Summary
trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono reti di DNA, istoni e proteine neutrofili. Sebbene un componente della risposta immunitaria innata, NET sono implicati in autoimmunità e trombosi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'isolamento dei neutrofili canina e la quantificazione di NET utilizzando un saggio micropiastra fluorescenza.
Introduction
Ci sono oltre 70 milioni di cani negli Stati Uniti da solo 1. Come membri della famiglia stimati, questi animali spesso ricevono cure mediche taglio bordo. Altrettanto perché condividono il nostro ambiente, i cani possono fornire intuizioni nella patogenesi e nel trattamento delle malattie umane 1. Tuttavia, se traducendo scoperte in medicina umana in trattamenti veterinari o viceversa, è importante caratterizzare accuratamente variazioni specie anche in sistemi altamente conservati quali la risposta immunitaria innata. Esempi di differenze tra il cane e il sistema immunitario innato umano includono l'alta espressione CD4 sui neutrofili cane 2; l'assenza di un omologo funzionale del sensore flagellin citoplasmatica IPAF nei cani 3 e l'espressione di un ibrido caspasi 1/4 carnivori 4.
Trappole extracellulari dei neutrofili (reti) sono una componente relativamente recente scoperta di immunità innata 5. Le reti sono di retes del DNA, proteine nucleari e granulari rilasciati in risposta ad una vasta gamma di stimoli infiammatori o infettive 6. Strutture a rete sono state dimostrate in molte specie tra cui polli 7, pesce, molluschi 8 9 e acoelomates 10, ma ci sono variazioni di specie. Ad esempio, i neutrofili murini rispondono più lentamente agli stimoli NETosis di neutrofili umani, e formano NET meno diffuse 11. Vi è un grande corpo di evidenze provenienti da più specie che NET intrappolano i microbi, e più controverso può essere direttamente coinvolti nell'uccisione di agenti patogeni 12,13. Tuttavia, i componenti NET anche migliorare danni ai tessuti, favoriscono la trombosi e di agire come autoantigeni 14,15. L'equilibrio tra i benefici effetti deleteri e di reti può variare tra diverse malattie e specie diverse, suggerendo è importante indagare NET sia nelle specie e condizioni di interesse.
Qui noidescrivere un semplice protocollo per indurre e misurando il rilascio di NET da parte dei neutrofili canina. Questo metodo è simile a quelli usati per isolare neutrofili 16 ed indurre NETosis in altre specie, ma le condizioni quali la concentrazione agonista e tempo di incubazione sono state ottimizzate per i neutrofili canino. Un saggio di rilascio quantificazione del DNA NET simile è stata descritta anche in altre specie, ma il metodo presentato qui è anche ottimizzato per i cani 8,17,18.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con il permesso etico da parte del Comitato Istituzionale dell'Università cura degli animali e Usa Iowa State.
Raccolta 1. Sangue
- Disegnare 9 ml di sangue da una safena, la vena cefalica o giugulare direttamente in anticoagulante (ad esempio, l'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1,8 mg K 2 EDTA / ml di sangue) vacutainer, o in una siringa con il trasferimento immediato di provette di sangue EDTA contenenti. Delicatamente rotolare o invertire i tubi di sangue per assicurare un'adeguata miscelazione del sangue e anticoagulante.
2. Isolamento dei neutrofili
- In una provetta conica da 50 ml, mescolare il sangue con un volume uguale di temperatura ambiente sterile 3% destrano-500 (preparati in soluzione fisiologica 0,9% sterile) delicatamente per inversione. Lasciare in piedi per 18-20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire lo strato superiore paglierino in una nuova provetta fino a che non può più essere raccolto senza contaminazione dallo strato inferiore rosso. Gli eritrociti in thtubo originale e può essere scartata.
