Summary
Une méthode de lyse simple, des globules rouges du sang pour établir B-LCLs a été développé avec une grande efficacité de l'immortalisation, ce qui nécessite une petite quantité de sang et un gain de temps de l'initiation à la cryoconservation.
Protocol
Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique de l'Institut de génétique et de biologie du développement, et le protocole suit les directives institutionnelles pour le bien-être humain.
1. Préparation de EB Virus
- Le jour 1, décongeler les cellules B95-8 et la culture dans 6 ml de milieu RPMI 1640 complet additionné de 10% de sérum bovin fœtal, 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques (100 pg / ml de streptomycine, 100 U / ml de pénicilline) dans un T25 flacon de culture. Placer le flacon de culture dans 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C.
- Le jour 2, observer la morphologie des cellules au microscope. Les cellules sont en bon état quand ils sont lumineux et rond. Ajouter 10 ml milieu RPMI 1640 complet.
- Le jour 4, ajouter 10 ml frais milieu RPMI 1640 complet, puis transférer dans un flacon de culture T75.
- Le jour 8, ajouter 20 ml milieu RPMI 1640 complet.
- Maintenir les cellules pendant 8 jours sans ajouter du milieu frais, à savoir, la famine.
- Le jour 16, observer les cellulesobservé au microscope. Recueillir les cellules dans un tube de 15 ml centrifugeuse, 12 mL / tube.
- Cryo-préserver à -80 ° C pendant 1 h, puis décongeler rapidement à 37 ° C. Répéter 3 fois jusqu'à ce que les particules virales sont libérées à partir des cellules.
- Centrifuger à 240 g pendant 10 min à température ambiante.
- Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,22 um, aliquote, 12 mL / tube et conserver à -80 ° C.
2. Traitement de sang total avec Red Blood Cell Lysis Buffer
- Ajouter 0,5 mL de sang total anticoagulé par EDTA · K 2 à un tube de 15 ml.
- Mettre 1 ml de tampon de lyse des globules rouges (filtré par filtre de 0,22 um et décongelés à la température ambiante avant utilisation) pour le sang total et bien mélanger. Placer le mélange à température ambiante pendant 4 min. Puis ajouter 5 - 7 ml de PBS 1x rapidement à la réaction d'arrêt.
- Centrifuger à 240 g pendant 5 min à température ambiante. Les globules blancs précipitent au fond du tube.
- Jeter le surnageant et laver la précipitation en ajoutant 7 ml 1640 de base. Centrifuger pendant 5 min à 240 xg à la température ambiante. Répéter deux fois.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 300 milieu de transformation ul (milieu RPMI 1640 contenant 20% de sérum de fœtus bovin et 10 ug / ml de phytohémagglutinine (PHA)).
3. EBV Infection
- Ajouter 60 ul de 20 ug / ml de cyclosporine A (CsA) à la suspension cellulaire.
- Rapidement dégeler une partie aliquote de l'EBV à 37 ° C. Ajouter 240 ul VEB à la suspension cellulaire.
- Bien mélanger et placer la suspension cellulaire à une plaque de 96 puits, 200 ul par puits. Pour éviter l'évaporation, ajouter 200 ul PBS 1x à chaque bien autour de la plaque de 96 puits. Placer la plaque dans un incubateur à CO2 de 5% à 37 ° C.
4. Expansion et Cryoconservation de B-LCLs
- Changer la moitié du milieu une fois par semaine pour le premier mois après l'infection par l'EBV. Seul un laye épaisr des fragments de cellules est visible au microscope au jour 7 (figure 2). Après un mois de l' infection à EBV, des amas de cellules lymphoblastoïdes sont visibles sous une épaisse couche de fragments de cellules au microscope (Figure 2).
- Changer la moitié du milieu tous les 3 jours jusqu'à ce que les agrégats de cellules sont bien visibles au microscope (Figure 2). En règle générale, ce processus prend 10 à 20 jours.
- Après le mélange, pipeter les cellules et transférer à la plaque de 24 puits. Doubler le volume du milieu de culture RPMI 1640 complet pendant qu'elle vire au jaune. Ce processus dépend du taux de croissance cellulaire.
- Par la suite, transférer les cellules à T25 flacon de culture. Doubler le volume du milieu de culture telle qu'elle vire au jaune jusqu'à ce que le volume du milieu augmente à 10 - 15 ml.
