Summary
好中球細胞外トラップ（ネット）DNA、ヒストンおよび好中球のタンパク質のネットワークです。先天性免疫応答の成分が、ネットは自己免疫および血栓症に関与しています。このプロトコルは、イヌ好中球の単離およびマイクロプレート蛍光アッセイを用いてのNETの定量化のための単純な方法を記載しています。
Introduction
米国だけ1万人の70以上のペットの犬があります。大切な家族のように、これらの動物は、多くの場合、エッジ医療を切断受けます。彼らは私たちの環境を等しく共有しているため、犬は人間の病気1の病因と治療への洞察を提供することができます。しかし、獣医学的治療またはその逆に人間の医学の発見を翻訳するかどうか、徹底的にあっても、そのような先天性免疫応答のような高度に保存されたシステムでは、種のバリエーションを特徴づけることが重要です。イヌとヒトの先天性免疫系の間の違いの例としては、犬の好中球2に高発現CD4を含みます。犬3と肉食4におけるカスパーゼ1/4ハイブリッドの発現の細胞質フラジェリンセンサーIPAFの機能的ホモログが存在しません。
好中球細胞外トラップ（ネット）、先天性免疫5の比較的最近発見されたコンポーネントです。ネットネットワークであります炎症性または感染性の刺激6の広い範囲に対応して放出されたDNA、核および粒状タンパク質の秒。 NETのような構造は、ニワトリ7、魚8、軟体動物9および10を acoelomates含む多くの種を越えて実証されているが、種のバリエーションがあります。例えば、マウス好中球は、ヒト好中球よりNETosisの刺激に応答速度が遅く、少ない拡散のNET 11を形成します 。ネットは直接病原体12,13を殺害に関与している可能性がより多くの論争の微生物を捕捉し、複数の種からの多くの証拠があります。しかし、NETコンポーネントはまた、組織の損傷を高める14,15を自己抗原として血栓症や行動を推進しています。 NETの有益と有害な影響のバランスは、種と関心の状態の両方でネットを調査することが重要である示唆し、異なる疾患と異なる種の間で異なる場合があります。
ここでイヌの好中球によるのNETの放出を誘導し、測定するための単純なプロトコルを記述します。この方法は、好中球16を分離し、他の種にNETosisを誘導するために使用されるものと同様であるが、そのようなアゴニスト濃度およびインキュベーション時間などの条件は、イヌ好中球のために最適化されています。同様のNET定量DNA放出アッセイは、他の種に記載されているが、ここで提示された方法はまた、イヌ8,17,18のために最適化されています。
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Protocol
すべての実験は、アイオワ州立大学の施設内動物管理使用委員会から倫理的な許可を得て行われました。
1.採血
- バキュテイナー抗凝固剤に直接橈側または頸静脈、伏在から血液の9ミリリットルを描く（ 例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1.8ミリグラムのK 2 EDTA / mlの血液）、またはEDTAを含有する血液管への即時転送にシリンジに。穏やかにロールまたは血液と抗凝固剤の適切な混合を確実にするために、血液チューブを反転させます。
2.好中球の分離
- 50ミリリットルコニカルチューブでは、無菌の室温等容積の血液を混ぜて3パーセント穏やかに反転することにより、デキストラン-500（0.9％滅菌生理食塩水で作製）。室温で18〜20分間、直立したままにしておきます。それはもはや下位赤色層による汚染なしに収集されなくなるまで新鮮なチューブに淡黄色の上層を転送します。目中の赤血球E元のチューブを廃棄することができます。
- 4℃で10分間、500×gで上清を遠心。オフ描画し、上清を捨てます。 10mLの室温の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に手動で再懸濁細胞ペレット。そのボルテックスは、このプロトコルのいずれかの段階で再懸濁好中に使用すべきではありません注意してください。手動でオフに描くのではなく、上清を捨てることも、細胞収率を最大化するためのプロトコル全体で推奨されています。
- 50ミリリットルコニカルチューブに室温ポリスクロースおよびジアトリゾ酸ナトリウム細胞分離液（ 例えば 、ヒスト1077）の10ミリリットルを追加します。慎重に細胞分離溶液上に細胞含有液を層。室温に平衡化されていない細胞分離液を使用して、細胞収率を低下させることができることに留意されたいです。
- ブレーキをオフにして、室温で30分間、300×gで遠心分離します。
- 好中球は勾配の最下層にあるように、オフ描き、uppeを捨てます血漿および血小板、単核細胞の狭ホワイトバンドと密度勾配媒体の透明層の上層からなるR 3層。
- 残りの赤血球を溶解するために、室温の水10ml中の好中球ペレットを再懸濁します。
- 30秒後、滅菌室温1.8％の塩化ナトリウムの10ミリリットルを追加することで、張性を回復し、穏やかに転倒混和します。
