Protocol
NOTA: Todos los protocolos de los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Hospital Bundang Universidad Nacional de Seúl (BA1308-134 / 072-01).
1. Síntesis de ácido hialurónico-ceramida (ECA)
- Solubilizar 12,21 mmol de ácido hialurónico oligómero (HA) y 9,77 mmol de hidróxido de tetra- n -butilamonio (TBA) en 60 ml de agua doblemente destilada (DDW). Se agita durante 30 min.
- Para sintetizar el enlazador DS-Y30, se disuelven 8,59 mmoles de ceramida DS-Y30 y 9.45 mmol de trietilamina en 25 ml de tetrahidrofurano (THF). Mezclar con 8,59 mmol de cloruro de 4-clorometilbenzoilo en THF. Se agita durante 6 horas a 60 ° C.
- Se disuelve el 8,10 mmol sintetizado de HA-TBA y 0,41 mmol de enlazador DS-Y30 en una mezcla de THF y acetonitrilo (4: 1, v / v). Se agita durante 5 horas a 40 ° C.
- Eliminar las impurezas mediante el filtrado con un agente de filtro, y eliminar el disolvente orgánico por evaporación a vacío. Se purifica el producto usando una membrana de diálisis (peso molecular de corte: 3,5 kDa) y se liofiliza.
2. Preparación de las nanopartículas
- Disolver 1 mg de HB y 1 mg de paclitaxel en 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se mezclan con 0,5 ml de DDW por vórtice de mezcla durante 5 min. Entonces, solubilizar HACE en la mezcla por vórtice mezcla durante otros 5 min.
- Para eliminar el disolvente, el calor a 70 ° C durante 4 h bajo una corriente suave de gas nitrógeno.
- Resuspender la película compuesta de ECA, HB, y paclitaxel con 1 ml de DDW. Filtrar con un filtro de jeringa (0,45 micras de tamaño de poro) para eliminar los medicamentos no encapsulados.
3. En Vitro fototoxicidad
- La adopción de las nanopartículas en líneas celulares de cáncer de pulmón
- Preparar (v / v) de suero RPMI-1640 10% que contenía medio-bovino fetal y 1% (w / v) de penicilina-estreptomicina.
- Células A549 semillas en placas de cultivo celular de 24 pocillos a una densidad de 1 x 10 5 células / pocillo (por triplicado para cadagrupo). Incubar durante 24 horas a 37 ° C en una atmósfera de aire de CO2 y 95% al 5% humidificado.
- Después de la unión celular, se elimina el medio y se lavan las células mediante la adición de 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Disolver las nanopartículas en PBS a una concentración final de 2 M / ml HB. A continuación, se incuban las células con 1 ml de PBS, NP vacías, HB-PN, o HB-P-NP en cada pocillo durante 4 horas en la oscuridad.
- Quitar toda la solución y se lavan las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más. Añadir medio de cultivo fresco.
- ensayo de viabilidad celular
- Coloque la placa de cultivo celular debajo de la fibra TFD (con 1 cm de distancia de la fibra PDT para el bienestar). Use gafas de seguridad láser e iluminar las células con un láser PDT (630 nm, 400 mW / cm2) en la oscuridad durante varios períodos de tiempo: 0, 5, 10, 20, 30 y 40 segundos (0, 2, 4 , 8, 12, y 16 J / cm 2). A continuación, se incuban las células durante 24 horas en la oscuridad.
- Aspirar el medio y lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más.
- Añadir 10 l de solución de medición citotoxicidad a cada pocillo. Incubar en la oscuridad durante 2 hr.
- Medir la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas.
- El análisis microscópico
- Coloque la placa de cultivo celular debajo de la fibra TFD (con 1 cm de distancia de la fibra PDT para el bienestar). Use gafas de seguridad láser e iluminar las células con un láser PDT (630 nm, 400 mW / cm2) en la oscuridad durante 0, 20, o 40 segundos (0, 8, o 16 J / cm2). A continuación, se incuban las células durante 24 horas en la oscuridad.
- Aspirar el medio y lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más.
