.8 मिलीग्राम कश्मीर 2 EDTA / एमएल रक्त) वैक्यूटेनर, या EDTA युक्त रक्त नलियों के लिए तत्काल हस्तांतरण के साथ एक सिरिंज में। धीरे रोल या रक्त नलियों पलटना रक्त और विरोधी कौयगुलांट की पर्याप्त मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए।
2. न्युट्रोफिल अलगाव
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, बाँझ कमरे के तापमान के एक बराबर मात्रा के साथ खून मिश्रण 3% dextran-500 (0.9% बाँझ खारा में बना) कोमल उलटा द्वारा। कमरे के तापमान पर 18-20 मिनट के लिए सीधा खड़ा छोड़ दें। एक ताजा ट्यूब भूसे रंग का ऊपरी परत स्थानांतरण जब तक यह अब कम लाल परत द्वारा संदूषण के बिना एकत्र किया जा सकता है। वें में एरिथ्रोसाइट्सई मूल ट्यूब खारिज किया जा सकता है।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 500 XG पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र। बंद ड्रा और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मैन्युअल 10 मिलीलीटर कमरे के तापमान बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में सेल गोली फिर से निलंबित। ध्यान दें कि vortexing फिर से निलंबित इस प्रोटोकॉल के किसी भी चरण में न्यूट्रोफिल करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। मैन्युअल बजाय supernatants बंद डालने का कार्य भी प्रोटोकॉल भर की सिफारिश की है सेल उपज को अधिकतम करने के लिए की तुलना में बंद ड्राइंग,।
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए एक कमरे के तापमान polysucrose और सोडियम diatrizoate सेल जुदाई समाधान (जैसे, Histopaque 1077) के 10 मिलीलीटर जोड़ें। ध्यान से सेल जुदाई समाधान पर सेल युक्त समाधान परत। ध्यान दें कि का उपयोग करते हुए सेल जुदाई समाधान है जो कमरे के तापमान को equilibrated सेल उपज कम हो सकता है नहीं किया है।
- ब्रेक के साथ बंद कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र।
- न्यूट्रोफिल ढाल की सबसे कम परत में हैं, बंद आकर्षित और uppe त्यागनेआर 3 परतें, प्लाज्मा और प्लेटलेट्स, mononuclear कोशिकाओं के एक संकीर्ण सफेद बैंड और घनत्व ढाल माध्यम की एक स्पष्ट परत की ऊपरी परत की रचना की।
- किसी भी शेष एरिथ्रोसाइट्स lyse करने के लिए कमरे के तापमान पानी की 10 मिलीलीटर में न्यूट्रोफिल गोली फिर से निलंबित।
- 30 सेकंड के बाद, बाँझ कमरे के तापमान में 1.8% सोडियम क्लोराइड के 10 मिलीलीटर जोड़कर सुर, शक्तिप्रदता बहाल करने और कोमल उलटा द्वारा मिश्रण।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला बंद ड्रा और त्यागें।
- गोली अभी भी लाल है, तो सेल कदम दोहराएँ। गोली सफेद है (या अगर सेल पहले ही दो बार प्रदर्शन किया गया है), धीरे कोशिकाओं बाँझ पीबीएस के 10 मिलीलीटर में फिर से निलंबित हैं।
- एक स्वचालित काउंटर या एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। विशिष्ट पैदावार खून की मिलीलीटर प्रति कम से कम 10 6 कोशिकाओं रहे हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला बंद ड्रा और त्यागें।
- बाँझ कमरे के तापमान पीबीएस में वांछित एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को फिर से निलंबित। एफओआर डीएनए रिलीज परख मिलीलीटर प्रति 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं पर धारा 2 में वर्णित है, resuspend।
