Summary
En enkel röda blodkroppar lyseringsmetoden för att upprätta B-LCL utvecklades med hög immortalisering effektivitet, vilket kräver en liten mängd blod och sparar tid från initiering till kryokonservering.
Protocol
Studien godkändes av den etiska kommittén för Institutet för genetik och utvecklingsbiologi, och protokollet följer de institutionella riktlinjerna för människors välfärd.
1. Framställning av EB-virus
- På dag 1, tina B95-8-celler och odling i 6 ml fullständigt RPMI 1640-medium, kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin och antibiotika (100 | ig / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin) i en T25 odlingskolv. Placera odlingskolven i 5% CO2 inkubator vid 37 ° C.
- På dag 2, observera cellmorfologin i mikroskop. Cellerna är i gott skick när de är ljusa och runda. Tillsätt 10 ml fullständigt RPMI 1640-medium.
- På dag 4, tillsätt 10 ml färskt fullständigt RPMI 1640-medium, och sedan överföra till en T75 odlingskolv.
- På dag 8, tillsätt 20 ml fullständigt RPMI 1640-medium.
- Bibehålla cellerna i 8 dagar utan att lägga färskt medium, dvs svält.
- På dag 16, observera cellerobserveras under mikroskop. Samla upp cellerna i en 15 ml centrifugrör, 12 ml / rör.
- Cryo-bevara vid -80 ° C under 1 h, och sedan snabbt tina vid 37 ° C. Upprepa 3 gånger till dess att viruspartiklar frisätts från cellerna.
- Centrifugera vid 240 xg under 10 min vid rumstemperatur.
- Filtrera supernatanten genom ett 0,22 ^ m filter, alikvot, 12 ml / rör, och förvara vid -80 ° C.
2. Behandling av helblod med röda blodkroppar Lysis Buffer
- Tillsätt 0,5 ml helblod antikoagulerat med EDTA · K 2 till ett 15 ml rör.
- Sätt 1 ml röda blodkroppar lysbuffert (filtrerad genom 0,22 um filter och tinades till rumstemperatur före användning) till helblod och blanda väl. Placera blandningen i rumstemperatur under 4 min. Lägg sedan till 5-7 ml 1x PBS snabbt stoppreaktionen.
- Centrifugera vid 240 xg under 5 min vid rumstemperatur. Vita blodkroppar kommer att utfällas vid botten av röret.
- Kassera supernatanten och tvätta utfällningen genom att tillsätta 7 ml 1640 basiskt medium. Centrifugera i 5 minuter vid 240 xg vid rumstemperatur. Upprepa två gånger.
- Resuspendera cellpelleten i 300 | il transformationsmedium (RPMI 1640-medium, innehållande 20% fetalt bovint serum och 10 mikrogram / ml fytohemagglutinin (PHA)).
3. EBV-infektion
- Lägga 60 mikroliter av 20 mikrogram / ml cyklosporin A (CsA) till cellsuspensionen.
- Snabbt tina en alikvot av EBV vid 37 ° C. Lägga 240 mikroliter EBV till cellsuspensionen.
- Blanda väl och placera cellsuspensionen till en 96-brunnars platta, 200 pl per brunn. För att undvika avdunstning, tillsätt 200 | il 1 x PBS till varje brunn runt i 96-brunnar. Placera plattan i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C.
4. Expansion och Kryokonservering av B-LCL
- Ändra hälften av mediet en gång per vecka för den första månaden efter EBV-infektion. Endast en tjock layer från cellfragment är synliga under mikroskop vid dag 7 (Figur 2). Efter en månad av EBV-infektion, lymfoblastoida cellkluster är synliga under ett tjockt lager av cellfragment under mikroskop (Figur 2).
- Ändra hälften av mediet var 3 dagar tills cellkluster är klart synliga under mikroskop (Figur 2). Typiskt tar denna process 10 till 20 dagar.
- Efter blandning pipet cellerna och överför till 24-brunnar. Fördubbla volymen av odlingsmediet med komplett RPMI 1640 medan den blir gul. Denna process beror på hastigheten av celltillväxt.
