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Cancer Research

Anticancer efficacité de la thérapie photodynamique avec Lung Cancer-ciblée Nanoparticules

Published: December 1, 2016 doi: 10.3791/54865
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University Bundang Hospital, 2College of Pharmacy, Kangwon National University, 3Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University College of Medicine

Protocol

NOTE: Tous les protocoles d'études animales ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Comité institutionnel de l'hôpital Bundang Université nationale de Séoul (BA1308-134 / 072-01).

1. Synthèse de l'Acide Hyaluronique-céramide (HACE)

  1. Solubiliser 12,21 mmol d'acide hyaluronique (HA) oligomère et 9,77 mmol de tétra n - butylammonium hydroxyde (TBA) dans 60 ml d'eau distillée deux fois (DDW). On agite pendant 30 min.
  2. Pour synthétiser l'agent de liaison DS-Y30, on dissout 8,59 mmol de DS-Y30 céramide et 9,45 mmol de triéthylamine dans 25 ml de tétrahydrofuranne (THF). Mélanger avec 8,59 mmol de chlorure de 4-chlorométhylbenzoyle dans le THF. Agiter pendant 6 heures à 60 ° C.
  3. On dissout le 8,10 mmol synthétisé de HA-TBA et 0,41 mmol de liaison DS-Y30 dans un mélange de THF et d'acétonitrile (4: 1, v / v). Remuez pendant 5 heures à 40 ° C.
  4. Éliminer les impuretés par filtration avec un agent de filtration et éliminer le solvant organique par évaporation sous vide. On purifie le produit en utilisant une membrane de dialyse (poids moléculaire de coupure: 3,5 kDa) et lyophiliser.

2. Préparation des nanoparticules

  1. Dissoudre 1 mg de HB et 1 mg de paclitaxel dans 0,5 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) et mélanger avec 0,5 ml de DDW par vortex le mélange pendant 5 min. Ensuite, solubiliser HACE en ce que le mélange par tourbillons engendrés par le mélange pendant encore 5 min.
  2. Pour éliminer le solvant, la chaleur à 70 ° C pendant 4 heures sous un léger courant d'azote gazeux.
  3. Reprendre le film composé de HACE, HB, et le paclitaxel avec 1 ml de DDW. Filtrer avec un filtre à seringue (0,45 um de taille des pores) pour éliminer les médicaments non encapsulés.

