Summary
Nøytrofile ekstracellulære feller (nett) er nettverk av DNA, histoner og nøytrofile proteiner. Selv om en komponent av den medfødte immunrespons, er garn implisert i autoimmunitet og trombose. Denne protokollen beskriver en enkel metode for canine nøytrofil isolering og kvantifisering av nett ved hjelp av en mikroplate-fluorescens-analyse.
Introduction
Det er over 70 millioner kjæledyr hunder i USA alene en. Som verdsatte familiemedlemmer, disse dyrene ofte får cutting edge medisinsk behandling. Like fordi de deler vårt miljø, kan hunder gi innsikt i patogenesen og behandlingen av menneskelig sykdom 1. Men om sette funn i humanmedisinen til veterinær behandling eller vice versa, er det viktig å grundig karakterartsvariasjoner selv i sterkt konserverte systemer slik som det medfødte immunrespons. Eksempler på forskjeller mellom hund og menneske medfødte immunsystemet omfatter høyt uttrykk CD4 på hunden nøytrofile 2; fraværet av en funksjonell homolog av det cytoplasmatiske flagellin sensoren IPAF i hunder 3 og ekspresjon av et caspase 1/4 hybrid i rovdyr 4.
Nøytrofile ekstracellulære feller (NETS) er en relativt nylig oppdaget komponent av medfødt immunitet 5. NET er nettverkss av DNA, nukleære og granulære proteiner utgitt i respons til et bredt spekter av inflammatoriske eller infeksiøse stimuli 6. Nettliknende strukturer har blitt vist i mange arter inkludert kyllinger 7, 8 fisk, bløtdyr 9 og acoelomates 10, men det er artsvariasjoner. For eksempel murine nøytrofile svare saktere å NETosis stimuli enn humane neutrofiler, og danner mindre diffuse NET 11. Det er en stor mengde bevis fra flere arter som NET entrap mikrober, og mer kontroversielt kan være direkte involvert i å drepe patogener 12,13. Men NET komponenter også forbedre vevsskade, fremme trombose og fungere som autoantigener 14,15. Balansen mellom de gunstige og skadelige effekter av nøter kan variere mellom ulike sykdommer og ulike arter, noe som tyder på at det er viktig å undersøke NET både i art og tilstand av interesse.
her er vibeskrive en enkel protokoll for å indusere og måling av utslipp av Nets av hjørnetann nøytrofile. Denne metoden er lik de som brukes for å isolere neutrofiler 16 og indusere NETosis i andre arter, men forhold som agonist-konsentrasjon og inkubasjonstid har blitt optimalisert for canine nøytrofiler. En lignende NET kvantifisering DNA frigjøringsanalyse har også blitt beskrevet i andre arter, men fremgangsmåten som presenteres her er også optimert for hunder 8,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble utført med etisk tillatelse fra Iowa State University Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Blodprøvetaking
- Tegn 9 ml blod fra en saphena, cefalisk eller halsvenen direkte inn i antikoagulant (som etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 1,8 mg K 2 EDTA / ml blod) vacutainers, eller inn i en sprøyte med umiddelbar overføring til EDTA-inneholdende blod rør. Forsiktig rulle eller invertere blod rør for å sikre tilstrekkelig blanding av blod og antikoagulerende.
2. nøytrofile Isolation
- I et 50 ml konisk rør, blandes blodet med et likt volum av sterilt romtemperatur 3% dekstran-500 (som består i 0,9% steril saltløsning) ved forsiktig omsnuing. La stå oppreist i 18-20 minutter ved romtemperatur. Overfør stråfarget øvre lag til et nytt rør inntil det ikke lenger kan samles uten forurensning av det nedre røde lag. Erytrocyttene i the opprinnelige røret kan bli forkastet.
