Protocol
注：すべての動物実験プロトコルは、盆唐ソウル大病院（BA1308-134 / 072から01）の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
ヒアルロン酸セラミドの1の合成（HACE）
- 二重蒸留水（DDW）の60ミリリットルでヒアルロン酸の12.21ミリモル（HA）オリゴマー及びテトラn個の -butylammonium水酸化物（TBA）の9.77ミリモルを可溶化します。 30分間撹拌しました。
- DS-Y30リンカーを合成するために、テトラヒドロフラン25ミリリットル（THF）中のDS-Y30セラミドの8.59ミリモルおよびトリエチルアミン9.45ミリモルを溶解します。 THF中の4-クロロメチルベンゾイルクロリドの8.59ミリモルと混合。 60℃で6時間撹拌します。
- THFの混合物及びアセトニトリルでDS-Y30リンカーの合成されたHA-TBAの8.10ミリモル及び0.41ミリモル溶解（4：1、v / v）でした。 40℃で5時間撹拌します。
- フィルター剤で濾過することにより不純物を除去し、真空蒸着法により、有機溶媒を除去します。 （透析膜を使用して生成物を精製分子量カットオフ：3.5キロダルトン）および凍結乾燥。
ナノ粒子の作製
- HB 1mgのジメチルスルホキシド（DMSO）0.5mlのパクリタキセル1mgを溶解し、ボルテックス混合し、5分間によってDDW 0.5mlでブレンド。その後、さらに5分間ボルテックス混合することにより、その混合物中のHACEを可溶化します。
- 窒素ガスの穏やかな流れの下で4時間、70℃で溶剤、熱を除去するために。
- DDW 1mlでHACE、HBからなる膜、及びパクリタキセルを再懸濁します。封入されていない薬物を除去するために、シリンジフィルター（孔径0.45μm）でフィルタします。
3. インビトロ光毒性
- 肺癌細胞株中のナノ粒子の取り込み
- RPMI-1640培地を含む10％の（v / v）のウシ胎児血清および1％（w / v）のペニシリン - ストレプトマイシンを準備します。
- 1×10 5細胞/ウェルの各々について（三連の密度で24ウェル細胞培養プレート中の種子A549細胞グループ）。加湿5％CO 2及び95％空気雰囲気中37℃で24時間インキュベートします。
- 細胞付着後に、培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を1ml添加して細胞を洗浄します。
- 2μM/ mlのHBの最終濃度になるようにPBS中のナノ粒子を溶解させます。その後、暗所で4時間、各ウェルにPBS、空のNP、HB-のNP、またはHB-P-NPの1ミリリットルで細胞を培養します。
- ソリューションのすべてを削除し、冷PBSの1ミリリットルを追加することによって、細胞を洗浄。もう一度洗浄工程を繰り返します。新鮮な培地を追加します。
- 細胞生存率アッセイ
- （ウェルにPDTファイバからの距離から1cmで）PDT繊維の下で細胞培養プレートを置きます。レーザー安全メガネを着用し、種々の時間暗所でPDTレーザー（630 nmで、400ミリワット/ cm 2）を用いて細胞を照らす：0、5、10、20、30、および40秒（0、2、4 、8、12、16 J / cm 2）でした。その後、暗所で24時間細胞をインキュベートします。
- 培地を吸引し、冷PBSを1mlを加えることによって細胞を洗浄します。もう一度洗浄工程を繰り返します。
- 各ウェルに細胞毒性測定溶液10μlを加えます。 2時間暗所でインキュベートします。
- マイクロプレートリーダーを用いて450nmで吸光度を測定します。
- 顕微分析
- （ウェルにPDTファイバからの距離から1cmで）PDT繊維の下で細胞培養プレートを置きます。レーザー安全メガネを着用し、0、20、または40秒（0、8、または16 J / cm 2）を、暗所でのPDTレーザー（630 nmで、400ミリワット/ cm 2）を用いて細胞を照らします。その後、暗所で24時間細胞をインキュベートします。
- 培地を吸引し、冷PBSを1mlを加えることによって細胞を洗浄します。もう一度洗浄工程を繰り返します。
- アネキシンV-FITCを50μlと4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI、/ mlの1.5μgの）の50μLを加えます。静かにプレートを振る、暗所で室温で15分間静置します。
注：アネキシンV-FIを使用してください蛍光顕微鏡キットからTC。 - 冷PBSの1ミリリットルを追加することによって、細胞を洗浄。もう一度洗浄工程を繰り返します。新鮮なPBSで細胞を保管してください。 100Xの倍率で光学顕微鏡を用いて、アポトーシス細胞を識別します。