- Därefter överföra celler till T25 odlingskolv. Fördubbla volymen odlingsmedium som det visar gult tills volymen av mediet expanderar till 10 - 15 ml.
- Ändra medel 24 timmar före frysning. Centrifugera cellsuspensionen i 5 minuter vid 240 x g. Räkna celler med en cellräknare och frys vid en densitet av 5 - 10 x 10 6 / ml i frOzen stamlösning innehållande 90% FBS och 10% dimetylsulfoxid (DMSO). Fryser vid en hastighet av 1 ° C per min till -80 ° C och sedan överföra direkt i flytande kväve.
5. 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) -analys 17
- Förbereda en B-LCL enkelcellsuspension med 1640-medium innehållande 10% fetalt bovint serum. Frö 3 x 10 4 celler per brunn på 96-brunnars platta, 100 pl per brunn.
- Placera plattan i 5% CO2 inkubator vid 37 ° C under 12-16 h.
- Lägg MTT (5 mg / ml) till brunnarna i vilka celler växer och hålla sig borta från ljus under 4 timmar vid 37 ° C.
- Centrifugera cellplattan under 10 min vid 168 x g.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 100 mikroliter DMSO per brunn.
OBS: Var försiktig. Rör inte nålformade dye kristaller. - Skaka plattan under 10 min vid låg hastighet för att fullständigt lösa upp kristallerna.
- Åtgärd absorption vid 570 nm medmed användning av en mikroplatt spektrofotometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under omvandlingsprocessen, är de morfologiska förändringarna av celler visualiserades genom Ijusmikroskopi (figur 2). Små kluster av celler var klart synliga med densitetsgradient separationsmetoden efter 7 dagars infektion, medan endast ett tjockt lager av cellfragment är synliga från de röda blodkropparna lysmetod. Emellertid lymfoblastoida cellkluster är synliga under tjockt lager av cellfragment 30 dagar efter infektion. Med kortare intervall förändring, celldebris minskar och cellkluster är klart synliga och presentera samma bild som fastställts av densitetsgradient separationsmetod.
När cellinjer etablerades framgångsrikt, var MTT-analysen användes för att utvärdera viabiliteten hos B-LCL. Enligt litteraturen 17, var B-LCL inrättats genom olika metoder väljs för att detektera cellviabiliteten och 1640 medium användes som blankprov. Data indikerar att cellviabiliteten av B-LCL upprättas med den röda blodkroppar lyseringsmetoden är betydligt högre än cellviabiliteten av B-LCL från densitetsgradient separationsmetoden (figur 3).
Figur 1. flödesschema över processen. Antikoagulerande blodet behandlas med röda blodkroppar lyseringsbuffert före EBV-infektion, följt av tillsats av CsA. De infekterade B-celler odlas vid 37 ° C i närvaro av 5% CO2 för att upprätta och därefter expandera B-LCL. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
figur 2. Visualisering av cellulära morfologiska förändringar i processen av EBV Transformation. Den vänstra är B-LCL fastställts av röda blodkroppar lysering med 0,5 ml perifert blod, och cellrester minskar med tiden. Höger visar cellinjer som fastställts av densitetsgradient separationsmetod med 2,5 ml blodprov. Skala bar är 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Jämförelse av cellviabilitet för B-LCL Etablerad av olika metoder. Varje stapel representerar medelvärde ± SD. Resultaten visar att det fanns signifikant skillnad mellan de två metoderna (p = 0,014). Klicka häratt se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterar utvecklingen av ett nytt förfarande för immortalisering av humana B-celler från helblod genom att lysera röda blodkroppar, och dess cellviabiliteten av etablerade B-LCL utvärderades genom MTT-analysen. Resultaten visade att cellviabiliteten av B-LCL fastställts av röda blodkroppar lyseringsmetoden är mycket högre än den hos densitetsgradienten separationsmetoden. Den stora fördelen med den röda blod cellys metoden är att den är enkel och kräver en liten volym (så lite som 0,5 ml) av blod för att upprätta en permanent cellinje med ett bra resultat och hög cellviabilitet.
