Summary
B-LCLS을 설정하기위한 간단한 적혈구 용해 방법은 소량의 혈액을 필요로하고 동결 보존 개시로부터 시간을 절약 불멸화 높은 효율로 발전되었다.
Protocol
이 연구는 유전학과 발달 생물학 연구소의 윤리위원회의 승인을하고, 프로토콜은 인간의 복지를위한 제도적 지침을 따른다.
EB 바이러스의 제조 1
- 1 일에, 6 mL의 B95-8 세포 배양 해동 완전 RPMI 1640 매체, 10 % 소 태아 혈청, 2 mM L- 글루타민, 항생제 (100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 100 U / ㎖ 페니실린)이 보충 T25 문화 플라스크. 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 배양 플라스크를 놓습니다.
- 제 2 일에, 현미경으로 세포의 형태를 관찰한다. 그들은 밝고 라운드 때 세포는 좋은 상태를 유지하고 있습니다. 10 mL의 완전한 RPMI 1640 배지를 추가합니다.
- 하루에 4 일, 10 mL의 신선한 완전한 RPMI 1640 배지를 추가 한 다음 T75 문화 플라스크에 전송할 수 있습니다.
- 하루 8 일, 20 mL의 완전한 RPMI 1640 배지를 추가합니다.
- 즉, 새로운 배지, 기아를 추가하지 않고 팔일의 세포를 유지한다.
- 날 16 일, 세포를 관찰현미경으로 관찰 하였다. 15 mL의 원심 분리 튜브, 12 ㎖ / 튜브에 세포를 수집한다.
- 1 시간 동안 -80 ℃에서 냉동 보존은-하고 빠르게 37 ℃에서 해동. 바이러스 입자가 세포로부터 해제 될 때까지 3 번 반복합니다.
- 실온에서 10 분 동안 240 × g으로 원심 분리기.
- -80 ° C에서 0.22 μm의 필터, 나누어지는 12 ㎖ / 튜브 및 저장소를 통해 뜨는을 필터링합니다.
적혈구 용해 버퍼와 전혈 2. 치료
- 15 ㎖의 튜브에 EDTA · K 2 항 응고 0.5 mL의 전혈을 추가합니다.
- 전혈에 (사용 전 0.22 μm의 필터로 여과하고, 실온에서 해동 된) 1 mL의 적혈구 용해 완충액을 넣어 잘 섞는다. 4 분 동안 실온에서 혼합물을 놓는다. 정지 반응에 신속 7 ㎖의 1X PBS - 그럼 5를 추가합니다.
- 실온에서 5 분 동안 240 × g으로 원심 분리기. 백혈구는 튜브의 바닥에 침전된다.
- 상층 액을 버리고, 7 mL의 1640 기본 배지를 추가하여 침전을 씻는다. 실온에서 240 XG에서 5 분 동안 원심 분리기. 두 번 반복합니다.
- (20 % 소 태아 혈청 및 10 μg의 / ㎖의 피토 헤 마글 루티 닌 (PHA)를 함유하는 RPMI 1640 배지) 300 μL 변환 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁.
3. EBV 감염
- 세포 현탁액에 20 μg의 / ML의 시클로 스포린 A의 60 μL (CSA)를 추가합니다.
- 빠르게 37 ° C에서 EBV의 나누어지는을 녹여. 세포 현탁액 240 μL EBV를 추가합니다.
- 잘 혼합하고 잘 당 96 웰 플레이트에 200 μL를 세포 현탁액을 배치합니다. 증발을 방지 96 웰 플레이트의 주위에 모든 웰에 200 μL 1X PBS를 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다.
B-LCLS 4. 확장 및 냉동 보존
- EBV 감염 후 첫 달 동안 일주일에 한 번 매체의 절반을 변경합니다. 만 두꺼운 라예세포 조각의 r은 7 일 (그림 2)에서 현미경으로 볼 수 있습니다. EBV 감염 한 달 후에 임파 세포 클러스터는 현미경 (도 2)하에 세포 단편의 두꺼운 층 아래에 표시된다.
- 셀 클러스터는 누가 뭐라고해도 현미경 (그림 2)에서 볼 수 있습니다 때까지 3 일마다 배지의 절반을 변경합니다. 일반적으로이 과정은 10 ~ 20 일이 소요됩니다.
- 혼합 후, 세포를 피펫 팅하고 24 웰 플레이트에 옮긴다. 이 노란색으로 변하면서 완전한 RPMI 1640 배양액의 양을 두 배로. 이 과정은 세포의 성장 속도에 의존한다.