- （FACS）分析、蛍光活性化細胞選別
- （ウェルにPDTファイバからの距離から1cmで）PDT繊維の下で細胞培養プレートを置きます。レーザー安全メガネを着用し、0、20、または40秒（0、8、または16 J / cm 2）をするためのPDTレーザー（630 nmで、400ミリワット/ cm 2）を用いて細胞を照らします。その後、暗所で24時間細胞をインキュベートします。
- 培地を吸引し、冷PBSを1mlを加えることによって細胞を洗浄します。もう一度洗浄工程を繰り返します。
- 転送100μlを、1×結合緩衝液1mlに細胞を再懸濁（0.1MのHepes / NaOHで（pHは7.4）、1.4 MのNaCl、および25mMのCaCl 2 9重量部を蒸留水10×結合緩衝液の1部を希釈） 5ミリリットルの試料溶液の培養管。
- アネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウム（PI）を5μlの5μlを添加します。静かにチューブをボルテックスし、暗所で室温（RT）で15分間インキュベートします。 1×結合緩衝液の400μlのを追加します。
注：蛍光顕微鏡キットから、アネキシンV-FITCおよびPIを使用してください。 - FACS 14を使用して、アポトーシス細胞を識別します。 PIおよびアネキシンV-FITCの励起レーザー線は、それぞれ、488 nmおよび635 nmです。それぞれ、610±20 nmおよび660±20 nmでPIとアネキシンV-FITCの蛍光発光を測定します。 10,000事象ごとのフローサイトメーター上で獲得した細胞を収集します。
担癌マウスのin vivo抗腫瘍効果4.
- 肺癌誘発性マウスモデル
- 0.1ミリリットルRPMI-1640培地に1×10 6 A549細胞を準備し;氷の中に保管してください。
- キシラジンの腹腔内注射およびチレタミンとゾラゼパム（1の混合物をマウスに麻酔：2、1ミリリットル/kg）。優しくマウスの皮膚の小さな倍をつまんで適切な麻酔を確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
注：移動が観察されない場合、動物は、実験を開始するのに十分な麻酔です。 - （ - 7週齢、20〜22グラム6）BALB / C雄ヌードマウスの左脇腹に皮下細胞を注入します。
- 彼らはケージの周りに移動を開始するまで、マウスを観察してください。
注：それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。それは完全に回復するまで他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。特定病原体フリー（SPF）の条件下でマウスを保管してください。 - 毎日ノギスで腫瘍の大きさを測定します。腫瘍サイズが体積で約200ミリメートル3に達したとき（長さ×幅2）/ 2として腫瘍体積（mm 3で）を計算し 、実験を開始します。
- 抗がん効果の研究
- 無作為に4群（各群n = 10）にマウスを分けます。
- （：2、1ミリリットル/キログラム1）キシラジンの腹腔内注射およびチレタミンとゾラゼパムの混合物をマウスに麻酔。優しくマウスの皮膚の小さな倍をつまんで適切な麻酔を確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
注：移動が観察されない場合、動物は、実験を開始するのに十分な麻酔です。 - 2 mg / mlでのHBの最終濃度になるようにPBS中にナノ粒子を溶解します。 0日と7日に二回、尾静脈（HBとしての2mg / kg）を介して、PBS、無料のHB、HB-のNP、またはHB-P-のNPを注入します。
- 彼らはケージの周りに移動を開始するまで、マウスを観察してください。
注：それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。完全になるまで他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。回収されました。暗く、特定のSPF条件下でケージを保管してください。 - （：2、1ミリリットル/キログラム1）各注射後24時間は、キシラジンおよびチレタミンとゾラゼパムの混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔します。優しくマウスの皮膚の小さな倍をつまんで適切な麻酔を確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