3. In Vitro phototoxicité

  1. L'absorption des nanoparticules dans des lignées cellulaires de cancer du poumon
    1. Préparer (v / v) de sérum de fœtus bovin RPMI-1640 contenant 10% de milieu et 1% (p / v) de pénicilline-streptomycine.
    2. Cellules de pépins A549 dans des plaques à 24 puits de culture de cellules à une densité de 1 x 10 5 cellules / puits ( en triple pour chaquegroupe). Incuber pendant 24 heures à 37 ° C dans un CO 2 et 95% d'une atmosphère d'air humidifiée à 5%.
    3. Après la fixation des cellules, éliminer le milieu et laver les cellules en ajoutant 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    4. Dissoudre les nanoparticules dans du PBS à une concentration finale de 2 uM / ml de HB. Ensuite, incuber les cellules avec 1 ml de PBS, NPs vides, HB-NPs, ou HB-P-NPs dans chaque puits pendant 4 heures dans l'obscurité.
    5. Retirez tout de la solution et laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS froid. Répéter l'étape de lavage une fois de plus. Ajouter milieu de culture frais.
  2. test de viabilité cellulaire
    1. Placer la plaque de culture cellulaire sous la fibre PDT (avec 1 cm de distance de la fibre PDT pour le bien). Porter des lunettes de sécurité laser et illuminer les cellules avec un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) dans l'obscurité pendant diverses périodes de temps: 0, 5, 10, 20, 30, et 40 sec (0, 2, 4 , 8, 12 et 16 J / cm 2). Ensuite, incuber les cellules pendant 24 heures dans l'obscurité.
    2. Aspirer le milieu et laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS froid. Répéter l'étape de lavage une fois de plus.
    3. Ajouter 10 pi de solution cytotoxicité de mesure dans chaque puits. Incuber dans l'obscurité pendant 2 heures.
    4. Mesurer l'absorbance à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
  3. L'analyse microscopique
    1. Placer la plaque de culture cellulaire sous la fibre PDT (avec 1 cm de distance de la fibre PDT pour le bien). Porter des lunettes de sécurité laser et illuminer les cellules avec un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) dans l'obscurité pendant 0, 20, ou 40 sec (0, 8, ou 16 J / cm 2). Ensuite, incuber les cellules pendant 24 heures dans l'obscurité.
    2. Aspirer le milieu et laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS froid. Répéter l'étape de lavage une fois de plus.
    3. Ajouter 50 pi d'annexine V-FITC et 50 ul de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1,5 pg / ml). Secouer doucement la plaque et incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
      REMARQUE: Utilisez annexine V-FITC du kit fluorescence microscope.
    4. Laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS froid. Répéter l'étape de lavage une fois de plus. Gardez les cellules dans du PBS frais. Identifier les cellules apoptotiques en utilisant la microscopie optique à grossissement 100X.
  4. tri Fluorescence cellulaire activé (FACS)
    1. Placer la plaque de culture cellulaire sous la fibre PDT (avec 1 cm de distance de la fibre PDT pour le bien). Porter des lunettes de sécurité laser et illuminer les cellules avec un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) pour 0, 20, ou 40 sec (0, 8, ou 16 J / cm 2). Ensuite, incuber les cellules pendant 24 heures dans l'obscurité.
    2. Aspirer le milieu et laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS froid. Répéter l'étape de lavage une fois de plus.
    3. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 1 x tampon de liaison (dilution 1 partie du tampon de liaison 10x, 0,1 M HEPES / NaOH (pH 7,4), 1,4 M de NaCl et 25 mM de CaCl 2 à 9 parties d' eau distillée) et transférer 100 pl de la solution d'échantillon à une 5 mltube de culture.
    4. Ajouter 5 pi d'annexine V-FITC et 5 pi d'iodure de propidium (PI). vortexer doucement le tube et incuber pendant 15 min à température ambiante (RT) dans l'obscurité. Ajouter 400 pi de 1 x tampon de liaison.
      REMARQUE: Utilisez annexine V-FITC et PI à partir du kit de fluorescence au microscope.
    5. Identifier les cellules apoptotiques en utilisant FACS 14. Les rayons laser d'excitation et de l'IP à l'annexine V-FITC sont 488 nm et 635 nm, respectivement. Mesurer l'émission de fluorescence de PI et de l'annexine V-FITC à 610 ± 20 nm et 660 ± 20 nm, respectivement. Recueillir les cellules acquises sur le cytomètre de flux pour 10.000 événements.

4. anticancéreuse in vivo l' efficacité chez les souris porteuses de tumeurs

  1. modèle de souris induite par le cancer du poumon
    1. Préparer 1 × 10 6 cellules A549 dans 0,1 ml de milieu RPMI-1640; le garder dans la glace.
    2. Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de xylazine et un mélange de tilétamine et zolazépam (1: 2, 1 ml /kg). Confirmez anesthetization appropriée en pinçant doucement un petit pli de la peau de la souris. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
      NOTE: Si aucun mouvement est observé, l'animal est suffisamment anesthésié pour commencer les expériences.
    3. Injecter les cellules sous-cutanée dans les flancs gauche de BALB / C mâle souris nude (6 - 7 semaines, 20 - 22 g).
    4. Gardez l'observation de la souris jusqu'à ce qu'ils commencent à se déplacer autour de la cage.
      REMARQUE: Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré. Gardez les souris sous (SPF) conditions exempts d'agents pathogènes spécifiques.
    5. Mesurer la taille de la tumeur avec étriers tous les jours. Calculer le volume de la tumeur (mm 3) (longueur x largeur 2) / 2. Lorsque la taille de la tumeur atteint environ 200 mm3 en volume, de commencer l'expérience.
    6. Anticancer étude d'efficacité
      1. Diviser aléatoirement les souris en 4 groupes (n = 10 pour chaque groupe).
      2. Anesthésier les souris avec une injection ip d'un xylazine et un mélange de tilétamine et zolazépam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmez anesthetization appropriée en pinçant doucement un petit pli de la peau de la souris. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
        NOTE: Si aucun mouvement est observé, l'animal est suffisamment anesthésié pour commencer les expériences.
      3. Dissoudre les nanoparticules dans du PBS à une concentration finale de 2 mg / ml de HB. Injecter PBS, libre HB, HB-NPs, ou HB-P-NPs via la veine de la queue (2 mg / kg comme HB) deux fois aux jours 0 et 7.
      4. Gardez l'observation de la souris jusqu'à ce qu'ils commencent à se déplacer autour de la cage.
        REMARQUE: Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à leur entièrerétabli. Gardez les cages sombres et dans des conditions SPF spécifiques.
      5. 24 heures après chaque injection, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de xylazine et un mélange de tilétamine et zolazépam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmez anesthetization appropriée en pinçant doucement un petit pli de la peau de la souris. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
        NOTE: Si aucun mouvement est observé, l'animal est suffisamment anesthésié pour commencer les expériences.
      6. Placer le site de la tumeur sous la fibre de TPD (1 cm de distance de la fibre TPD à la tumeur). Porter des lunettes de sécurité laser, éteindre l'interrupteur, et illuminer la tumeur avec un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) pour 500 sec (200 J / cm 2) deux fois aux jours 1 et 8.
      7. Gardez l'observation de la souris jusqu'à ce qu'ils commencent à se déplacer autour de la cage. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne retournez pas un animal qui a undergonchirurgie de e à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce que complètement rétabli.
      8. Gardez les cages dans des conditions SPF. Maintenir les cages dans l'obscurité pendant 24 heures après le traitement au laser.
      9. contrôler visuellement le volume de la tumeur et les changements au niveau du site de la tumeur chaque jour. Mesurer la taille de la tumeur avec des étriers, et calculer le volume que (longueur x largeur 2) / 2 (mm 3). Prenez des photos de sites tumoraux tous les jours pour vérifier les modifications de la surface de la tumeur après PDT.
      10. Le jour 16, sacrifier cinq souris par groupe par l'anesthésie terminaux utilisant l'isoflurane.
      11. Avec des pinces et des ciseaux, couper la peau extérieure et exposer les tumeurs 15. les récolter avec précaution. Les fixer dans 10% de formaline, les incorporer dans de la paraffine, et les tacher avec de l' hématoxyline et de l' éosine (H & E) pour l'analyse histologique 16.
      12. Après 45 jours de surveillance, sacrifier les souris restantes par l'anesthésie terminaux utilisant l'isoflurane.