- 이어서, T25 배양 용 플라스크에 세포를 옮긴다. 15ml의 - 매체의 부피가 10로 확장 전까지는 노랑색으로 배양액 부피를 두배.
- 동결하기 전에 매체 24 시간을 변경합니다. 240 × g에서 5 분 동안 원심 분리기 세포 현탁액. FR 10 × 106 / ㎖ - (5)의 농도로 세포 계수기와 함께 동결 세포 개수90 % FBS와 10 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)를 함유하기 Ozen 원액. -80 ° C에 분당 1 ℃의 속도로 고정 후 액체 질소에 직접 전송합니다.
5. 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석 17
- 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 배지 1640와 B-LCLS 단일 세포 현탁액을 제조. 잘 위에 96 웰 플레이트 당 종자 3 × 104 세포, 잘 당 100 μL.
- 16 시간 - 12 37 ° C에서 CO 2 배양기 5 %에서 접시를 놓습니다.
- 세포가 성장하는 우물에 MTT (5 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 37 ℃에서 4 시간 동안 빛에 가까이하지 말 것.
- 168 × g으로 10 분 동안 원심 분리기 세포 판.
- 상층 액을 제거하고 잘 당 100 μL DMSO를 추가합니다.
참고 :주의해야합니다. 바늘 모양의 염료 결정을 만지지 마십시오. - 완전 결정을 용해 저속으로 10 분 동안 플레이트를 흔들어.
- 570 nm의에 의해에서 측정 흡수마이크로 플레이트 분광 광도계.
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Representative Results
변형 과정에서, 세포의 형태 학적 변화는 광학 현미경 (도 2)에 의해 가시화된다. 세포 파편의 두꺼운 층은 적혈구 세포 용해 방법에서 볼 수있는 반면 작은 셀 클러스터는 감염 후 7 일 후, 밀도 구배 분리법 명확하게 볼 수 있었다. 그러나, 임파 세포 클러스터는 30 일 게시물 감염 세포의 단편의 두꺼운 층 아래에 표시된다. 더 자주 변화 매체로, 세포 파편 감소 셀 클러스터는 선명하게 보이는지 및 밀도 구배 분리법에 의해 설립 된 동일한 이미지를 제시한다.
세포주가 성공적으로 확립 된 경우, MTT 분석은 B-LCLS의 실행 가능성을 평가하기 위해 사용되었다. 문헌 17에 따르면, 다른 방법에 의해 확립 된 B-LCLS은 세포 생존 및 (16)을 검출하도록 선택되었다40 배지 블랭크 대조군으로 사용 하였다. 데이터는 적혈구 균법 확립 B-LCLS의 세포 생존율은 밀도 구배 분리 방법 (도 3)에서 B-LCLS의 세포 생존율보다 상당히 높다는 것을 나타낸다.
절차의 그림 1. 플로우 차트. 혈액 응고 CsA를 첨가 한 후 EBV 감염 전에 적혈구 세포 용해 완충액으로 처리된다. 감염된 세포는 B-B LCLS 확립이어서 확장 5 % CO2의 존재하에 37 ℃에서 성장된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
인터넷EBV 변환하는 과정에서 세포 형태 학적 변화의 gure 2. 시각화. 왼쪽은 B-LCLS 0.5 mL의 말초 혈액에 적혈구 세포 용해 방법에 의해 설립, 시간으로 감소 세포 파편은 계속된다. 권리 2.5 ㎖의 혈액 샘플 밀도 구배 분리 방법에 의해 확립 된 세포주를 나타낸다. 스케일 바는 10 μm의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 다양한 방법에 의해 설립 된 B-LCLS에 대한 세포 생존 3. 비교. 각 막대는 평균 ± SD를 나타냅니다. 결과는 두 가지 방법 (p = 0.014) 사이의 유의 한 차이가 있다는 것을 나타낸다. 여기를 클릭하세요이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
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Discussion
우리는 적혈구 용균 전혈로부터 인간 B 세포를 불멸화하기위한 새로운 방법의 개발을보고하고, B-LCLS은 MTT 분석법으로 평가 하였다 설정된 그것의 세포 생존. 결과 적혈구의 용해 방법에 의해 확립 된 B-LCLS의 세포 생존율은 밀도 구배 분리 방법보다 훨씬 더 높은 것으로 나타났다. 적혈구 용해 방법의 주요 장점은 간단하고 높은 성공률과 높은 세포 생존과 영구 세포주를 확립하기위한 혈액 (0.5ml를 적게는) 소량을 필요로한다는 것이다.