- Añadir 50 l de anexina V-FITC y 50 l de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1,5 mg / ml). Agitar suavemente la placa y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
NOTA: Utilice la anexina V-FITC del kit microscopio de fluorescencia. - Lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más. Mantener las células en PBS fresco. Identificar las células apoptóticas utilizando un microscopio óptico a un aumento de 100X.
- clasificación de células activadas por fluorescencia análisis (FACS)
- Coloque la placa de cultivo celular debajo de la fibra TFD (con 1 cm de distancia de la fibra PDT para el bienestar). Use gafas de seguridad láser e iluminar las células con un láser PDT (630 nm, 400 mW / cm2) durante 0, 20, o 40 segundos (0, 8, o 16 J / cm2). A continuación, se incuban las células durante 24 horas en la oscuridad.
- Aspirar el medio y lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más.
- Resuspender las células en 1 ml de tampón de unión 1 x (diluir 1 parte del tampón de unión 10x; 0,1 M Hepes / NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl, y 25 mM CaCl 2 a 9 partes de agua destilada) y la transferencia de 100 l de la solución de muestra a una 5-mltubo de cultivo.
- Añadir 5 l de anexina V-FITC y 5 l de yoduro de propidio (PI). vórtice suavemente el tubo y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad. Añadir 400 l de tampón de unión 1 ×.
NOTA: Utilice la anexina V-FITC y PI del kit microscopio de fluorescencia. - Identificar las células apoptóticas mediante FACS 14. Las líneas de láser de excitación de PI y la anexina V-FITC son 488 nm y 635 nm, respectivamente. Medir la emisión de fluorescencia del PI y la anexina V-FITC a 610 ± 20 nm y 660 ± 20 nm, respectivamente. Recoger las células adquiridas en el citómetro de flujo por cada 10.000 eventos.
4. Eficacia in vivo contra el cáncer en ratones portadores de tumores
- modelo de ratón inducida por el cáncer de pulmón
- Preparar 1 × 10 6 células A549 en 0,1 ml de medio RPMI-1640; mantenerlo en hielo.
- Anestesiar a los ratones con una inyección ip de un xilazina y una mezcla de tiletamina y zolazepam (1: 2, 1 ml /kg). Confirmar la anestesia adecuada pellizcando suavemente un pequeño pliegue de piel de ratón. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
NOTA: Si no se observa movimiento, el animal es suficientemente anestesiado para comenzar los experimentos. - Inyectar las células por vía subcutánea en los flancos izquierdo de / C macho ratones desnudos BALB (6 - 7 semanas de edad, 20 - 22 g).
- Mantener la observación de los ratones hasta que empiezan a moverse alrededor de la jaula.
NOTA: No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. Mantener a los ratones bajo condiciones libres de patógenos específicos (SPF). - Medir el tamaño del tumor con calibres cada día. Calcular el volumen del tumor (mm 3) como (longitud x anchura 2) / 2. Cuando el tamaño del tumor alcanza aproximadamente 200 mm 3 en volumen, iniciar el experimento.
- estudio de eficacia contra el cáncer
- Aleatoriamente dividir los ratones en 4 grupos (n = 10 para cada grupo).
- Anestesiar a los ratones con una inyección ip de un xilazina y una mezcla de tiletamina y zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmar la anestesia adecuada pellizcando suavemente un pequeño pliegue de piel de ratón. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
NOTA: Si no se observa movimiento, el animal es suficientemente anestesiado para comenzar los experimentos. - Disolver las nanopartículas en PBS a una concentración final de 2 mg / ml HB. Se inyecta PBS, libre de HB, HB-PN, o HB-P-NP a través de la vena de la cola (2 mg / kg como HB) dos veces en los días 0 y 7.
- Mantener la observación de los ratones hasta que empiezan a moverse alrededor de la jaula.
NOTA: No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta su completarecuperado. Mantener las jaulas oscuridad y bajo condiciones SPF específicos. - 24 horas después de cada inyección, anestesiar a los ratones con una inyección ip de un xilazina y una mezcla de tiletamina y zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmar la anestesia adecuada pellizcando suavemente un pequeño pliegue de piel de ratón. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
NOTA: Si no se observa movimiento, el animal es suficientemente anestesiado para comenzar los experimentos. - Coloque el sitio del tumor bajo la fibra PDT (de 1 cm de distancia de la fibra PDT al tumor). Use gafas de seguridad láser, apague el interruptor, e iluminar el tumor con un láser PDT (630 nm, 400 mW / cm2) durante 500 seg (200 J / cm2) dos veces en los días 1 y 8.