- Sentrifuger supernatanten ved 500 xg i 10 min ved 4 ° C. Tegn av og kast supernatanten. Manuelt re-suspen cellepelleten i 10 ml romtemperatur steril fosfatbufret saltløsning (PBS). Merk at virvling bør ikke brukes til å re-suspendere nøytrofile på ethvert stadium av denne protokollen. Manuelt å trekke av, i stedet for å helle av supernatanter er også anbefalt i løpet av protokollen for å maksimere utbyttet celle.
- Tilsett 10 ml av en romtemperatur polysucrose og natrium- diatrizoat celleseparasjons oppløsning (f.eks Histopaque 1077) til et 50 ml konisk rør. lag nøye celleholdige oppløsning over celleseparasjons løsning. Merk at ved bruk av celleseparasjons løsning som ikke er i likevekt til romtemperatur kan redusere celleutbyttet.
- Sentrifuger ved 300 xg i 30 minutter ved romtemperatur med brems.
- Som nøytrofile er i laveste laget på graderingen, trekke ut og kast upper 3 lag, sammensatt av et øvre lag av plasma og blodplater, en smal hvit bånd av mononukleære celler og et klart lag av densitetsgradient medium.
- Å lysere eventuelle gjenværende erytrocytter, re-suspendere nøytrofile pellet i 10 ml vann i romtemperatur.
- Etter 30 sek, gjenopprette tonisiteten ved tilsetning av 10 ml steril romtemperatur, 1,8% natriumklorid og bland forsiktig ved å snu.
- Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Tegn av supernatanten og kast.
- Hvis pellet er fortsatt rødt, gjenta lyseringstrinnet. Dersom pelleten er hvit (eller hvis lysis allerede er blitt utført to ganger), forsiktig resuspendere cellene i 10 ml steril PBS.
- Telle celler ved hjelp av en automatisert teller eller et hemocytometer. Typiske utbytter er minst 10 seks celler per ml blod.
- Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Tegn av supernatanten og kast.
- Resuspendere cellene til den ønskede konsentrasjon i steril PBS romtemperatur. for DNA utgivelsen analysen beskrevet i kapittel 2, resuspender på 5 x 10 6 celler per ml.
- Dersom det er ønskelig, overføre et lite volum av celler som direkte eller ved hjelp av en cytosentrifuge til en glass-slide. Tillate celler å tørke og flekken ved hjelp av en rask fiksering og farving Sett som angitt i de produserer instruksjoner. Dersom den nøytrofile isolasjon har vært vellykket, når undersøkt under mikroskop minst 95% av kjerneinneholdende cellene skal være granulocytter (neutrofiler, basofiler, eosinofiler) med minimal forurensning erytrocytt.
3. DNA Slipp analyse
- Sett opp DNA utgivelsen analysen umiddelbart etter nøytrofile isolasjon.
- Hvis celle klumping er til stede på undersøkelse av stamløsningen ved lysmikroskopi, passere cellesuspensjonen gjennom et sterilt 70 um sterilfilter umiddelbart før etablering av assayet.
- Til hver testbrønn av en steril 96 brønners plate, tilsett 5 x 10 4 celler / brønn; agonist og Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI) medium uten fenol rød, og supplementert med 0,5% varme-inaktivert føtalt kalveserum til en sluttvolum på 100-200 pl. Omfatte minst to blanke brønner pr agonist hvori nøytrofil stamløsningen er erstattet med et like stort volum av PBS. Legg merke til at du setter opp tomme brønner for hver agonist er viktig utelukker DNA forurensning av agonist eller forstyrrelser av agonist med fluorescens analysen.
- Inkuber ved 39 ° C i 30 minutter i en karbondioksyd (4%) inkubator.
- Legg agonister ved ønskede konsentrasjoner og en celle ugjennomtrengelig nukleinsyre fargestoff. Legg merke til den optimale konsentrasjonen av celle ugjennomtrengelig fargestoff vil variere mellom de forskjellige nukleinsyrefarvestoffene. Ikke-stimulerte kontroller som agonister er erstattet med et likt volum av mediet bør tas med i hvert forsøk.