Endast en enkel lyssteget behövs innan EBV-infektion. Utan föregående rening av lymfocyterna är cellförlust och cellskador undviks. Ett annat hinder för densitetsgradient separationsmetoden är hemolys. Bearbeta blodet efter långtidslagring vid olämplig temperatur och skakningar under transport kan leda till hemolys, which kommer att kraftigt påverka isolering av lymfocyter. Andra studier har visat att användning av röda blodkroppar (RBC) lys resulterade i högre antal livskraftiga PBMC än användningen av densitetsgradient separationsmetod 18 och lymfocyt subtyper påverkades inte väsentligt 19. Jämfört med densitetsgradient separationsmetoden, vilket är kostsamt och besvärligt, är den röda blodkroppar lyseringsmetoden mycket lättare, i synnerhet för behandling av ett stort antal av de kliniska proven och mer praktiskt för nybörjare.
I studien har vi förevigat 24 prover med en 100% framgång med hjälp av röda blodkroppar lys metod. Jämfört med 90-94% av framgång rapporterats av kryokonserverade lymfocyter och nyisolerade lymfocyter 20 med 2-2,5 ml blod, är denna framgång mycket högre. Under tiden, vi transformerade också färska (0,5 ml) eller frysta (även 1 ml) blod såsom beskrivs i referenser 14,15 utan separation, och efficiency av omvandling är mycket lägre än vad som rapporterats 16 (data visas ej).
Den nuvarande strategin inte bara förbättrar immortalisering effektivitet avsevärt, men också minskar den mängd blod som krävs för att etablera B-LCL. Nuvarande teknik för EBV-transformation använda relativt stora volymer av perifert blod, ca 2-2,5 ml blod 20 för att isolera lymfocyter medan andra kräver 10 ml eller mer 10,21. Detta står i kontrast till de 0,5 ml av helblod behövs för att erhålla en immortaliserad cellinje med den här beskrivna metoden. Denna metod kan modifieras för att framgångsrikt föreviga blod från finger pricks 12, vilket i hög grad skulle kunna underlätta bevara genetiska resurser från pediatriska patienter och äldre.
Dessutom cellviabiliteten av B-LCL fastställts av röda blodkroppar lyseringsmetoden är högre än den hos densitetsgradienten separationsmetoden. Den röda blodkroppar llys metod undviker den mekaniska centrifugalkraft i processen för densitetsgradientcentrifugering, vilket orsakar icke-reparerbar skada på cellerna. Det tyder på att de röda blodkropparna lyser metoden är mer lämplig för genetiska och funktionella studier, vilket kräver ett stort antal celler så snabbt som möjligt. Vår metod kommer att minska tiden från kultur initiering till frysförvaring, vilket kommer att spara resurser och minska arbete.
En möjlig begränsning av den röda blodkroppen lysmetoden är närvaron av kontaminerande skräp härrörande från röda blod cellysat, vilket skulle blockera tydlig observation av omvandling i de första fyra veckorna av EBV-infektion. Detta kommer dock att skräp gradvis avlägsnas med mediumbyten de. En annan begränsning är förlusten av växande transformerade celler, men detta kan förbättras genom att avlägsna hälften av supernatanten under de första fyra veckorna av transformation. En annan möjlig modifiering för att avlägsna föroreningar är merfrekventa medel förändringar med större volymer eller tvätta cellinjer två gånger med 10 ml 1 x PBS och sedan centrifugera vid 168 xg under 5 minuter för att avlägsna föroreningar.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll en enkel strategi för att fastställa B-LCL med hög immortalisering effektivitet, sänkta blodvolymen och sparar tid mellan initiering och frysförvaring. Cellinjerna som utvecklats i föreliggande studie ger en värdefull och kostnadseffektiv källa till biomaterial utföra olika studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
- Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
- Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118 (2006).
- Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
- Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
- Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
- Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
- Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
- Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
- Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
- Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
- Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
- Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
- Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
- Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
- Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
- Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
- Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
- Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22 (2007).