- Mantener la observación de los ratones hasta que empiezan a moverse alrededor de la jaula. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que tiene undergone cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
- Mantener las jaulas en condiciones SPF. Mantener las jaulas en la oscuridad durante 24 horas después de tratamiento con láser.
- supervisar visualmente el volumen del tumor y los cambios en el sitio del tumor cada día. Medir el tamaño del tumor con calibradores, y calcular el volumen como (longitud x anchura 2) / 2 (mm 3). Tome fotografías de los sitios tumorales todos los días para verificar si hay alteraciones de la superficie del tumor después de la TFD.
- En el día 16, sacrificar cinco ratones por grupo con anestesia terminales utilizando isoflurano.
- Con pinzas y tijeras, corte la piel exterior y exponer los tumores 15. Cuidadosamente la cosecha. Fijarlos en formalina al 10%, incrustarlos en parafina, y teñirlos con hematoxilina y eosina (H & E) para el análisis histológico 16.
- Después de 45 días de seguimiento, sacrificar los ratones restantes por la anestesia terminales utilizando isoflurano.
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Representative Results
Preparamos tanto HB-PN y HB-P-NP con las técnicas mencionadas anteriormente. Los diámetros medios de HB-NPs y HB-P-NP fueron 220,9 ± 3,2 nm y 211,9 ± 1,6 nm, respectivamente.
La viabilidad celular de las células A549 después de 4 horas de incubación con PBS, NP vacías, HB-PN, y HB-P-NP seguido de irradiación de luz (de 0 a 16 J / cm2) se muestra en la Figura 1. Sin luz, la grupo de tratamiento HB-NP no mostró citotoxicidad en absoluto, mientras que las células tratadas con HB-P-NP mostraron 81,28 ± 0,14% de viabilidad celular. Esto puede ser debido al efecto contra el cáncer de paclitaxel, que se libera de las nanopartículas. En virtud de la TFD, la viabilidad celular se redujo de acuerdo con el tiempo de exposición a la luz tanto en HB-NP y las células-P-NP-HB tratada. Las células tratadas-HB-P-NP mostraron un aumento de fototoxicidad que el grupo HB-NP en las mismas condiciones de irradiación. Cuando 16 J / cm 2 fue dado de irradiación, solamente 7,52 ± 0,38% de las células sobrevivió en el grupo de tratamiento HB-P-NP.
Los resultados consistentes se visualizaron con tinción de anexina V-FITC (Figura 2). Las células apoptóticas inducidas por el PDT fueron teñidas con anexina V-FITC, expresando fluorescencia verde. Se detectó la señal de fluorescencia verde más fuerte en las células-P-NP tratados con HB en las mismas condiciones de irradiación.
Las etapas de las células apoptóticas inducidas por el PDT se clasificaron por citometría de flujo. Haciendo doble tinción con anexina V-FITC y PI, las primeras células apoptóticas (sólo anexina V-FITC positivo), a finales de apoptosis de células (tanto anexina V y PI-positivo) y células necróticas (solamente pi positivo) se distinguieron. En las mismas condiciones PDT, la porción de células apoptóticas finales se incrementó en el grupo tratado con HB-P-NP (Figura 3).
"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> In vivo el crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores de pulmón después de la inyección intravenosa de doble PBS, libre de HB, HB-PN, y HB-P-NP seguido de irradiación de luz es muestran en la Figura 4. también se examinaron las superficies de los sitios de tumor (Figura 5). los ratones tratados con HB-P-NP mostró las reacciones más rápidas, incluyendo hemorragia y necrosis, y el crecimiento del tumor más lento. además, el análisis histológico confirmó la la mayoría de las células tumorales severamente dañadas estaban en el grupo de tratamiento HB-P-NP (Figura 6).