- अगर वांछित, कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा सीधे हस्तांतरण या एक गिलास स्लाइड के लिए एक cytocentrifuge का उपयोग कर। कोशिकाओं को सुखाने के लिए और 'निर्देश विनिर्माण के अनुसार एक तेजी से निर्धारण और धुंधला किट का उपयोग दाग की अनुमति दें। न्युट्रोफिल अलगाव, सफल जब माइक्रोस्कोप के तहत जांच की गई है, तो केन्द्रक की कोशिकाओं के कम से कम 95% granulocytes (न्यूट्रोफिल, basophils, eosinophils) कम से कम एरिथ्रोसाइट संदूषण के साथ होना चाहिए।
3. डीएनए रिलीज परख
- न्युट्रोफिल अलगाव के बाद तुरंत डीएनए रिलीज परख सेट करें।
- अगर सेल clumping प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा शेयर समाधान की परीक्षा पर मौजूद है, तुरंत परख की स्थापना से पहले एक बाँझ 70 माइक्रोन बाँझ फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन से गुजरती हैं।
- एक बाँझ 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक परीक्षा में अच्छी तरह से करने के लिए, 5 एक्स 10 4 में अच्छी तरह से कोशिकाओं / जोड़; एगोनिस्ट और रोसवेल पार्क ज्ञापनरियाल संस्थान-1640 (RPMI) फिनोल लाल और 100-200 μl के अंतिम मात्रा 0.5% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक बिना मध्यम। जिसमें न्यूट्रोफिल शेयर समाधान पीबीएस के एक बराबर मात्रा की जगह है एगोनिस्ट प्रति कम से कम दो खाली कुओं को शामिल करें। ध्यान दें कि प्रत्येक एगोनिस्ट के लिए खाली कुओं की स्थापना प्रतिदीप्ति परख के साथ एगोनिस्ट द्वारा एगोनिस्ट या हस्तक्षेप के डीएनए संदूषण बाहर सत्तारूढ़ में महत्वपूर्ण है।
- एक कार्बन डाइऑक्साइड (4%) इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए 39 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- वांछित सांद्रता और एक सेल अभेद्य न्यूक्लिक एसिड डाई पर एगोनिस्ट जोड़ें। सेल अभेद्य डाई का इष्टतम एकाग्रता नोट अलग न्यूक्लिक एसिड रंगों के बीच अलग अलग होंगे। गैर उत्तेजित नियंत्रण जिसमें एगोनिस्ट मीडिया के एक बराबर मात्रा द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे प्रत्येक प्रयोग में शामिल किया जाना चाहिए।
नोट: यह संस्कृति के माध्यम से समान मात्रा में एगोनिस्ट को कमजोर करने के कुओं के बीच लगातार की स्थिति बनाए रखने के लिए वांछनीय है। 200 के अंतिम अच्छी तरह से की मात्रा और# 181; एल सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है और अगर यह बदल रहा है, अच्छी तरह से मात्रा में सभी स्थितियों के लिए समान रहना चाहिए। Phorbol-12-myristate-13-एसीटेट (पीएमए) (अंतिम एकाग्रता ≥0.1 माइक्रोन) के या प्लेटलेट सक्रिय कारक (पीएएफ) (अंतिम एकाग्रता ≥31 माइक्रोन) के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। Agonists दो प्रतियों में कम से कम मापा जाना चाहिए। - 39 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। प्रतिदीप्ति माप 2 घंटे के बाद या वांछित अंतराल पर एक microplate रीडर का उपयोग कर। ध्यान दें कि इष्टतम समय अंतराल इस्तेमाल किया एगोनिस्ट के साथ अलग अलग होंगे।
नोट: वेवलेंथ कार्यरत डाई पर निर्भर करेगा। - मतलब प्रतिदीप्ति की गणना से पहले खाली प्रतिदीप्ति घटाएँ।
- व्यक्तियों के बीच और प्लेटों के बीच तुलना करने के लिए, गैर उत्तेजित कुओं का मतलब प्रतिदीप्ति से प्रेरित कुओं का मतलब प्रतिदीप्ति विभाजित करके प्रतिदीप्ति में एक गुना परिवर्तन की गणना।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, वहाँ सकारात्मक नियंत्रण, पीएमए और पीएएफ के साथ न्यूट्रोफिल उत्तेजक बाद प्रतिदीप्ति में एक मजबूत गुना परिवर्तन होना चाहिए। प्रतिदीप्ति में एक मतलब 4.0 गुना वृद्धि में 1 घंटा परिणाम 31 माइक्रोन के पीएएफ के साथ चित्रा 1 बी, कुत्ते न्यूट्रोफिल की उत्तेजना में सचित्र के रूप में गैर-प्रेरित कोशिकाओं (रेंज 2.0-5.8, एन = 5 कुत्तों) 18 के साथ तुलना में। 