注：移動が観察されない場合、動物は、実験を開始するのに十分な麻酔です。 - （腫瘍に対するPDTファイバからの距離から1cmで）PDT繊維の下に腫瘍部位を配置します。 、レーザー安全メガネを着用してスイッチをオフにして、1日目と8日に二回500秒（200 J / cm 2）をするためのPDTレーザー（630 nmで、400ミリワット/ cm 2）を用いて腫瘍を照らします。
- 彼らはケージの周りに移動を開始するまで、マウスを観察してください。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。 undergonを持つ動物を返さないでください。他の動物の会社に電子手術は完全に回復するまで。
- SPF条件下でケージを保管してください。レーザー治療後24時間暗所でケージを維持します。
- 視覚的に毎日の腫瘍体積と腫瘍部位での変化を監視します。ノギスで腫瘍の大きさを測定し、（長さ×幅2）/ 2（ミリメートル3）などの体積を計算します。 PDT後の腫瘍表面変化を確認するために、毎日の腫瘍部位の写真を撮ります。
- 16日目には、イソフルランを用いて、端末麻酔によって群当たり5匹のマウスを生け贄に捧げます。
- 鉗子やハサミで、外側の皮膚をカットし、腫瘍15を露出させます。慎重にそれらを収穫。 、10％ホルマリンでそれらを修正し、パラフィン中にそれらを埋め込む、組織学的分析16のためにヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）でそれらを染色します。
- モニタリングの45日後に、イソフルランを用いて、端末麻酔によって残りのマウスを生け贄に捧げます。
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Representative Results
私たちは、上記の技術とHB-のNPとHB-P-NPの両方を用意しました。 HB-のNPとHB-P-NPの平均直径はそれぞれ220.9±3.2 nmおよび211.9±1.6nmでした。
光照射（0〜16 J / cm 2）を、続いてPBS、空のNP、HB-のNP、及びHB-P-のNPとのインキュベーションの4時間後のA549細胞の細胞生存率は、光がない。 図1に示されています、 HB-P-NPで処置した細胞は、81.28±0.14％の細胞生存率を示したHB-NP処置群は、全く細胞毒性を示しませんでした。これは、ナノ粒子から放出されたパクリタキセルの抗癌効果、に起因する可能性があります。 PDTの下で、細胞生存率は、HB-NP-及びHB-P-NPで処理した細胞の両方における露光時間に応じて減少しました。 HB-P-NPで処理した細胞は、同一の照射条件下でHB-NPの群より増加した光毒性を示しました。とき16 J / cm 2の照射を与えられた、細胞の唯一の7.52±0.38％がHB-P-NP処置群で生存しました。
一貫した結果は、アネキシンV-FITC染色（ 図2）を用いて可視化しました。 PDT誘発性アポトーシス細胞は緑色蛍光を発現し、アネキシンV-FITCで染色しました。最も強い緑色蛍光シグナルは、同一の照射条件下でHB-P-NP処理細胞で検出されました。
PDT誘発性アポトーシス細胞の段階はフローサイトメトリーにより分類しました。アネキシンV-FITCおよびPI、早期アポトーシス細胞（のみアネキシンV-FITC陽性）との二重染色、後期アポトーシス細胞（アネキシンVおよびPI陽性の両方）および壊死細胞（PIのみ正）によって区別されました。同じPDT条件下で、後期アポトーシス細胞の一部は、HB-P-NPで処置した群（ 図3）に増加しました。
「FO：キープtogether.withinページ= "1">の肺腫瘍を有するマウスのインビボ腫瘍増殖に PBS、無料のHB、HB-のNP、およびHB-P-NPの二重の静脈注射は、光照射した後であり、 図4に示す。腫瘍部位の表面も、試験した（ 図5）。HB-P-NPで処置したマウスは、出血および壊死、ならびに最も遅い腫瘍成長を含む、最速の反応を示した。また、組織学的分析を確認最も深刻な損傷を受けた腫瘍細胞は、HB-P-NP処置群（ 図6）でした。
