Summary
En simpel lyse af røde blodlegemer fremgangsmåde til etablering B-LCLS blev udviklet med høj immortalisering effektivitet, kræver en lille mængde blod og sparer tid fra start til kryopræservering.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for Institut for Genetik og Developmental Biology, og protokollen følger de institutionelle retningslinjer for menneskelig velfærd.
1. Fremstilling af EB Virus
- På dag 1, tø B95-8-celler og kultur i 6 ml komplet RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin og antibiotika (100 ug / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin) i en T25 dyrkningskolbe. Placer dyrkningskolbe i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- På dag 2 observere cellemorfologien under et mikroskop. Celler er i god stand, når de er lyse og runde. Tilsæt 10 ml komplet RPMI 1640 medium.
- På dag 4, tilsættes 10 ml frisk komplet RPMI 1640 medium, og derefter overføre til en T75 kultur kolbe.
- På dag 8, tilsættes 20 ml komplet RPMI 1640 medium.
- Opretholde cellerne i 8 dage uden tilsætning af frisk medium, dvs. sult.
- På dag 16, observere cellerobserveret under mikroskopet. Opsamle cellerne i et 15 ml centrifugerør, 12 ml / rør.
- Cryo-bevare ved -80 ° C i 1 time, og derefter hurtigt tø op ved 37 ° C. Gentag 3 gange indtil viruspartikler frigøres fra cellerne.
- Centrifuger ved 240 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Filtreres supernatanten gennem et 0,22 um filter, alikvot, 12 ml / rør, og opbevares ved -80 ° C.
2. Behandling af fuldblod med Red Blood Cell Lysis Buffer
- Tilsæt 0,5 ml fuldblod antikoaguleret af EDTA · K 2 til et 15 ml rør.
- Sæt 1 ml af røde blodlegemer lysepuffer (filtreret af 0,22 um filter og optøet til stuetemperatur før brug) til fuldblod og bland godt. Anbring blandingen ved stuetemperatur i 4 min. Derefter tilsættes 5-7 ml 1x PBS hurtigt til stop reaktion.
- Centrifuger ved 240 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Hvide blodlegemer vil udfælde på bunden af røret.
- Supernatanten fjernes, og vask fældning ved tilsætning 7 ml 1640 basisk medium. Centrifuger i 5 minutter ved 240 xg ved stuetemperatur. Gentag to gange.
- Resuspender cellepelleten i 300 transformation pi medium (RPMI 1640 medium indeholdende 20% føtalt bovint serum og 10 pg / ml phytohæmagglutinin (PHA)).
3. EBV infektion
- Tilføj 60 pi 20 ug / ml cyclosporin A (CsA) til cellesuspensionen.
- Hurtigt tø en portion af EBV ved 37 ° C. Tilføj 240 pi EBV til cellesuspensionen.
- Bland godt og anbring cellesuspensionen til en plade med 96 brønde, 200 pi per brønd. For at undgå fordampning, tilsættes 200 pi 1x PBS til hver brønd rundt af 96-brønds plade. Pladen anbringes i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
4. Udvidelse og Kryopræservering af B-LCLS
- Skift halvdelen af mediet en gang om ugen for den første måned efter EBV infektion. Kun en tyk Layer fra cellefragmenter er synlig under mikroskop på dag 7 (figur 2). Efter en måned EBV infektion, lymfoblastoide celleklynger er synlige under et tykt lag af cellefragmenter under mikroskopet (figur 2).
- Skift halvdelen af mediet hver 3 dage, indtil celleklynger er klart synlige under mikroskopet (figur 2). Typisk er denne proces tager 10 til 20 dage.
- Efter blanding pipetteres cellerne og overføre til 24-brønds plade. Dobbelt mængden af dyrkningsmediet med komplet RPMI 1640, mens det bliver gult. Denne proces afhænger af graden af cellevækst.
- Efterfølgende overføre cellerne til T25 kultur kolbe. Dobbelt mængden af dyrkningsmediet, da det bliver gult, indtil mængden af mediet udvides til 10 - 15 ml.