- 4℃で5分間、500×gで遠心分離します。上清をオフに描画し、廃棄します。
- ペレットがまだ赤の場合、溶解工程を繰り返します。ペレットは白色である（または溶解が既に2回行っている場合）、穏やかに無菌PBS 10ml中に細胞を再懸濁した場合。
- 自動化されたカウンターまたは血球計数器を用いて細胞を数えます。典型的な収量は、血液1mlあたり少なくとも10 6細胞です。
- 4℃で5分間、500×gで遠心分離します。上清をオフに描画し、廃棄します。
- 無菌の室温PBSで所望の濃度に細胞を再懸濁。フォー1mlあたり5×10 6細胞で再懸濁、セクション2に記載のDNA放出アッセイrを。
- 必要であれば、細胞の小容積を直接転送したり、スライドガラスに細胞遠心を使用。細胞は「製造業者の指示に従って迅速な固定および染色キットを用いて乾燥し、染色することができます。好中球の単離に成功した場合、有核細胞の顕微鏡で調べ、少なくとも95％は、最小限の赤血球の混入と顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）でなければなりません。
3. DNA放出アッセイ
- 好中球の単離後、直ちにDNA放出アッセイを設定します。
- 細胞凝集は、光顕微鏡によるストック溶液の審査に存在する場合、すぐにアッセイを設定する前に、無菌の70μmの滅菌フィルターを通して細胞懸濁液を渡します。
- 滅菌96ウェルプレートの各試験ウェルに、5×10 4細胞/ウェルを追加。アゴニストおよびロズウェルパークメモ赤及び100~200μlの最終体積0.5％の熱不活化ウシ胎仔血清を補充したフェノールなしリアル研究所-1640（RPMI）培地。好中球のストック溶液を、等量のPBSで置換したアゴニスト当たり少なくとも二つのブランクウェルを含みます。各アゴニストのためのブランクウェルを設定すると、蛍光アッセイでアゴニストによるアゴニストまたは干渉のDNAの混入を排除する上で重要であることに注意してください。
- 二酸化炭素（4％）インキュベーター内で30分間39℃でインキュベートします。
- 所望の濃度および細胞不透過性核酸色素でアゴニストを追加します。細胞不透過性色素の最適濃度が異なる核酸色素の間で異なることに注意してください。アゴニストは培地の等量で置換された非刺激対照を各実験に含まれるべきです。
注：これは、ウェル間の一貫性の条件を維持するために、培地の同様の量のアゴニストを希釈することが望ましいです。 200の最終的なウェルボリューム＆＃181; lは正常に使用されており、これが変更されている場合、十分ボリュームはすべての条件のために同一のままであるべきです。ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート（PMA）（最終濃度≥0.1μM）または血小板活性化因子（PAF）（最終濃度≥31μM）を陽性対照として使用することができます。アゴニストは重複し、少なくとも測定されるべきです。 - 39℃でインキュベートします。 2時間後に、または所望の間隔でマイクロプレートリーダーを用いて蛍光を測定します。最適な時間間隔が使用アゴニストとともに変化することに注意してください。
注：波長が用いられる色素に依存します。 - 平均蛍光を計算する前に、ブランクの蛍光を引きます。
- 個人間およびプレート間の比較を可能にするために、非刺激ウェルの平均蛍光によって刺激されたウェルの平均蛍光を分割することにより、蛍光の変化倍率を計算します。
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Representative Results
このプロトコルを使用して、ポジティブコントロール、PMAおよびPAFで好中球を刺激した後、蛍光の強い倍数変化があるはずです。非刺激細胞（範囲2.0から5.8、N = 5匹の犬）18と比べて蛍光が平均4.0倍の増加で1時間の結果を得るために31μMPAFと図1B、イヌ好中球の刺激に示すように。 18：0.1μM（ 図1A）でPMAは2時間までの蛍光の増加をもたらすが、最終的に同様の倍の蛍光の増加（3.3、範囲1.36から5.4、N = 5匹の犬を意味する）を生成しない遅いアゴニストです。それより遅い速度にもかかわらず、PMAの効果は、陽性対照としてある：それは、PAFの高濃度に比べて比較的安価であり、広くマウスおよびヒトの研究で使用されています。
核酸色素の蛍光はSではありませんNET形成のためのpecific他のメカニズムによって、または試薬がDNAで汚染されているかの細胞死がある場合、それはまた、発生しますように。 図2に示すように、商用のLPS調製物は、おそらく細菌DNAの混入に、好中球の非存在下で非常に高い蛍光を生じました。このような免疫蛍光などの他の方法を介して、NET形成を確認することをお勧めします。