図1： インビトロ 光毒性A549細胞の A549細胞を、PBS、空のNP、HB-のNP、またはHB-P-NPを、光照射で処理し、0、5、10、20、30、または40秒間与えられました（0、2、4、8、12、又は16 J / cm 2）でした。トンの下で彼は、同じ照射時間、HB-P-NP処置群は、HB-NPの治療群よりも高い光毒性を示しました。 （; N = 3 SD）値は平均±標準偏差として表しています。 *** PBS処置群と比較してp <0.001、。 HB-NPの治療群と比較して## P <0.01、### p <0.001。 Chang ら 10から適応この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2： アポトーシスA549細胞の顕微鏡分析 A549細胞を、PBS、HB-のNPまたはHB-P-NPを用いて処理し、光照射を0に与えられた、2または4 J / cm 2です。 DAPI（青、最初の列）およびアネキシンV-FITC（緑、第二カラム）の二重染色は核を示しますアポトーシス細胞、それぞれ。 HB-P-NPで処置した細胞は、非常に高い毒性を示し、同一の照射条件下でのHB-NPで処理した細胞よりも強い緑色蛍光シグナルを示しました。スケールバー= 200μmで、倍率= 100X。 Chang ら 10から適応この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3： アポトーシスA549細胞のFACS分析 A549細胞を、PBS、HB-のNP、またはHB-P-NPを用いて処理し、光照射を0に与えられた、2または4 J / cm 2です。細胞は、4つのグループに分類した。ⅰ）アネキシンV-FITC-との両方PI陰性細胞が損傷していないと考えられていること、ii）アネキシンV-FITC陽性及びPI陰性細胞は、初期アポトーシス、ⅲ）アネキシンV-FITC-両方とPI陽性細胞が後期アポトーシスであり、およびiv）アネキシンV-FITC陰性およびPI陽性細胞が後期アポトーシスまたは壊死性のいずれかされています。顕微鏡分析によれば、同一の照射条件下で、HB-P-NPで処置した細胞は、HB-NPで処理した細胞よりも高い光毒性を示し、および後期アポトーシス細胞レベルが増加しました。 Chang ら 10から適応この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：A549 腫瘍を有するマウスの腫瘍体積モニタリング 0日と7日、PBS、無料のHB、HB-のNP、およびHB-P-NPの二重注射を行いました。 PDT（200 J / cm 2）をperforましたMED 1日各注射の後、1日目および8に治療法は、<HB-NPは<HB-P-NPをHBで、治療効果の異なるレベルを示しました。 45日目に、HB-P-NPの処置群は、有意に、他のグループと比較して腫瘍体積の減少を示しました。 （; N = 4 SD）値±標準偏差を意味するように提示されます。腫瘍体積（mm 3では ）（長さ×幅2）Chang ら 10からの適用/ 2と定義した。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：A549 腫瘍を有するマウスの腫瘍サイト上の表面変化は、腫瘍部位は、二重の静脈内注射後にモニターした（0日および7）PBS、無料のHB、HB-のNP、およびHB-の200 J / cm 2の光照射各注射後1日でP-NPを（1日目と8に）。 HB-のNPとHB-P-NPの処置群の両方が反応を最初PDT後の日を示し始めました。 HB-P-NPの処置群は、重度の出血および壊死の最速の開発を示しました。 Chang ら 10から適応この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：A549 腫瘍を有するマウスにおける腫瘍組織の組織学的分析は、16日目に、組織学的確認は、摘出した腫瘍組織のH＆E染色によって行いました。 HB-P-NPの処置群は、最も完全な腫瘍細胞死を示しました。スケールバー= 500μmで、倍率= 40X。チャンらから適応10 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
波長、パワー、照射時間：この研究の中で最も重要なステップは、適切なレーザー条件を選択されています。特定の光増感剤に適した光の適切な波長は、PDTのために必要です。私たちは、出力電力が多くのパイロット研究に基づいて400ミリワット/ cm 2に設定したもう一つの重要な要因であったヒポクレリンBについて適切であった630 nmのレーザーを使用していました。 400 mWの/ cm 2の下の出力電力は、任意の治療効果を示すにはあまりにも弱であったが400mW / cm 2とを超える出力パワーは、照射による自体に細胞または動物の皮膚表面を損傷しました。 インビトロおよびインビボ研究における適切な照射時間は、それぞれ40秒（16 J / cm 2）で500秒（200 J / cm 2）でした。 PDT繊維由来の細胞または動物モデルの腫瘍組織への距離も、この研究における重要な因子でした。でセル全体または腫瘍の表面を覆うように光は1センチ最適な距離であることが見出されました。