- Changer moyenne 24 h avant la congélation. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 240 x g. Compter les cellules avec un compteur de cellules et le gel à une densité de 5 à 10 x 10 6 / ml dans frsolution mère ozen contenant 90% de FBS et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Congeler à un taux de 1 ° C par minute à -80 ° C, puis les transférer directement dans l'azote liquide.
5. 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényl-tétrazolium , le bromure de (MTT) 17
- Préparer une suspension cellulaire unique B-LCL avec le milieu 1640 contenant 10% de sérum de veau foetal. Seed 3 x 10 4 cellules par puits sur la plaque de 96 puits, 100 pl par puits.
- Placer la plaque dans 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C pendant 12 à 16 heures.
- Ajouter MTT (5 mg / ml) dans les puits dans lesquels les cellules sont en croissance et à l'abri de la lumière pendant 4 h à 37 ° C.
- Centrifugeuse plaque de cellule pendant 10 min à 168 x g.
- Retirer le surnageant et ajouter 100 ul de DMSO par puits.
NOTE: Soyez prudent. Ne touchez pas les cristaux de colorant en forme d'aiguilles. - Agiter la plaque pendant 10 minutes à basse vitesse pour dissoudre complètement les cristaux.
- l'absorption de la mesure à 570 nm paren utilisant un spectrophotomètre de microplaque.
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Representative Results
Au cours du processus de transformation, les changements morphologiques des cellules sont visualisées par microscopie optique (Figure 2). De petites grappes de cellules étaient clairement visibles par le procédé de séparation par gradient de densité au bout de 7 jours après l'infection, alors que seule une couche épaisse de fragments cellulaires sont visibles à partir de la méthode de la lyse des globules rouges. Cependant, des amas de cellules lymphoblastoïdes sont visibles sous la couche épaisse de fragments cellulaires 30 jours après l'infection. Avec changement de milieu plus fréquentes, les diminutions de débris cellulaires et les amas de cellules sont clairement visibles et présentent la même image établie par la méthode du gradient de séparation par densité.
Quand les lignées cellulaires ont été établies avec succès, l'essai MTT a été utilisée pour évaluer la viabilité de B-LCL. D' après la littérature 17, B-LCL établie par des méthodes différentes ont été sélectionnées pour détecter la viabilité des cellules et 1640 milieu a été utilisé comme témoin à blanc. Les données indiquent que la viabilité des cellules B-LCL établie avec la méthode de la lyse des globules rouges est beaucoup plus élevée que la viabilité des cellules B-LCL à partir du procédé de séparation par gradient de densité (figure 3).
Figure 1. Diagramme de procédure. anticoagulante du sang est traité avec un tampon de lyse des globules rouges du sang avant l'infection par l'EBV, suivie par l'addition de CsA. Les cellules B infectées sont cultivées à 37 ° C en présence de 5% de CO 2 pour établir et ensuite étendre B-LCL. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figurer 2. Visualisation des cellulaires changements morphologiques dans le processus de transformation EBV. La gauche sont B-LCLs établi par le sang rouge méthode de lyse cellulaire avec du sang périphérique de 0,5 ml, et les débris cellulaires diminue à mesure que le temps passe. À droite montre les lignées cellulaires établies par le procédé de séparation par gradient de densité avec 2,5 ml d'échantillon de sang. La barre d'échelle est de 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Comparaison des cellules Viabilité pour B-LCLs Établi par différentes méthodes. Chaque barre représente SD ± moyenne. Les résultats montrent qu'il y avait une différence significative entre les deux méthodes (p = 0,014). Cliquez ici s'il vous plaitpour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous rapportons ici le développement d'un nouveau procédé d'immortalisation de lymphocytes B humains à partir de sang total par lyse des globules rouges et la viabilité cellulaire établie de B-LCL a été évaluée par le test MTT. Les résultats ont montré que la viabilité des cellules B-LCL établies par la méthode de la lyse des globules rouges est beaucoup plus élevé que celui du procédé de séparation par gradient de densité. L'avantage majeur de la méthode de la lyse des globules rouges est qu'il est simple et nécessite un faible volume (aussi peu que 0,5 ml) de sang pour établir une lignée cellulaire permanente avec un taux de réussite élevé et la viabilité cellulaire élevée.