図1：PMA及び異なる速度を有する細胞不浸透性核酸色素のPAF増加蛍光好中球は、細胞不浸透性核酸色素の存在下で、0.1μMPMA（A）または31μMPAF（B）で刺激しました。蛍光は、時間間隔算出した非刺激細胞と比較して、刺激された細胞の蛍光の変化倍率で測定しました。蛍光増加大幅PMAのための1および2時間の間、D（反復測定一元配置ANOVAは、ボンフェローニの補正、多重度調整したp = 0.04を持つ複数のt検定に続いて、エラーバーは、5人の平均±標準誤差である）が、既にによりPAFのためにプラトーに達しました1時間。 。犬好中球細胞外トラップの健康と免疫介在性溶血性貧血に：この図は、 らすぎる犬のキャストネット、ジェフリーUから変更されています。獣医免疫学および免疫病理、168（3-4）、262から8、DOI：10.1016 / j.vetimm.2015.10.014（2015）18 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ブランクのウェルは、アゴニストによってDNA混入や干渉を排除するために重要である LPSの商業的供給源。RPMIを含む無細胞ウェルに添加しました。非刺激好中球を含むウェルと比較して、蛍光の大きな倍数変化は、細菌DNAを持つアゴニストの汚染を示唆している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
提示されたDNA放出アッセイは、細胞外DNAのために容易に定量化できるアッセイです。この方法は、同様の他の種でNET形成を評価するために使用される技術が、遠心分離速度、アゴニスト濃度から適応され、インキュベーション時間は、イヌ好中球8,17,18で使用するための方法を最適化するために変更されています。同様の調整は、他の種のための方法を適合させることができます。このアッセイは、フローサイトメトリーまたは画像解析としてNETosisを測定するための他の方法と比較して簡単かつ安価です。この方法はまた、NETコンポーネントに対する抗体を必要としないので、検証種反応性抗体は、しばしば利用できない、商業的に生産誰のための犬での使用に最適です。
この方法の主な制限は、NET形成のために、細胞不浸透性核酸色素の特異性の欠如です。これらの染料はまた、死者や死細胞、結合DNAを入力して蛍光を発します。したがって、FLuorescenceはNET形成のために特異的ではありません。視覚的アゴニストは、細胞死の他の形態ではなく、NET形成を誘導することを確認するため、定量分析と並行して他の技術（ 例えば 、免疫蛍光法）の使用が強く推奨されます。アッセイはまた、潜在的にex vivoでの細胞毒性を定量化する手段として、例えば、細胞死のための一般的なスクリーニングアッセイとして使用することができます。
プロトコルはシンプルですが、成功を確保するために必要な重要なステップがあります。まず、プロトコルに記載されているように、好中球の単離の間に過剰な細胞の損失を避けるためには、上清をピペットで引き出さなく、チューブを反転させることによって破棄されることが重要です。第二に、アッセイの成功は、インキュベーションを通じて生存可能であり、静止状態で残りの非刺激対照細胞に依存しています。好中球は、そのように細心の注意が非外傷性採血トンに支払われるべきプロトコルの間の任意の段階で活性化することができますechniqueと好中球の単離の間に外傷性の取り扱い（ 例えば、ボルテックス）を回避することができます。アッセイを細胞を単離するか、セットアップの遅延が19を避けるべきであるので、好中球が限られた寿命を持っていることを覚えておくことも重要です。アゴニストによる長期のインキュベーションが試みられた場合、この期間にわたって、非刺激細胞の生存能力を確認すべきです。
図1に示すように 、NETアゴニストに対する応答におけるイヌの間でかなりのばらつきがあります。しかし、このアッセイは、10 18を複製に基づいて9％のアッセイ内変動で、同じ動物からの複製の間に合理的に一貫している必要があります。複製の間に大きなばらつきがある場合は、細胞凝集は、おそらく原因です。細胞凝集を軽減するための措置ではなく、前に穏やかに分離を通じて細胞を処理し、DNAアッセイを設定し、細胞ストックをフィルタリングする緩衝液を含有するカルシウムよりも、PBSで細胞を維持含ま細胞をプレーティングする前にサスペンション。
これらのステップが続いている場合は、このプロトコルは、実験条件およびアゴニストの広い範囲に応じて、NET形成の定量化を可能にします。このような研究は、イヌの健康と病気でのNETの役割についての理解を深めことができます。例えば、この技術は、健康な犬とNETosisが損なわまたは増強することができる、免疫または自己免疫疾患を有するものの間にNET放出の比較を可能にします。例えば、免疫蛍光法のような他の技術と組み合わされた場合あるいは、アッセイはNETosisとNETosisの新規阻害剤を誘導することができる新規なアゴニストを同定するために使用することができます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
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