Summary
建立B-LCLS一个简单的红细胞裂解法与高效率的永生化开发，需要的少量血液，并节省了时间，从开始到冷冻保存。
Protocol
该研究得到了中国科学院遗传与发育生物学研究所的伦理委员会，协议遵循人类福利制度的指导方针。
1，EB病毒的制备
- 在第1天，解冻B95-8细胞和培养在6毫升的完全RPMI 1640培养基中，辅以10％胎牛血清，2mM的L-谷氨酰胺，和抗生素（100微克/ mL链霉素，100U / mL青霉素） T25培养瓶中。放置在5％CO 2培养箱中培养瓶在37℃。
- 第2天，观察在显微镜下细胞形态。细胞处于良好状态的时候都亮又圆。加入10 mL完全RPMI 1640培养基。
- 第4天，加入10毫升新鲜完整的RPMI 1640培养基，然后转移到T75培养瓶中。
- 在第8天，加入20毫升完全RPMI 1640培养基中。
- 保持了8天的细胞不加入新鲜培养基， 即 ，饥饿。
- 在第16天，观察细胞在显微镜下观察。收集在15毫升离心管中，12毫升/管细胞。
- 在-80℃下冷冻保存1小时，然后在37℃下迅速解冻。重复3次，直到病毒颗粒从细胞中释放出来。
- 离心在240 xg离心在室温下10分钟。
- 通过0.22微米的过滤器，分装，12毫升/管，并储存在-80℃下进行过滤上清液。
2.红细胞裂解液全血治疗
- 添加0.5mL的全血用EDTA·K 2抗凝到15毫升管中。
- 把1毫升红细胞裂解液（使用前由0.22微米的过滤器过滤，解冻到室温），以全血拌匀。放置在室温下将混合物4分钟。很快7毫升1X PBS到停止反应 - 再加入5。
- 离心在240 xg离心在室温下5分钟。白血细胞将沉淀在试管的底部。
- 弃去上清液，并通过加入7毫升1640基本培养基洗涤沉淀。在室温下以240 xg离心离心5分钟。重复两次。
- 重悬在300微升变换介质将细胞沉淀（RPMI 1640培养基，含20％胎牛血清和10μg/ mL的植物凝集素（PHA））。
3. EBV感染
- 添加60微升20微克/毫升环孢菌素A（CSA）的细胞悬浮液。
- 在37℃下迅速解冻EB病毒的等分试样。添加240微升EB病毒的细胞悬浮液。
- 拌匀细胞悬液放置到96孔平板，200微升每孔。为了避免蒸发，添加200μL的1×PBS中，以每个孔周围的96孔板的。放置在一个5％CO 2培养箱板在37℃。
4，B-LCLS的扩展与冷冻保存
- 每周改变一半培养基一次EBV感染后的第一个月。只有厚厚的拉曳细胞碎片的r是在第7天（ 图2）在显微镜下可见。 EBV感染一个月后，淋巴母细胞簇是下细胞碎片的显微镜（ 图2）下的厚层可见。
- 改变一半培养基每3天直到细胞簇显然显微镜（ 图2）下可见。通常，此过程需要10到20天。
- 混合后，吸管将细胞并转移到24孔板中。双重文化介质的体积完全RPMI 1640，而它变成黄色。这个过程依赖于细胞生长的速率。
- 随后，转移细胞T25培养瓶中。一倍培养基的体积，因为它会变成黄色，直到介质的体积膨胀到10 - 15毫升。
- 冷冻前更改中24小时。离心细胞悬浮液在240×g下5分钟。算用细胞计数器和冷冻细胞以5的密度-在FR 10×10 6 / mL的含90％FBS和10％二甲基亚砜（DMSO）澳升原液。冻结，以每分钟1℃〜-80℃的速率，然后直接转移到液氮中。
5. 3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-2,5-二苯基四唑鎓溴化物（MTT）测定17
- 制备B-LCLS单细胞悬浮液用含10％胎牛血清的1640培养基中。每孔到96-孔板种子3×10 4个细胞，每孔100μl。
- 放置在5％CO 2培养箱板在37℃下为12 - 16小时。
- 添加MTT（5毫克/毫升），其中细胞生长的孔，并从光远离4小时，在37℃。
- 离心细胞板在168×g下10分钟。
- 除去上清液，每孔加入100μLDMSO。
注意：要小心。请勿触摸针状晶体染料。 - 振摇10分钟板以低速完全溶解结晶。
- 在由570纳米测量的吸收使用微板分光光度计。
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Representative Results
在转化过程中，细胞的形态变化是通过光学显微镜（ 图2）可视化。细胞的小群分别与7天后感染的密度梯度分离法清晰可见，而只有细胞碎片的一厚层是从红血细胞裂解方法可见。然而，类淋巴母细胞的细胞群是细胞碎片的厚层30天后感染下可见。更频繁更换培养基，细胞碎片减少和细胞簇是清楚可见的和呈现由密度梯度分离方法建立的相同的图像。