- Centrifugare il surnatante a 500 xg per 10 minuti a 4 ° C. Aspirare e scartare il surnatante. Manualmente risospendere il pellet cellulare in 10 ml di temperatura ambiente fosfato sterile salina tamponata (PBS). Si noti che vortex non deve essere utilizzato per ri-sospendere neutrofili in qualsiasi fase di questo protocollo. disegno manualmente fuori, invece di travaso surnatanti è consigliato anche in tutto il protocollo per massimizzare la resa delle cellule.
- Aggiungere 10 ml di una soluzione di separazione delle cellule polysucrose temperatura ambiente e diatrizoato di sodio (ad esempio, Histopaque 1077) in una provetta conica da 50 ml. strato con attenzione la soluzione di cellule contenente sopra la soluzione di separazione delle cellule. Si noti che la soluzione separazione delle cellule usando che non ha riportati a temperatura ambiente può ridurre la resa delle cellule.
- Centrifugare a 300 xg per 30 min a temperatura ambiente con il freno.
- Come neutrofili sono nello strato più basso del gradiente, erogare e scartare il uppeR 3 strati, composto da uno strato superiore di plasma e piastrine, una banda bianca stretta di cellule mononucleate e una chiara strato di mezzo gradiente di densità.
- Per lisare ogni residuo eritrociti, risospendere il pellet neutrofili in 10 ml di acqua a temperatura ambiente.
- Dopo 30 secondi, ripristinare tonicità con l'aggiunta di 10 ml di temperatura ambiente sterile di sodio cloruro 1,8% e mescolare delicatamente per inversione.
- Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e scartare.
- Se il pellet è ancora rosso, ripetere il passaggio lisi. Se il pellet è bianco (o se lisi è già stata eseguita due volte), delicatamente risospendere le cellule in 10 ml di PBS sterile.
- Contare le cellule utilizzando un contatore automatico o un emocitometro. Le rese sono almeno 10 6 cellule per ml di sangue.
- Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e scartare.
- Risospendere le cellule alla concentrazione desiderata in sterile temperatura ambiente PBS. for il saggio di rilascio del DNA descritta nella sezione 2, risospendere a 5 x 10 6 cellule per ml.
- Se lo si desidera, trasferire un piccolo volume di cellule direttamente o tramite una citocentrifuga ad un vetrino. Consentono alle cellule a secco e macchia con una fissazione e colorazione kit rapida a seconda della fabbrica 'istruzioni. Se l'isolamento dei neutrofili ha avuto successo, se esaminato al microscopio almeno il 95% delle cellule nucleate dovrebbe essere granulociti (neutrofili, basofili, eosinofili) con la contaminazione degli eritrociti minima.
3. DNA saggio di rilascio
- Impostare il test di rilascio del DNA immediatamente dopo l'isolamento dei neutrofili.
- Se aggregazione delle cellule è presente all'esame della soluzione di riserva al microscopio ottico, passare la sospensione cellulare attraverso un filtro sterile 70 micron sterile immediatamente prima di impostare il dosaggio.
- Per ogni pozzetto di test di una sterile, 96 pozzetti, aggiungere 5 x 10 4 cellule / pozzetto; agonisti e Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI) mezzo senza rosso e integrato con 0,5% di siero fetale di vitello inattivato al calore per un volume finale di 100-200 microlitri fenolo. Includere almeno due pozzetti bianchi per agonisti in cui la soluzione neutrofili stock è sostituito da un uguale volume di PBS. Si noti che la creazione di pozzetti del bianco per ogni agonista è importante escludere la contaminazione del DNA del agonisti o interferenza con l'agonista con il test di fluorescenza.
- Incubare a 39 ° C per 30 min in un incubatore anidride carbonica (4%).
- Aggiungere agonisti a concentrazioni desiderati e un colorante cellulare impermeabile acidi nucleici. Si noti la concentrazione ottimale di colorante impermeabile cella varierà tra i diversi coloranti acidi nucleici. controlli non stimolati in cui agonisti sono sostituiti da un uguale volume di media dovrebbero essere inclusi in ogni esperimento.