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Representative Results

Nous avons préparé deux HB-NPs et HB-P-NPs avec les techniques mentionnées ci-dessus. Les diamètres moyens de HB-NPs et HB-P-NPs étaient 220,9 ± 3,2 nm et 211,9 ± 1,6 nm, respectivement.

La viabilité cellulaire des cellules A549 après 4 heures d'incubation avec du PBS, NPs vides, HB-NPs et HB-P-NPs suivie d' une irradiation de lumière (0 à 16 J / cm 2) est représentée sur la figure 1. Sans lumière, le groupe de traitement HB-PN n'a montré aucune cytotoxicité du tout, tandis que les cellules HB-P-NP-traités ont montré 81,28 ± 0,14% de la viabilité cellulaire. Cela peut être dû à l'effet anti-cancéreux du paclitaxel, qui a été libéré des nanoparticules. Sous PDT, la viabilité cellulaire a été diminuée en fonction de la durée d'exposition à la lumière dans les deux HB-NP- et les cellules HB-P-NP-traitée. Les cellules HB-P-NP-traités ont montré une augmentation phototoxicité que le groupe HB-PN dans les mêmes conditions d'irradiation. Quand 16 J / cm 2 l'irradiation a été donné, seulement 7,52 ± 0,38% des cellules survivent dans le groupe de traitement HB-P-NP.

Les résultats cohérents ont été visualisées avec l' annexine V-FITC coloration (figure 2). Les cellules apoptotiques PDT induites ont été colorées avec l'annexine V-FITC, exprimant la fluorescence verte. Le signal le plus fort de la fluorescence verte a été détectée dans les cellules HB-P-NP-traitée dans les mêmes conditions d'irradiation.

Les étapes de cellules apoptotiques induites par HAP ont été classés par cytométrie de flux. En double-coloration avec l'annexine V-FITC et PI, les premières cellules apoptotiques (seulement annexine V-FITC positif), fin apoptotique des cellules (les deux annexine-V et PI positif) et les cellules nécrotiques (uniquement PI positif) ont été distingués. Dans les mêmes conditions TPD, la partie des cellules apoptotiques tardives a augmenté dans le groupe HB-P-NP-traitées (figure 3).