Figura 1:. In vitro La fototoxicidad de las células A549 células A549 se trataron con PBS, NP vacías, HB-PN, o HB-P-PN, y la irradiación de luz se le dio por 0, 5, 10, 20, 30, o 40 sec (0, 2, 4, 8, 12, o 16 J / cm 2). bajo tél mismo tiempo de irradiación, el grupo de tratamiento HB-P-NP mostró fototoxicidad más alto que el grupo de tratamiento HB-NP. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (SD, n = 3). *** P <0,001, en comparación con el grupo tratado con PBS. ## P <0,01, ### p <0,001, en comparación con el grupo de tratamiento HB-NP. Adaptado de Chang et al. 10 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: las células A549. Análisis microscópico de las células A549 apoptóticas fueron tratados con PBS, HB-NPs o HB-P-PN, y la irradiación de luz se dan para 0, 2, o 4 J / cm 2. La doble tinción de DAPI (azul, primera columna) y la anexina V-FITC (verde, segunda columna) indican núcleosy células apoptóticas, respectivamente. Las células tratadas-HB P NP-mostraron fuertes señales de fluorescencia verde que las células tratadas con HB-NP en las mismas condiciones de irradiación, lo que indica una fototoxicidad mucho mayor. Barra de escala = 200 m, ampliación = 100X. Adaptado de Chang et al. 10 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: células A549. Análisis FACS de las células A549 apoptóticas fueron tratados con PBS, HB-PN, o HB-P-PN, y la irradiación de luz se dan para 0, 2, o 4 J / cm 2. Las células se clasificaron en cuatro grupos. I), tanto de anexina V-FITC y células PI-negativos se consideran ii) células en buen estado, anexina V-FITC y PI positivas-negativasson apoptótica temprana, iii) tanto de anexina V-FITC y PI-células positivas son finales apoptótica, y iv) células anexina V-FITC-negativos y PI-positivas son o finales de apoptosis o necrosis. De acuerdo con el análisis microscópico, en las mismas condiciones de irradiación, las células tratadas-HB P NP-mostraron fototoxicidad más alta que las células tratadas-HB-NP, y se aumentaron los niveles de células apoptóticas tardías. Adaptado de Chang et al. 10 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El tumor se realizaron monitorización del volumen de A549 ratones portadores del tumor en los días 0 y 7, las dobles inyecciones de PBS, libre de HB, HB-PN, y HB-P-NP: Figura 4.. El PDT (200 J / cm2) fue performed 1 día después de cada inyección, los días 1 y 8. Los tratamientos mostraron diferentes niveles de efecto terapéutico, con HB <HB-NPs <HB-P-NPs. En el día 45, el grupo de tratamiento HB-P-NPs mostró una disminución significativa del volumen del tumor en comparación con los otros grupos. Los valores se presentan como media ± desviación estándar (SD, n = 4). El volumen del tumor (mm3) se define como (longitud x anchura 2) / 2. Adaptado de Chang et al. 10 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. Las alteraciones superficiales en la zona del tumor de A549 ratones portadores del tumor Los sitios tumorales fueron controlados después de las inyecciones intravenosas dobles (en los días 0 y 7) de PBS, libre de HB, HB-PN, y HB-P-NP con 200 J / cm2 de irradiación de luz 1 día después de cada inyección (en los días 1 y 8). Tanto el los grupos de tratamiento HB-P-NP NP-HB y comenzaron a mostrar reacciones al día siguiente de la primera TFD. El grupo de tratamiento HB-P-PN mostró una hemorragia severa y el desarrollo más rápido de la necrosis. Adaptado de Chang et al. 10 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6:. El análisis histológico de los tejidos tumorales A549 en ratones portadores del tumor en el día 16, la confirmación histológica fue realizada por una mancha de H & E de los tejidos tumorales extirpados. El grupo de tratamiento HB-P-NP demostró la muerte de células tumorales más completa. Barra de escala = 500 m, ampliación = 40X. Adaptado de Chang y col. 10 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El paso más crítico en este estudio es la selección de las condiciones apropiadas láser: longitud de onda, potencia y tiempo de irradiación. La longitud de onda apropiada de luz adecuada para el fotosensibilizador específica es necesaria para la PDT. Se utilizó un láser de 630 nm que era apropiado para hipocrelina B. La potencia de salida era otro factor importante, que se fijó en 400 mW / cm2 sobre la base de muchos estudios piloto. Potencias de salida superior a 400 mW / cm2 dañadas las células o la superficie de la piel de los animales debido a la propia irradiación, mientras potencias de salida por debajo de 400 mW / cm2 eran demasiado débiles para mostrar ningún efecto terapéutico. Los tiempos de irradiación apropiados para la in vitro y en estudios in vivo fueron 40 seg (16 J / cm 2) y 500 seg (200 J / cm 2), respectivamente. La distancia de la fibra de PDT a las células o a los tejidos tumorales de los modelos animales también fue un factor crítico en este estudio. Para cubrir toda la célula o de la superficie del tumor con elluz, de 1 cm se encontró que la distancia óptima.