- Skift medium 24 timer før frysning. Centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 240 x g. Tæl cellerne med en celletæller og fryse ved en densitet på 5 - 10 x 10 6 / ml i frOzen stamopløsning indeholdende 90% FBS og 10% dimethylsulfoxid (DMSO). Fryser ved en hastighed på 1 ° C pr min til -80 ° C og derefter overføre direkte i flydende nitrogen.
5. 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) Assay 17
- Forbered en B-LCLS enkelt cellesuspension med 1640-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum. Seed 3 x 10 4 celler per brønd på 96-brønds plade, 100 pi per brønd.
- Pladen anbringes i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 12 - 16 timer.
- Tilføj MTT (5 mg / ml) til brøndene, hvor celler vokser og holde sig væk fra lys i 4 timer ved 37 ° C.
- Centrifuge cellepladen i 10 minutter ved 168 x g.
- Fjern supernatanten og tilsæt 100 pi DMSO per brønd.
BEMÆRK: Vær forsigtig. Rør ikke ved nåleformede farvestof krystaller. - Ryst pladen i 10 minutter ved lav hastighed for at opløses fuldstændigt krystallerne.
- Mål absorption ved 570 nm vedunder anvendelse af en mikroplade-spektrofotometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under processen med omdannelse, er de morfologiske ændringer af cellerne visualiseret ved lysmikroskopi (figur 2). Små klynger af celler var klart synlige med densitetsgradient separation metode efter 7 dages infektion, mens kun et tykt lag af cellefragmenter er synlige fra lyse af røde blodlegemer metode. Imidlertid lymfoblastoide celleklynger er synlige under det tykke lag af cellefragmenter 30 dage efter infektion. Med hyppigere medium forandring, de celle vragrester falder, og de celleklynger er klart synlige og præsentere det samme billede er oprettet ved gradient adskillelse tæthed metode.
Når cellelinier blev etableret med succes, blev MTT-assayet anvendes til at evaluere levedygtigheden af B-LCLS. Ifølge litteraturen 17, blev B-LCLS oprettet ved forskellige metoder udvalgt til påvisning cellelevedygtigheden og 1640 medium blev anvendt som blank kontrol. Dataene indikerer, at cellelevedygtigheden af B-LCLS etableret med lyse af røde blodlegemer metode er væsentlig højere end cellelevedygtigheden af B-LCLS fra densitetsgradient separation metode (figur 3).
Figur 1. Flow Chart af forretningsordenen. Antikoagulerende blod behandles med røde blodlegemer lysepuffer før EBV infektion efterfulgt af tilsætning af CsA. De inficerede B-celler dyrkes ved 37 ° C i nærvær af 5% CO2 for at etablere sig og efterfølgende udvide B-LCLS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Visualisering af Cellular morfologiske ændringer i processen af EBV Transformation. Den venstre er B-LCLS oprettet ved lyse af røde blodlegemer metode med 0,5 ml perifert blod, og cellerester faldende som tiden går. Den højre viser cellelinjer fastsat af densitetsgradient separation metode med 2,5 prøve ml blod. Scale bar er 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Sammenligning af Cell levedygtighed for B-LCLS Oprettet ved forskellige metoder. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD. Resultaterne viser, at der var signifikant forskel mellem de to metoder (p = 0,014). Klik herfor at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterer udviklingen af en ny fremgangsmåde til immortalisering humane B-celler fra fuldblod ved lysering af røde blodlegemer, og dets celle levedygtighed etablerede B-LCLS blev vurderet ved MTT-assayet. Resultaterne viste, at cellelevedygtigheden af B-LCLS fastlagt af lyse af røde blodlegemer metode er meget højere end den densitetsgradient separation metode. Den største fordel ved den lyse af røde blodlegemer metode er, at den er enkel og kræver et lille volumen (så lidt som 0,5 ml) af blod for at etablere en permanent cellelinie med en høj succesrate og høj cellelevedygtighed.