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> la croissance tumorale in vivo chez des souris porteuses de tumeurs pulmonaires après une double injection intraveineuse de PBS, libre HB, HB-NPs et HB-P-NPs suivie d' une irradiation de lumière est représentés sur la figure 4. les surfaces des sites tumoraux ont également été examinés (figure 5). les souris HB-P-NP-traités a montré les réactions les plus rapides, y compris l' hémorragie et de nécrose, et la croissance tumorale la plus lente. en outre, une analyse histologique a confirmé la la plupart des cellules tumorales sévèrement endommagées étaient dans le groupe de traitement HB-P-NP (figure 6).

Figure 1
Figure 1:. In vitro phototoxicité des cellules A549 cellules A549 ont été traitées avec du PBS, NPs vides, HB-NPs, ou HB-P-NPs et irradiation de lumière a été donnée pour 0, 5, 10, 20, 30 ou 40 sec (0, 2, 4, 8, 12 ou 16 J / cm 2). Sous til en même temps d'irradiation, le groupe de traitement HB-P-NP a montré phototoxicité plus élevé que le groupe de traitement HB-NP. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart - types (SD, n = 3). *** P <0,001 par rapport au groupe traité par le PBS. ## P <0,01, ### p <0,001 par rapport au groupe de traitement HB-NP. Adapté de Chang et al. 10 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. Cellules A549 analyse microscopique des cellules apoptotiques A549 ont été traités avec du PBS, HB-NPs ou HB-P-NPs et irradiation de lumière a été donnée pour 0, 2 ou 4 J / cm 2. Le double-tache de DAPI (bleu, première colonne) et annexine V-FITC (vert, deuxième colonne) indiquent les noyauxet les cellules apoptotiques, respectivement. Les cellules HB-P-NP-traités ont montré des signaux de fluorescence verte plus fortes que les cellules HB-NP-traités dans les mêmes conditions d'irradiation, ce qui indique une phototoxicité beaucoup plus élevé. Barre d'échelle = 200 um, grossissement = 100X. Adapté de Chang et al. 10 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Cellules A549 Analyse FACS des apoptotiques cellules A549 ont été traités avec du PBS, HB-NPs, ou HB-P-NPs et irradiation de lumière a été donnée pour 0, 2 ou 4 J / cm 2. Les cellules ont été classés en quatre groupes. I) Les deux annexine V-FITC et les cellules PI-négatives sont considérées ii) des cellules intactes, annexine V-FITC-positifs et PI-négativesont apoptotique précoce, iii) à la fois l' annexine V-FITC et les cellules PI-positives sont en retard apoptotique, et iv) les cellules annexine V-FITC-négatives et PI-positifs sont soit en retard apoptotique ou nécrotique. Conformément à l'analyse microscopique, dans les mêmes conditions d'irradiation, les cellules HB-P-NP-traités ont montré une phototoxicité plus élevée que les cellules HB-NP-traitées, et les niveaux de cellules apoptotiques tardives ont été augmentées. Adapté de Chang et al. 10 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:. Tumor Volume Surveillance des A549 souris porteuses de tumeurs aux jours 0 et 7, les doubles injections de PBS, sans HB, HB-NPs et HB-P-NPs ont été réalisées. Le PDT (200 J / cm 2) était performed 1 jour après chaque injection, les jours 1 et 8. Les traitements ont montré des niveaux différents de l'effet thérapeutique, avec HB <HB-NPs <HB-P-NPs. Au jour 45, le groupe de traitement HB-P-PN a montré une diminution significative du volume de la tumeur par rapport aux autres groupes. Les valeurs sont présentées en moyenne ± écart - types (SD; n = 4). Le volume de la tumeur (mm 3) a été définie comme (longueur x largeur 2) / 2. Adapté de Chang et al. 10 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5:. Les modifications de surface sur le site de la tumeur des A549 souris porteuses de tumeurs Les sites tumoraux ont été suivis après doubles injections intraveineuses (aux jours 0 et 7) de PBS, libre HB, HB-NPs et HB-P-NPs avec 200 J / cm irradiation lumineuse 2 1 jour après chaque injection (les jours 1 et 8). Tant le HB-NPs et les groupes de traitement HB-P-NPs ont commencé à montrer des réactions au lendemain de la première PDT. Le groupe de traitement HB-P-NPs a montré une hémorragie sévère et le développement le plus rapide de la nécrose. Adapté de Chang et al. 10 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6:. L' analyse histologique des tissus tumoraux chez A549 Des souris portant une tumeur au jour 16, la confirmation histologique a été réalisée par une coloration H & E de tissus tumoraux excisés. Le groupe de traitement HB-P-PN a démontré la mort des cellules de la tumeur la plus complète. Barre d'échelle = 500 um, grossissement = 40X. Adapté de Chang et al. 10 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'étape la plus critique dans cette étude est de choisir les conditions de laser appropriés: longueur d'onde, la puissance et le temps d'irradiation. La longueur d'onde appropriée de lumière appropriée pour le photosensibilisateur spécifique est nécessaire pour la PDT. Nous avons utilisé un laser 630-nm qui était approprié pour hypocrelline B. La puissance de sortie est un autre facteur important, qui a été fixé à 400 mW / cm 2 sur la base de nombreuses études pilotes. Puissances de sortie supérieures à 400 mW / cm 2 endommagé les cellules ou la surface de la peau des animaux en raison de l'irradiation elle-même, alors que des puissances de sortie inférieures à 400 mW / cm 2 étaient trop faibles pour montrer un effet thérapeutique. Les temps d'irradiation appropriées in vitro et des études in vivo étaient de 40 secondes (16 J / cm 2) et 500 secondes (200 J / cm2), respectivement. La distance de la fibre TPD aux cellules ou aux tissus tumoraux des modèles animaux est également un facteur déterminant dans cette étude. Pour couvrir l'ensemble de la cellule ou de la surface de la tumeur avec lelumière, 1 cm a été trouvé pour être la distance optimale.