오직 하나의 간단한 용해 공정 EBV 감염 전에 필요하다. 림프구의 이전 정제하지 않고, 세포 손실 및 세포 손상을 피할 수있다. 밀도 구배 분리 방법의 또 다른 장애물은 용혈이다. 어, 부적절한 온도에서 장기간 보관 후 혈액을 처리하고 운반시 진동은 용혈 될 수 있습니다무형 문화 유산은 크게 림프구의 분리에 영향을 미칠 것이다. 다른 연구는 적혈구 (RBC) 용해의 사용이 (18)와 림프구 아형은 대략 19에 좌우되지 않은 밀도 구배 분리 방법을 이용 가능한 PBMC보다 높은 숫자의 결과 것으로 나타났다. 비용이 많이 들고 복잡 밀도 구배 분리 방법에 비해, 적혈구 용해 방법은 특히 대규모 임상 샘플의 수와 초보자 실용적인 치료에 훨씬 쉽다.
본 연구에서 우리는 적혈구 세포 용해 방법을 사용하여 100 % 성공률 24 샘플 불멸화있다. 성공 동결 보존 림프구에서보고 레이트 갓 절연 림프구 90~94%와 비교해 2 20-2.5 mL의 혈액이 성공 확률은 훨씬 높다. 한편, 우리는 또한 신선한 (0.5 mL)을 변형 또는 분리없이 참조 14, 15에 기술 된 바와 같이 (도 1 mL)에 혈액을 동결하고, efficien변환 CY는보고 (16) (도시되지 않은 데이터)보다 훨씬 낮다.
본 전략은 상당히 불멸화 효율을 향상시킬뿐만 아니라, B-LCLS를 설정하는 데 필요한 혈액의 양을 줄일뿐만 아니라. 다른 사람이 10 ㎖ 10,21 이상을 필요로하는 동안 2.5 mL의 혈액 (20)은 림프구를 분리 - EBV 변환에 대한 현재의 기술은 약 2, 말초 혈액의 비교적 큰 볼륨을 사용합니다. 이것은 여기에 설명 된 방법으로 불멸화 세포주를 얻기 위해 필요한 전체 혈액의 0.5 mL의 대조. 이 방법은 성공적으로 손가락에서 수집 된 혈액을 불멸 수정 될 수 크게 소아 환자 및 노인에서 유전자 원을 보존 촉진 수 (12), 거시기.
또한, 적혈구 세포 용해 방법에 의해 확립 된 B-LCLS의 세포 생존율은 밀도 구배 분리 방법에 비해 더 높다. 적혈구 리터이 Analysis 방법은 세포 수리 불가능한 손상을 유발 밀도 구배 원심 분리 과정에서 기계적 원심력을 피한다. 이는 적혈구 균법 최대한 빨리 많은 수의 세포를 필요로하고 유전자 기능 연구에 더 적합 함을 시사한다. 우리의 방법은 자원을 절약하고 노동을 줄일 냉동 보존에 배양 개시로부터 시간이 줄어 듭니다.
적혈구 용해 방법의 가능한 제한 EBV 감염의 제 4 주 변환의 명확한 관찰은 차단 적혈구 용 해물로부터 유도 된 이물질, 오염의 존재이다. 그러나,이 부스러기가 서서히 변화 매체로 제거한다. 또 다른 한계는 성장 형질 전환 된 세포의 손실이지만,이 변환의 제 4 주 상층 액의 절반을 제거함으로써 개선 될 수있다. 불순물을 제거하는 또 다른 가능한 수정은 더있다큰 부피 10 ㎖의 1X PBS로 두 번 세포 라인을 세척하고 불순물을 제거하고 5 분 동안 168 × g으로 원심 분리와 배지를 자주 변화한다.
요약하면,이 프로토콜은, 높은 효율로 불멸화 B-LCLS 확립 혈액량을 감소 개시 및 동결과 시간을 절약하기위한 간단한 전략을 제공한다. 본 연구에서 개발 된 세포주는 생체 재료의 가치와 비용 효율적인 소스가 다양한 연구를 수행 제공합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
- Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
- Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118 (2006).
- Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
- Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
- Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
- Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
- Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
- Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
- Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
- Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
- Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
- Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
- Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
- Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
- Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
- Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
- Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
- Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22 (2007).