当细胞系成功建立，MTT测定法来评价B-LCLS的可行性。根据文献17中 ，通过不同的方法建立的B-LCLS被选择来检测细胞活力和1640培养基用作空白对照。数据表明，与红细胞裂解法建立的B-LCLS的细胞生存力大于从密度梯度分离方法（ 图3）的B-LCLS的细胞活力显著更高。
图1.程序的流程图。抗凝血剂的血液EBV感染接着加入环孢素前用红细胞溶解缓冲液处理。在感染的B细胞在37℃下在5％CO 2的存在下，建立和随后展开的B-LCLS生长。 请点击此处查看该图的放大版本。
网络连接在EB病毒转化过程中的细胞形态学变化的古尔2.可视化。左侧是B-LCLS由红细胞裂解法用0.5ml外周血建立，并且细胞碎片减少随着时间的推移。右侧示出了由密度梯度分离法，用2.5毫升的血液样本建立的细胞系。比例尺为10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图为不同方法建立的B-LCLS细胞活力3.比较。每个条表示平均值±SD。结果表明，有两种方法（p值= 0.014）之间显著差异。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们报告的新方法的发展，为通过裂解红血细胞永生化从全血中的人类B细胞，和建立的B-LCLS通过MTT法测定其细胞生存力。结果表明，由红血细胞裂解法建立的B-LCLS的细胞存活率比密度梯度分离方法的高得多。红血细胞裂解方法的主要优点是，它是简单的，并且需要的血液小体积（低至0.5毫升）建立一个永久的细胞系具有高成功率和高细胞生存力。
只有EBV感染之前，还需要一个简单的裂解步骤。未经淋巴细胞先前纯化，细胞损失和细胞损伤被避免。密度梯度分离方法的另一个障碍是溶血。处理血液后在不适当的温度下长期贮存和运输过程中晃动可导致溶血，WHICH将极大地影响淋巴细胞的隔离。其它的研究表明，使用的红血细胞（RBC）裂解导致更高数目的活的PBMC比使用密度梯度分离方法18和淋巴细胞亚型基本上不19影响的。用密度梯度分离法，这是昂贵的和繁琐的相比，红血细胞裂解方法是非常容易，尤其是用于治疗大量的临床样品和新手更实用。
在研究中，我们通过使用红细胞裂解法的永生化24个样品以100％的成功率。与由冻存淋巴细胞报告的成功率和新鲜分离的淋巴细胞的90-94％变为20 2 - 2.5毫升的血液，这成功率要高得多。同时，我们还转化新鲜（0.5mL）中或在不经分离的引用14,15描述冻结（甚至1mL）中的血液，并在efficien变换的CY比报告16（数据未显示）低得多。
本策略不仅提高了效率，永生化显著，而且还降低了血液建立B-LCLS所需的量。对EBV转化现有的技术使用相对大量的外周血约2 - 2.5毫升血液20分离淋巴细胞而有些则需要10毫升或更多10,21。与此相反，以0.5毫升的全血，以获得与此处描述的方法的永生化细胞系需要的。该方法可以被修改以成功永生化从手指采血刺12，这样可以大大促进从小儿患者和老年保护遗传资源。
此外，通过红血细胞裂解法建立的B-LCLS的细胞活力是比上述密度梯度分离法的高。红细胞升ysis方法避免了在密度梯度离心，这将导致对细胞不可修复损伤的过程中机械离心力。这表明，红血细胞裂解方法是更合适的遗传和功能研究，其尽可能快需要细胞大量越好。我们的方法将减少从文化开始到冷冻保存，时间将节约资源，减少劳动力。
红血细胞裂解方法的一个可能限制是污染从红血细胞裂解物衍生的碎屑，这会阻止变换的清楚观察前四周EBV感染的存在。然而，这种碎片会逐渐与介质的变化去掉。另一个限制是生长中的转化的细胞的损失，但是这可以通过在头四个星期变换的除去上清液的一半得到改善。另一种可能的修改，以除去杂质是更具有较大体积或由10毫升1×PBS中洗涤该细胞系两次，然后在168 xg离心离心5分钟以除去杂质频繁介质变化。
总之，该协议提供了用于以高永生化效率建立的B-LCLS，降低血液体积和保存启动和冻存之间的时间的简单策略。在本研究中开发的细胞系生物材料提供了宝贵的和具有成本效益源开展各项研究。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
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