Si un photosensibilisant différent est appliqué, l'utilisation de la bonne longueur d'onde de la lumière peut maximiser l'efficacité PDT. Le temps de puissance de sortie et l'irradiation doit être fixé par essais et erreurs. Lorsque la surface de la peau commence à brûler lors de l'irradiation par la lumière, la puissance de sortie doit être inférieure. Lorsque la surface de la tumeur montre aucun changement du jour après la PDT, cela peut indiquer la nécessité d'augmenter la puissance de sortie.

Cette méthode a des limites. Tout d'abord, bien que la distance entre la fibre TPD à la cible est un facteur important dans la présente étude, il est difficile d'assurer l'homogénéité. La distance peut varier légèrement, car elle est contrôlée par l'homme. Deuxièmement, pour le modèle animal avec des tumeurs dans des organes tels que les poumons, ce protocole est difficile à appliquer puisque l'endoscopie est nécessaire et inévitable mouvement respiratoire.

Bien que la résection chirurgicale est le premieroption pour le traitement du cancer du poumon, TPD présente plusieurs avantages comme un autre traitement non invasive et non chirurgicale. Lorsque l'opération ne convient pas, comme dans plusieurs cas de lésion, PDT peut être une option valable. En outre, préopératoire PDT peut réduire la taille de la tumeur et réduire l'ampleur de la chirurgie 17. HAP a moins d'effets secondaires par rapport à la chirurgie, la radiothérapie ou la curiethérapie endobronchique. En outre, la PDT est sans rapport avec des mutations qui confèrent une résistance à la radiothérapie ou la chimiothérapie 18.

Dans cette étude, nous avons proposé deux poumon nanoparticules cancéreuses ciblées médicaments encapsulés photosensitizer- et anticancéreuses comme un système de livraison de photosensibilisant roman pour la PDT. Ce concept peut être appliqué à d'autres photosensibilisateurs et des médicaments anticancéreux.

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Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par aucune subvention. 14-2014-017 du Fonds pour la recherche SNUBH.

Les auteurs remercient J. Patrick Barron, professeur émérite, Université de médecine de Tokyo et professeur adjoint, Hôpital Bundang Université nationale de Séoul pour sa pro bono édition de ce manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
oligo hyaluronic acid Bioland Co., Ltd. _
DS-Y30 (ceramide 3B; mainly N-oleoyl-phytosphingosine) Doosan Biotech Co., Ltd. _
adipic acid dihydrazide Sigma Aldrich A0638
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Sigma Aldrich 39391
4-(chloromethyl)benzoyl chloride Sigma Aldrich 270784
Tween 80 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. T0546
syringe filter Sartorius Stedim Biotech GmbH 17762 15 mm, RC, PP, 0.45 µm
triethylamine Sigma Aldrich T0886
Mini-GeBAflex tubes Gene Bio-Application Ltd. D070-12-100
Paclitaxel Taihua Corporations _
RPMI-1640 Gibco Life Technologies, Inc. 11875
Penicillin–streptomycin Gibco Life Technologies, Inc. 15070
Fetal bovine serum Gibco Life Technologies, Inc. 16140071
Celite (Filter agent) Sigma Aldrich 6858 See step 1.4

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References

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