Une seule étape de lyse simple est nécessaire avant que l'infection EBV. Sans purification préalable des lymphocytes, la perte de cellules et des dommages cellulaires sont évités. Un autre obstacle du procédé de séparation par gradient de densité est hémolyse. Traitement du sang après un stockage à long terme à des températures inappropriées et secousses pendant le transport peut entraîner une hémolyse, which aura une grande influence sur l'isolement des lymphocytes. D' autres études ont montré que l' utilisation de globules rouges (RBC) lyse a donné lieu à un nombre plus élevé de PBMC viables que l' utilisation du procédé de séparation par gradient de densité de 18 sous - types de lymphocytes et ne sont pas influencés sensiblement 19. Par rapport au procédé de séparation par gradient de densité, ce qui est coûteux et encombrant, la méthode de la lyse des globules rouges est beaucoup plus facile, en particulier pour le traitement d'un grand nombre d'échantillons cliniques et plus pratique pour les néophytes.
Dans cette étude, nous avons immortalisé 24 échantillons avec un taux de réussite de 100% en utilisant la méthode de la lyse des globules rouges. En comparaison avec le 90-94% de taux de succès rapportés par les lymphocytes cryoconservés et lymphocytes fraîchement isolés 20 avec le 2 - 2,5 ml de sang, ce taux de réussite est beaucoup plus élevé. Pendant ce temps, nous avons également transformé frais (0,5 ml) ou congelés (même 1 ml) de sang comme décrit dans les références 14,15 sans séparation, et l'efficiency de transformation est beaucoup plus faible que celle rapportée 16 (données non présentées).
La stratégie actuelle améliore non seulement l'efficacité de l'immortalisation de manière significative, mais réduit également le volume de sang nécessaire pour établir B-LCLs. Les technologies actuelles pour la transformation EBV utiliser des volumes relativement importants de sang périphérique, d' environ 2 à 2,5 mL de sang 20 pour isoler les lymphocytes tandis que d' autres ont besoin de 10 mL ou plus de 10,21. Cela contraste avec les 0,5 ml de sang total nécessaire pour obtenir une lignée cellulaire immortalisée avec la méthode décrite ici. Cette méthode pourrait être modifiée pour immortaliser avec succès sang prélevé sur le doigt 12 pique, ce qui pourrait grandement faciliter la préservation des ressources génétiques des patients pédiatriques et les personnes âgées.
En outre, la viabilité des cellules B-LCL établies par le sang méthode de la lyse des globules rouges est supérieure à celle de la méthode de séparation par gradient de densité. La cellule l de sang rougeyse procédé évite la force centrifuge mécanique dans le procédé de centrifugation en gradient de densité, ce qui provoque des dommages irrécupérables aux cellules. Il suggère que la méthode des cellules sanguines de lyse rouge est plus approprié pour les études génétiques et fonctionnelles, ce qui nécessite un grand nombre de cellules le plus rapidement possible. Notre méthode réduira le temps de la culture initiation à la cryoconservation, qui permettra d'économiser les ressources et réduire la main-d'œuvre.
Une limitation possible de la méthode de lyse des globules rouges est la présence de contamination des débris provenant de rouges lysats de cellules sanguines, qui bloquerait l'observation claire de transformation dans les quatre premières semaines de l'infection à EBV. Cependant, ces débris sera progressivement éliminé avec les moyennes changements. Une autre limitation est la perte de la croissance des cellules transformées, mais cela peut être améliorée en supprimant la moitié du surnageant au cours des quatre premières semaines de la transformation. Une autre modification possible pour éliminer les impuretés est plusfréquentes variations moyennes avec de plus grands volumes ou le lavage des lignées cellulaires à deux reprises par 10 ml de 1 x PBS, puis en centrifugeant à 168 g pendant 5 min pour éliminer les impuretés.
En résumé, ce protocole prévoit une stratégie simple pour l'établissement B-LCLs avec une efficacité élevée d'immortalisation, ce qui réduit le volume sanguin et un gain de temps entre le début et la cryopréservation. Les lignées de cellules développées dans la présente étude constituent une source précieuse et rentable de biomatériaux effectuer diverses études.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
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