異なる光増感剤が適用される場合、光の適切な波長の使用は、PDTの有効性を最大化することができます。出力パワーと照射時間は、試行錯誤を介して固定する必要があります。皮膚表面は、光照射時にバーンを開始すると、出力電力が低く設定する必要があります。腫瘍表面はPDT後の終日に変化を示さない場合は、出力電力を増加させる必要性を示すことができます。
この方法は、いくつかの制限を有します。ターゲットへPDTファイバからの距離が、この研究で重要な因子であるが、最初に、均一性を確保することは困難です。それは人間によって制御されているので距離が若干異なる場合があります。第二に、肺などの臓器における腫瘍を有する動物モデルのために、このプロトコルは、内視鏡検査が必要であり、呼吸運動不可避ため適用することは困難です。
外科的切除が第一ですが肺癌を治療するためのオプション、PDTは、非侵襲的で非外科的代替治療として、いくつかの利点を有します。操作は、このような複数の病変例のように、適切でない場合には、PDTは、有効なオプションをすることができます。また、術前のPDTは、腫瘍サイズを減少させ、手術17度を減少させることができます。 PDTは、手術、放射線療法、または気管支内近接照射療法と比較してより少ない副作用を有します。さらに、PDTは、放射線療法または化学療法18への耐性を与える突然変異とは無関係です。
本研究では、PDTのための新規光増感デリバリーシステムとしてphotosensitizer-と抗癌剤カプセル化肺癌標的ナノ粒子の両方を示唆しました。この概念は、他の光増感剤と抗癌剤に適用することができます。
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Acknowledgments
この研究は、助成金なしによってサポートされていました。 SNUBH研究基金から14-2014-017。
著者は、この原稿の彼のプロボノ編集のためにJ.パトリック・バロン、名誉教授、東京大学医科大学と非常勤講師、盆唐ソウル大病院にお世話になっています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| oligo hyaluronic acid | Bioland Co., Ltd. | _ | |
| DS-Y30 (ceramide 3B; mainly N-oleoyl-phytosphingosine) | Doosan Biotech Co., Ltd. | _ | |
| adipic acid dihydrazide | Sigma Aldrich | A0638 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide | Sigma Aldrich | 39391 | |
| 4-(chloromethyl)benzoyl chloride | Sigma Aldrich | 270784 | |
| Tween 80 | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | T0546 | |
| syringe filter | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 17762 | 15 mm, RC, PP, 0.45 µm |
| triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Mini-GeBAflex tubes | Gene Bio-Application Ltd. | D070-12-100 | |
| Paclitaxel | Taihua Corporations | _ | |
| RPMI-1640 | Gibco Life Technologies, Inc. | 11875 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco Life Technologies, Inc. | 15070 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Inc. | 16140071 | |
| Celite (Filter agent) | Sigma Aldrich | 6858 | See step 1.4 |
References
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