Kun en enkel lysistrin er nødvendig, før EBV infektion. Uden forudgående oprensning af lymfocytterne, er celletab og celleskade undgås. En anden hindring for densitetsgradient separation metode er hæmolyse. Behandling af blodet efter langtidsopbevaring ved uhensigtsmæssige temperaturer og rystning under transport kan føre til hæmolyse, which vil i høj grad indflydelse på isolering af lymfocytter. Andre undersøgelser har vist, at anvendelsen af røde blodlegemer (RBC) lysis resulterede i højere antal levedygtige PBMC end anvendelse af densitetsgradient separation metode 18 og lymfocyt undertyper blev ikke påvirket væsentligt 19. Sammenlignet med densitetsgradient separationsmetode, som er dyrt og besværligt, den lyse af røde blodlegemer metode er meget lettere, især til behandling af en lang række af de kliniske prøver og mere praktisk for nybegyndere.
I undersøgelsen har vi udødeliggjort 24 prøver med en 100% succesrate ved hjælp af lyse af røde blodlegemer metode. Sammenlignet med den 90-94% af succesraten rapporteret af kryopræserverede lymfocytter og frisk isolerede lymfocytter 20 til 2 - 2,5 ml blod, denne succes er meget højere. I mellemtiden har vi også transformerede frisk (0,5 ml) eller frosne (endda 1 ml) blod som beskrevet i referencer 14,15 uden adskillelse, og effekticy transformation er meget lavere end indberettet 16 (data ikke vist).
Den nuværende strategi ikke blot forbedrer immortalisering effektivitet markant, men også reducerer mængden af blod, der kræves for at etablere B-LCLS. Aktuelle teknologier til EBV transformation bruger relativt store mængder af perifert blod, cirka 2 - 2,5 ml blod 20 til at isolere lymfocytter, mens andre kræver 10 ml eller mere 10,21. Dette står i modsætning til de 0,5 ml fuldblod er nødvendige for at opnå en udødeliggjort cellelinie med den her beskrevne fremgangsmåde. Denne metode kan ændres med succes udødeliggøre blod opsamlet fra finger stikker 12, som ville kunne lette bevare genetiske ressourcer fra pædiatriske patienter og ældre.
Desuden cellelevedygtigheden af B-LCLS fastlagt af lyse af røde blodlegemer metode er højere end den for densitetsgradient separation metode. Den røde blodlegemer lysis metode undgår den mekaniske centrifugalkraft i processen med densitetsgradientcentrifugering, hvilket forårsager ikke kan repareres skade på cellerne. Den foreslår, at den lyse af røde blodlegemer metode er mere egnet til genetiske og funktionelle studier, som kræver et stort antal celler så hurtigt som muligt. Vores metode vil formindske den tid fra kultur initiering til kryopræservering, hvilket vil spare ressourcer og reducere arbejdskraft.
En mulig begrænsning af lyse af røde blodlegemer fremgangsmåde er tilstedeværelsen af kontaminerende rester afledt af røde blod cellelysater, som ville blokere den klare observation af transformation i de første fire uger af EBV-infektion. Dette vil dog debris gradvist fjernes med udskiftning af medium. En anden begrænsning er tabet af voksende transformerede celler, men dette kan lindres ved at fjerne halvdelen af supernatanten i de første fire uger af transformation. En anden mulig modifikation at fjerne urenheder er merehyppige medium ændringer med større mængder eller vaske cellelinjer to gange med 10 ml 1x PBS og derefter centrifugering ved 168 xg i 5 minutter for at fjerne urenheder.
Sammenfattende denne protokol giver en enkel strategi for etablering af B-LCLS med høj immortalisering effektivitet, reducere blodvolumen og sparer tid mellem initiering og nedfrysning. Cellelinierne udviklet i den foreliggende undersøgelse giver en værdifuld og omkostningseffektiv kilde til biomaterialer udføre forskellige undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
- Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
- Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118 (2006).
- Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
- Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
- Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
- Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
- Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
- Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
- Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
- Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
- Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
- Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
- Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
- Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
- Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
- Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
- Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
- Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22 (2007).