0.1 माइक्रोन के (चित्रा 1 ए) में पीएमए एक धीमी एगोनिस्ट जो 2 घंटा तक प्रतिदीप्ति में वृद्धि में परिणाम नहीं करता है, लेकिन अंत में प्रतिदीप्ति में एक समान गुना वृद्धि का उत्पादन (मतलब: 3.3, सीमा 1.36-5.4, एन = 5 कुत्तों) 18। अपनी धीमी कैनेटीक्स के बावजूद, वहाँ पीएमए के लिए लाभ के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कर रहे हैं: यह पीएएफ की उच्च सांद्रता के साथ तुलना में अपेक्षाकृत कम खर्चीली है और यह व्यापक रूप से murine और मानव अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है।
न्यूक्लिक एसिड रंगों के प्रतिदीप्ति नहीं हैनेट गठन के लिए pecific यह भी अगर कोई अन्य तंत्र द्वारा कोशिका मृत्यु है या अभिकर्मकों डीएनए के साथ दूषित कर रहे हैं तो हो जाएगा के रूप में। चित्रा 2 में दिखाया गया है, एक वाणिज्यिक LPS तैयारी बहुत उच्च प्रतिदीप्ति न्यूट्रोफिल के अभाव में, शायद जीवाणु के डीएनए के साथ संदूषण की वजह से उत्पादन किया। ऐसे immunofluorescence के रूप में अन्य तरीकों के माध्यम से नेट के गठन की पुष्टि की सिफारिश की है।
चित्रा 1: पीएमए और विभिन्न कैनेटीक्स के साथ एक सेल अभेद्य न्यूक्लिक एसिड डाई की पीएएफ वृद्धि प्रतिदीप्ति न्यूट्रोफिल सेल अभेद्य न्यूक्लिक एसिड डाई की उपस्थिति में 0.1 माइक्रोन के पीएमए (ए) या 31 माइक्रोन के पीएएफ (बी) के साथ प्रेरित किया गया।। प्रतिदीप्ति एक घंटे के अंतर और गणना की गैर उत्तेजित कोशिकाओं की तुलना में प्रेरित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति में गुना परिवर्तन पर मापा गया था। प्रतिदीप्ति वृद्धिघ काफी 1 और 2 पीएमए के लिए मानव संसाधन के बीच (दोहराया उपायों एक तरह से एनोवा Bonferroni के सुधार के साथ कई टी परीक्षण, बहुलता समायोजित पी = 0.04 द्वारा पीछा त्रुटि सलाखों मतलब ± 5 व्यक्तियों के लिए मानक त्रुटि) कर रहे हैं लेकिन पहले से ही द्वारा पीएएफ के लिए plateaued था 1 घंटा। । कैनाइन न्युट्रोफिल कोशिकी जाल स्वास्थ्य और प्रतिरक्षा की मध्यस्थता में एनीमिया: यह आंकड़ा एट अल कुत्तों डाली भी जाल जेफ़री यू से संशोधित किया गया है। पशु चिकित्सा इम्यूनोलॉजी और इम्युनोपैथोलोजी, 168 (3-4), 262-8, डोई:। 10.1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: खाली कुओं एगोनिस्ट द्वारा डीएनए संदूषण या हस्तक्षेप बाहर शासन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं LPS के एक वाणिज्यिक स्रोत।RPMI युक्त अकोशिकीय कुओं को जोड़ा गया है। गैर उत्तेजित न्यूट्रोफिल युक्त कुओं के साथ तुलना में प्रतिदीप्ति में एक बड़े परिवर्तन गुना जीवाणु के डीएनए के साथ एगोनिस्ट के प्रदूषण को पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
डीएनए रिहाई प्रस्तुत परख कोशिकी डीएनए के लिए एक आसानी से मात्रात्मक परख है। विधि अन्य प्रजातियों में नेट गठन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है इसी तरह की तकनीक से अनुकूलित किया गया था, लेकिन centrifugation गति, एगोनिस्ट सांद्रता और ऊष्मायन बार कुत्ते न्यूट्रोफिल 8,17,18 साथ प्रयोग के लिए विधि अनुकूलन करने के लिए बदल दिया गया है। इसी समायोजन अन्य प्रजातियों के लिए विधि अनुकूल बनाया जा सकता है। परख जब इस तरह से फ्लो या छवि विश्लेषण के रूप में NETosis को मापने के लिए अन्य तरीकों के साथ तुलना में सरल और सस्ती है। विधि को भी नेट घटकों के खिलाफ एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है, तो कुत्तों में उपयोग के लिए आदर्श है के लिए जिसे वाणिज्यिक उत्पादन, पुष्टि प्रजातियों प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी अक्सर उपलब्ध नहीं हैं।