NOTA: E 'opportuno diluire agonisti dei volumi simili di terreno di coltura per mantenere condizioni coerenti tra pozzi. volumi e finale di 200 &# 181; l sono stati utilizzati con successo e se questo viene alterato, ben volumi dovrebbe rimanere identica per tutte le condizioni. Forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) (concentrazione finale ≥0.1 uM) o fattore di attivazione piastrinica (PAF) (concentrazione finale ≥31 pM) possono essere utilizzati come controlli positivi. Agonisti devono essere misurati almeno in doppio. - Incubare a 39 ° C. Misurare la fluorescenza usando un lettore per micropiastre dopo 2 ore o ad intervalli desiderati. Si noti che intervalli ottimali variano con agonisti utilizzati.
NOTA: Lunghezza d'onda dipende colorante impiegato. - Sottrarre fluorescenza vuoto prima di calcolare la fluorescenza media.
- Per consentire il confronto tra gli individui e tra le piastre, calcolare un cambiamento volte a fluorescenza dividendo la fluorescenza media dei pozzi stimolati dalla fluorescenza media dei pozzi non-stimolata.
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Representative Results
Usando questo protocollo, dovrebbe esserci una forte variazione piega in fluorescenza dopo stimolazione neutrofili con i controlli positivi, PMA e PAF. Come illustrato nella Figura 1B, la stimolazione dei neutrofili canino con 31 pM PAF per 1 hr, comportano un aumento medio di 4,0 volte della fluorescenza rispetto alle cellule non stimolate (range 2,0-5,8, n = 5 cani) 18. PMA a 0,1 micron (Figura 1A) è un agonista più lento che non si traduca in un aumento della fluorescenza fino a 2 ore, ma alla fine produce un aumento simile volte a fluorescenza (media: 3,3, range 1,36-5,4, n = 5 cani) 18. Nonostante la sua cinetica più lenti, ci sono vantaggi a PMA come controllo positivo: è relativamente poco costoso rispetto ad alte concentrazioni di PAF ed è stato ampiamente utilizzato in murini e studi sull'uomo.
Fluorescenza dei coloranti acidi nucleici non è specifici per la formazione NET come sarà verificarsi anche se non vi è la morte delle cellule da altri meccanismi o se i reagenti sono contaminati con il DNA. Come mostrato in figura 2, una preparazione commerciale LPS prodotto molto elevato di fluorescenza in assenza di neutrofili, presumibilmente a causa di contaminazione con DNA batterico. Si raccomanda confermando formazione NET attraverso altri metodi come immunofluorescenza.
Figura 1: PMA e PAF aumento della fluorescenza di un colorante acido nucleico cellulare impermeabile con differenti cinetiche neutrofili sono state stimolate con 0,1 mM PMA (A) o 31 pM PAF (B) in presenza della cella impermeabile colorante acido nucleico.. La fluorescenza è stata misurata a intervalli di un'ora e la variazione piega in fluorescenza delle cellule stimolate rispetto alle cellule non stimolate calcolati. aumento di fluorescenzad significativamente tra 1 e 2 ore per la PMA (ripetute misure ANOVA seguita da più t-test con la correzione di Bonferroni, molteplicità p aggiustato = 0.04; barre di errore sono media ± errore standard per 5 persone), ma erano già stabilizzato per PAF da 1 ora. Questa cifra è stata modificata da Jeffery U, et al del cast NET anche i cani. Canine neutrofili trappole extracellulari in salute e anemia emolitica immuno-mediata. Immunologia veterinaria e Immunopatologia, 168 (3-4), 262-8, doi:. 10.1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: pozzi vuoti sono importanti per escludere la contaminazione del DNA o interferenza da parte del agonisti Una fonte commerciale di LPS.è stato aggiunto ai pozzetti acellulari contenenti RPMI. Un grande cambiamento volte a fluorescenza rispetto ai pozzetti contenenti neutrofili non stimolati suggerisce la contaminazione del agonisti con il DNA batterico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il saggio di rilascio del DNA presentato è un test facilmente quantificabile per il DNA extracellulare. Il metodo è stato adattato da tecniche simili utilizzati per valutare la formazione di NET in altre specie, ma la velocità di centrifugazione, le concentrazioni di agonisti e tempi di incubazione sono state modificate per ottimizzare il metodo per l'utilizzo con i neutrofili canini 8,17,18. regolazioni simili potrebbero essere fatte per adattare il metodo per le altre specie. Il test è semplice e poco costoso rispetto ad altri metodi per la misurazione NETosis come citometria di flusso o di analisi delle immagini. Il metodo, inoltre, non necessita di anticorpi contro i componenti NET, quindi è ideale per l'utilizzo in cani per i quali prodotti commercialmente, le specie reattive-convalidati anticorpi sono spesso disponibili.