Merk: Det er ønskelig å fortynne agonister i lignende mengder kulturmedium for å opprettholde konsistente forhold mellom brønner. Endelige vel volumer av 200 &# 181; l har vært brukt med hell, og hvis dette er endret, godt volum bør være identisk for alle forhold. Forbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (sluttkonsentrasjon ≥0.1 uM) eller blodplateaktiverende faktor (PAF) (sluttkonsentrasjon ≥31 uM) kan brukes som positive kontroller. Agonister bør måles i det minste i duplikat. - Inkuber ved 39 ° C. Måle fluorescensen ved anvendelse av en mikroplateleser etter 2 timer eller ved ønskede intervaller. Merk at optimale tidsintervaller vil variere med agonister brukt.
MERK: Wavelength vil avhenge av fargestoff ansatt. - Trekk blank fluorescens før beregning gjennomsnittlig fluorescens.
- For å tillate sammenligning mellom individer og mellom platene, beregne et gangers endring i fluorescens ved å dividere den midlere fluorescens av stimulerte brønner av den midlere fluorescens av ikke-stimulerte brønner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen, bør det være en sterk gangers endring i fluorescens etter å stimulere nøytrofiler med de positive kontroller, PMA og PAF. Som illustrert i figur 1B, stimulering av hjørnetann nøytrofile med 31 mikrometer PAF 1 time resulterer i en gjennomsnittlig 4,0 ganger økning i fluorescens sammenlignet med ikke-stimulerte celler (range 2,0 til 5,8, n = 5 hunder) 18. PMA ved 0,1 um (figur 1A) er en langsommere agonist som ikke resulterer i en økning i fluorescens til 2 timer, men til slutt frembringer en tilsvarende fold økning i fluorescens (gjennomsnitt: 3,3, rekkevidde 1,36 til 5,4, n = 5 hunder) 18. Til tross for sine langsommere kinetikk, er det fordeler ved å PMA som en positiv kontroll: det er relativt billig sammenlignet med høye konsentrasjoner av PAF, og det har vært mye brukt i murine og humane studier.
Fluorescens av nukleinsyrefarvestoffene er ikke specific for NET formasjon som det vil også oppstå hvis det er celledød ved andre mekanismer, eller hvis reagensene er forurenset med DNA. Som vist i figur 2, et kommersielt LPS-preparatet som fremstilles meget høy fluorescens i fravær av nøytrofiler, antagelig på grunn av forurensning med bakteriell DNA. Bekreftende NET formasjonen gjennom andre metoder som immunfluorescens anbefales.
Figur 1: PMA og PAF øker fluorescensen til en celle ugjennomtrengelig nukleinsyre fargestoff med forskjellig kinetikk Neutrofiler ble stimulert med 0,1 uM PMA (A) eller 31 pM PAF (B) i nærvær av cellen ugjennomtrengelige nukleinsyre-fargestoff.. Fluorescens ble målt ved timeintervaller og gangers endring i fluorescens av stimulerte celler sammenlignet med ikke-stimulerte celler beregnes. fluorescens økningd betydelig mellom 1 og 2 timer for PMA (gjentatt tiltak enveis ANOVA etterfulgt av flere t-tester med Bonferroni korreksjon, mangfold justerte p = 0,04; feilfelt er gjennomsnitt ± standard feil for 5 personer), men hadde allerede plateaued for PAF av 1 time. Dette tallet har blitt forandret fra Jeffery U, et al Hunder støpte NET også. Canine nøytrofile ekstracellulære feller i helse og immun-mediert hemolytisk anemi. Veterinær immunologi og immunpatologi, 168 (3-4), 262-8, doi:. 10.1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Blanke brønner er viktig å utelukke DNA forurensning eller forstyrrelser av agonist En kommersiell kilde til LPS.ble tilsatt til brønner inneholdende RPMI acellulære. Et stort ganger endring i fluorescens sammenlignet med brønner som inneholder ikke-stimulerte nøytrofiler antyder forurensning av agonist med bakteriell DNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA utgivelsen analysen som presenteres er en lett kvantifiserbare analyse for ekstracellulært DNA. Metoden ble tilpasset fra tilsvarende teknikker som brukes for å vurdere NET dannelse i andre arter, men sentrifugehastigheter, agonist konsentrasjoner og inkubasjonstider har blitt endret for å optimalisere fremgangsmåten for bruk med canine neutrofiler 8,17,18. Lignende justeringer kan foretas for å tilpasse metoden for andre arter. Analysen er enkel og billig sammenlignet med andre metoder for å måle NETosis slik som strømningscytometri eller bildeanalyse. Metoden krever heller ikke antistoffer mot NET komponenter, så er ideell for bruk i hunder for hvem kommersielt produsert, validerte arts reaktive antistoffer er ofte utilgjengelig.