Si se aplica un fotosensibilizador diferente, el uso de la longitud de onda apropiada de la luz puede maximizar la eficacia de PDT. El tiempo de la potencia de salida y la irradiación debe ser fijado a través de ensayo y error. Cuando la superficie de la piel empieza a quemarse durante la irradiación de luz, la potencia de salida debe ser más baja. Cuando la superficie del tumor no muestra ningún cambio en absoluto el día después de la TFD, puede indicar la necesidad de aumentar la potencia de salida.
Este método tiene algunas limitaciones. En primer lugar, aunque la distancia de la fibra de PDT a la diana es un factor importante en este estudio, es difícil asegurar la uniformidad. La distancia puede variar ligeramente debido a que se controla por los seres humanos. En segundo lugar, para el modelo animal con tumores en órganos tales como el pulmón, este protocolo es difícil de aplicar ya que es necesario endoscopia y movimiento respiratorio inevitable.
Aunque la resección quirúrgica es la primeraopción para el tratamiento de cáncer de pulmón, PDT tiene varias ventajas como un tratamiento alternativo no invasivo y no quirúrgico. Cuando la operación no es apropiada, tal como en los casos de lesiones múltiples, la TFD puede ser una opción válida. Además, la TFD preoperatoria puede reducir el tamaño del tumor y disminuir el grado de la cirugía 17. PDT tiene menos efectos secundarios en comparación con la cirugía, la radioterapia o braquiterapia endobronquial. Además, PDT es irrelevante a mutaciones que proporcionan resistencia a la terapia de radiación o quimioterapia 18.
En este estudio, hemos sugerido ambas nanopartículas cáncer de pulmón encapsulado orientada a los fármacos contra el cáncer y photosensitizer- como un nuevo sistema de administración fotosensibilizador para PDT. Este concepto puede ser aplicado a otros fotosensibilizadores y medicamentos contra el cáncer.
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Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por ninguna concesión. 14-2014-017 del Fondo de Investigación SNUBH.
Los autores están en deuda con J. Patrick Barron, Profesor Emérito de la Universidad Médica de Tokio y Profesor Adjunto, Hospital Bundang Universidad Nacional de Seúl, por su pro bono edición de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| oligo hyaluronic acid | Bioland Co., Ltd. | _ | |
| DS-Y30 (ceramide 3B; mainly N-oleoyl-phytosphingosine) | Doosan Biotech Co., Ltd. | _ | |
| adipic acid dihydrazide | Sigma Aldrich | A0638 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide | Sigma Aldrich | 39391 | |
| 4-(chloromethyl)benzoyl chloride | Sigma Aldrich | 270784 | |
| Tween 80 | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | T0546 | |
| syringe filter | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 17762 | 15 mm, RC, PP, 0.45 µm |
| triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Mini-GeBAflex tubes | Gene Bio-Application Ltd. | D070-12-100 | |
| Paclitaxel | Taihua Corporations | _ | |
| RPMI-1640 | Gibco Life Technologies, Inc. | 11875 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco Life Technologies, Inc. | 15070 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Inc. | 16140071 | |
| Celite (Filter agent) | Sigma Aldrich | 6858 | See step 1.4 |
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