La maggiore limitazione del metodo è la mancanza di specificità di coloranti acidi nucleici di cellule-impermeabile per la formazione NET. Questi coloranti anche entrare le cellule morte e morenti, il DNA si legano e fluorescenti. Pertanto, flfluorescenza non è specifico per la formazione NET. L'utilizzo di altre tecniche (ad esempio, di immunofluorescenza) in parallelo con il dosaggio quantitativo per confermare visivamente agonisti sono inducendo la formazione di NET, piuttosto che ad altre forme di morte cellulare è fortemente raccomandato. Il dosaggio può anche potenzialmente essere utilizzato come test di screening generale per la morte cellulare, ad esempio come mezzo di quantificare citotossicità ex vivo.
Il protocollo è semplice, ma ci sono passaggi critici necessari per garantire il successo. In primo luogo, come indicato nel protocollo, per evitare la perdita eccessiva delle cellule durante l'isolamento dei neutrofili è importante che supernatanti sono disegnati con una pipetta non scartate invertendo tubi. In secondo luogo, il successo del test si basa sulle cellule di controllo non stimolate rimanenti in uno stato valido e di riposo durante l'incubazione. I neutrofili possono diventare attivato in qualsiasi momento durante il protocollo in modo particolare attenzione deve essere rivolta alla raccolta di sangue atraumatica tecnica ed evitando la manipolazione traumatico (per esempio, vortex) durante l'isolamento dei neutrofili. E 'anche importante ricordare che i neutrofili hanno una durata limitata in modo ritardo nella isolare cellule o la creazione di test dovrebbe essere evitato 19. Se incubazione prolungato con agonisti viene tentato, deve essere confermata la vitalità delle cellule non stimolate in questo periodo di tempo.
Come mostrato in Figura 1, vi è una notevole differenza tra cani nella loro risposta agli agonisti NET. Tuttavia, il dosaggio deve essere ragionevolmente coerenti tra le repliche dello stesso animale, con una variazione intra-saggio del 9% sulla base di 10 duplica 18. Se ci sono grandi variazioni tra le repliche, aggregazione cellulare è probabilmente responsabile. Misure per ridurre aggregazione cellulare includono il mantenimento cellule in PBS, piuttosto che un calcio contenente tampone prima di impostare il test del DNA, trattando le cellule delicatamente tutto l'isolamento, e filtrare il brodo cellularesospensione prima di placcatura cellule.
Osservando tali passaggi, questo protocollo permette quantificazione della formazione NET in risposta ad una vasta gamma di condizioni sperimentali e agonisti. Tali studi possono approfondire la nostra comprensione del ruolo delle reti in salute del cane e la malattia. Ad esempio, questa tecnica permette di confronto NET rilascio tra cani sani e quelli con malattie immunosoppressive o autoimmuni, in cui NETosis può essere compromessa o migliorato. In alternativa, quando combinato con altre tecniche come immunofluorescenza, il test può essere utilizzato per identificare nuovi agonisti in grado di indurre NETosis e nuovi inibitori di NETosis.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
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