Den store begrensning av fremgangsmåten er mangelen på spesifisitet av celle-ugjennomtrengelige nukleinsyrefarvestoffene for NET formasjonen. Disse fargestoffer også angi døde og døende celler, binde DNA og fluoresce. Derfor, fluorescence er ikke spesifikke for NET formasjon. Bruk av andre teknikker (f.eks immunfluorescens) i parallell med den kvantitative analysen for å visuelt bekrefte agonister indusere NET formasjon i stedet for andre former for celledød anbefales sterkt. Analysen kan også potensielt anvendes som en generell screeningsanalyse for celledød, for eksempel som et middel for å kvantifisere cytotoksisiteten ex vivo.
Protokollen er enkel, men det er kritisk trinn som er nødvendige for å sikre suksess. For det første, som nevnt i protokollen, for å unngå overdreven celletapet i løpet av nøytrofil isolasjon det er viktig at supernatantene ble trukket av med en pipette i stedet for forkastet ved å invertere rør. For det andre, suksess av analysen er avhengig av de ikke-stimulerte kontrollcellene igjen i en levedyktig og hviletilstand i hele inkuberingsperioden. Nøytrofile kan bli aktivert på noe tidspunkt under protokollen så nøye oppmerksomhet bør rettes mot atraumatisk blod samling technique og unngå traumatisk håndtering (f.eks virvling) i løpet av nøytrofile isolasjon. Det er også viktig å huske at neutrofiler har en begrenset levetid, slik forsinkelse i å isolere celler eller sette opp analysen bør unngås 19. Dersom langvarig inkubasjon med agonister er forsøkt, skal levedyktighet av ikke-stimulerte celler over denne tidsperioden bli bekreftet.
Som vist i figur 1, er det stor variasjon mellom hunder i sitt svar til NET-agonister. Imidlertid bør analysen være rimelig overensstemmelse mellom replikater fra det samme dyr, med en intra-assay variasjon på 9%, basert på 10 duplikater 18. Hvis det er store variasjoner mellom gjentak, er celle klumper sannsynlig ansvarlig. Tiltak for å redusere celleklumpdannelse omfatter opprettholdelse av cellene i PBS i stedet for en kalsiumholdig buffer før sette opp den DNA-analysen, behandling av cellene forsiktig gjennom isolasjon, og filtrering av cellelageroppheng før utplating celler.
Hvis disse trinnene, tillater denne protokollen kvantifisering av NET-dannelse i respons til et bredt spekter av eksperimentelle betingelser og agonister. Slike studier kan utdype vår forståelse av rollen av garn i hjørnetann helse og sykdom. For eksempel lar denne teknikken sammenligning av NET utgivelsen mellom friske hunder og de med immunsuppressive eller autoimmune sykdommer der NETosis kan svekkes eller styrkes. Alternativt kan, når den kombineres med andre teknikker som immunfluorescens, analysen kan anvendes for å identifisere nye agonister som er i stand til å indusere NETosis og nye inhibitorer av NETosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore? Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D.
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