विधि के प्रमुख सीमा नेट गठन के लिए सेल अभेद्य न्यूक्लिक एसिड रंगों की विशिष्टता की कमी है। इन रंगों भी मर चुका है और मर कोशिकाओं, बाँध डीएनए दर्ज करें और प्रतिदीप्ति। इसलिए, FLuorescence नेट गठन के लिए विशिष्ट नहीं है। नेत्रहीन पुष्टि एगोनिस्ट कोशिका मृत्यु के अन्य रूपों से नेट गठन उत्प्रेरण रहे हैं बल्कि मात्रात्मक परख के साथ समानांतर में अन्य तकनीकों (जैसे, immunofluorescence) का उपयोग पुरजोर सिफारिश की है। परख भी संभावित कोशिका मृत्यु के लिए एक सामान्य जांच परख के रूप में, उदाहरण के लिए cytotoxicity पूर्व vivo बढ़ाता का एक साधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल सरल है, लेकिन वहाँ की सफलता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले, के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया, न्युट्रोफिल अलगाव के दौरान अत्यधिक सेल नुकसान यह महत्वपूर्ण है कि supernatants के बजाय एक विंदुक के साथ बंद तैयार कर रहे हैं नलियों inverting द्वारा खारिज कर से बचने के लिए। दूसरे, परख की सफलता गैर उत्तेजित नियंत्रण ऊष्मायन के दौरान एक व्यवहार्य और आराम की स्थिति में शेष कोशिकाओं पर निर्भर करता है। न्यूट्रोफिल प्रोटोकॉल तो सावधान ध्यान atraumatic रक्त संग्रह टी करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए दौरान किसी भी स्तर पर सक्रिय हो सकते हैंechnique और न्युट्रोफिल अलगाव के दौरान दर्दनाक हैंडलिंग (जैसे, vortexing) से परहेज। यह भी याद है कि न्यूट्रोफिल एक सीमित देता है तो कोशिकाओं को अलग करने या परख की स्थापना में देरी के 19 से बचा जाना चाहिए महत्वपूर्ण है। एगोनिस्ट के साथ लंबे समय तक ऊष्मायन का प्रयास कर रहा है, इस समय अवधि में गैर-प्रेरित कोशिकाओं की व्यवहार्यता पुष्टि की जानी चाहिए।
जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, वहाँ नेट एगोनिस्ट के लिए उनकी प्रतिक्रिया में कुत्तों के बीच काफी भिन्नता है। हालांकि, परख पर 10 डुप्लिकेट 18 के आधार पर 9% की एक अंतर-परख बदलाव के साथ ही पशु यथोचित से प्रतिकृति के बीच अनुरूप होना चाहिए। प्रतिकृति के बीच बड़े बदलाव देखते हैं, तो सेल clumping संभावना जिम्मेदार है। उपाय सेल clumping को कम करने के लिए नहीं बल्कि एक कैल्शियम डीएनए परख की स्थापना, कोशिकाओं के इलाज धीरे अलगाव भर में, और सेल के शेयर को छानने से पहले बफर युक्त से पीबीएस में कोशिकाओं को बनाए रखने में शामिलनिलंबन चढ़ाना कोशिकाओं से पहले।
इन चरणों का पालन कर रहे हैं, इस प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक शर्तों और एगोनिस्ट की एक विस्तृत श्रृंखला के जवाब में नेट गठन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। इस तरह के अध्ययन कुत्ते स्वास्थ्य और रोग में नेट की भूमिका के बारे में हमारी समझ को गहरा कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, इस तकनीक को स्वस्थ कुत्तों और प्रतिरक्षा को दबाने या स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों जिसमें NETosis बिगड़ा या बढ़ाया जा सकता है के साथ उन लोगों के बीच शुद्ध रिहाई की तुलना की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, जब इस तरह के immunofluorescence के रूप में अन्य तकनीकों के साथ संयुक्त, परख उपन्यास NETosis और NETosis के उपन्यास अवरोधकों उत्प्रेरण के लिए सक्षम एगोनिस्ट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
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