Summary
Простой эритроцитарной метод лизиса для создания B-LCLS была разработана с высокой эффективностью иммортализации, когда требуется небольшое количество крови и экономии времени от начала до криоконсервации.
Protocol
Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Института генетики и биологии развития путем, и протокол следует институциональные принципы для благосостояния человека.
1. Получение EB вируса
- На 1-й день, оттаивают В95-8 клеток и культуры в 6 мл полной среды RPMI-1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками (100 мкг / мл стрептомицина, 100 ед / мл пенициллина) в T25 культуры колбу. Место культуры колбу в 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C.
- На 2-й день, наблюдать морфологии клеток под микроскопом. Клетки находятся в хорошем состоянии, когда они яркие и круглые. Добавляют 10 мл полной среды RPMI 1640.
- На 4-й день, добавить 10 мл свежей полной RPMI 1640, а затем переносят в колбу T75 культуры.
- На 8-й день, добавить 20 мл полной среды RPMI 1640.
- Поддерживать клетки в течение 8 дней без добавления свежей среды, то есть голодание.
- На 16-й день, наблюдать клеткинаблюдали под микроскопом. Сбор клеток в 15 мл центрифужную пробирку, 12 мл / трубки.
- Криотерапевтические сохраняют при -80 ° С в течение 1 ч, а затем быстро оттаивают при 37 ° С. Повторите 3 раза, пока вирусные частицы не будут выпущены из клеток.
- Центрифуга при 240 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Фильтр супернатант через фильтр 0,22 мкм, аликвоты 12 мл / пробирку и хранят при -80 ° С.
2. Лечение цельной крови с эритроцитарной лизирующего буфера
- Добавить 0,5 мл цельной крови с антикоагулянтом ЭДТА · K 2 в пробирку 15 мл.
- Положите 1 мл красных кровяных клеток лизис буфера (отфильтрованную фильтром 0,22 мкм и оттаивали до комнатной температуры перед использованием) в цельной крови и хорошо перемешать. Поместите смесь при комнатной температуре в течение 4 мин. Затем добавляют 5 - 7 мл 1X PBS быстро до остановки реакции.
- Центрифуга при 240 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Белые клетки крови будут осаждаться в нижней части трубы.
- Жидкость над осадком сливают и промывают осаждение добавлением 7 мл 1640 основной среде. Центрифуга в течение 5 мин при 240 мкг при комнатной температуре. Повторите дважды.
- Ресуспендируют осадок клеток в 300 мкл среды превращения (RPMI 1640, содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки и 10 мкг / мл фитогемагглютинином (PHA)).
3. EBV инфекции
- Добавить 60 мкл 20 мкг / мл циклоспорина А (CsA) к клеточной суспензии.
- Быстро разморозить аликвоты EBV при 37 ° С. Добавить 240 мкл EBV к клеточной суспензии.
- Тщательно перемешать и поместить суспензии клеток в 96-луночный планшет, по 200 мкл на лунку. Для того, чтобы избежать испарения, добавить 200 мкл 1X PBS в каждую лунку вокруг 96-луночного планшета. Поместите пластину в 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С.
4. Расширение и Криосохранение B-LCLS
- Изменение половины среды один раз в неделю в течение первого месяца после EBV-инфекции. Только толстый Лэг фрагментов клеток видна под микроскопом на 7 -й день (рисунок 2). Через один месяц EBV инфекции, лимфобластоидные клеточные кластеры видны под толстым слоем клеточных фрагментов под микроскопом (рисунок 2).
- Изменение половину среды каждые 3 дня до тех пор , клеточные кластеры четко видны под микроскопом (рис 2). Как правило, этот процесс занимает от 10 до 20 дней.
- После смешивания пипеткой клетки и передавать на 24-луночный планшет. Двойной объем культуральной среды с полной RPMI 1640 в то время как он становится желтым. Этот процесс зависит от скорости роста клеток.
- Затем перенести клетки в T25 культуры колбу. Двойной объем культуральной среды, как он становится желтым, пока объем среды не расширяется до 10 - 15 мл.
- Изменение средних за 24 ч до замораживания. Суспензию клеток Центрифуга в течение 5 мин при 240 х г. Граф клеток с помощью счетчика клеток и заморозить при плотности 5 - 10 х 10 6 / мл в патенте Францииозен маточный раствор, содержащий 90% FBS и 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Замораживание со скоростью 1 ° С в мин до -80 ° С, а затем передавать непосредственно в жидкий азот.
5. 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил-тетразолия бромида (МТТ) 17
- Подготовка суспензии отдельных клеток В-LCLS с 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Семенной 3 х 10 4 клеток на лунку на 96-луночный планшет , по 100 мкл на лунку.
- Поместите пластину в 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 12 - 16 ч.
- Добавить МТТ (5 мг / мл) в лунки, в которой клетки растут и держать в защищенном от света в течение 4 ч при 37 ° С.
- клеточная пластинка Центрифуга в течение 10 мин при 168 х г.
- Удалить супернатант и добавляют 100 мкл ДМСО на лунку.
Примечание: Будьте осторожны. Не прикасайтесь к игольчатые кристаллы красителя. - Встряхните пластину в течение 10 мин при низкой скорости, чтобы полностью растворить кристаллы.
- Поглощение Измерить при 570 нмс использованием микропланшет-спектрофотометра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В процессе трансформации, морфологические изменения клеток визуализируют с помощью световой микроскопии (рис 2). Небольшие скопления клеток были хорошо видны с градиентным методом сепарации по плотности через 7 дней после заражения, в то время как только толстый слой клеточных фрагментов видны из метода лизиса клеток красной крови. Однако лимфобластоидные клеточные кластеры видны под толстым слоем осколков клеток через 30 дней после заражения. С более частой сменой среды, осколки клеток уменьшается, а клеточные кластеры отчетливо видны и представляют один и тот же образ, установленный методом плотности разделения градиента.
Когда клеточные линии были установлены успешно, МТТ-анализе использовали для оценки жизнеспособности B-LCLS. Согласно литературным данным 17, Б-LCLS различными способами установлены были выбраны для выявления жизнеспособности клеток и 1640 среду использовали в качестве пустой контроль. Полученные данные свидетельствуют о том , что жизнеспособность клеток В-LCLS создана с помощью метода лизиса эритроцитов в крови значительно выше , чем жизнеспособность клеток B-LCLS от градиентного метода разделения плотности (рисунок 3).
Рисунок 1. Блок - схема процедуры. Антикоагулянтом крови обрабатывают красной крови буфером для лизиса клеток, прежде чем EBV инфекции с последующим добавлением циклоспорина. Инфицированные В - клетки культивировали при 37 ° С в присутствии 5% СО 2 , чтобы установить и впоследствии расширение B-LCLS. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Fi2. Визуализация фигура Сотовые Морфологические изменения в процессе трансформации EBV. Слева B-LCLS установлено красных кровяных телец методом лизиса клеток с 0,5 мл периферической крови и остатков клеток снижается, как время идет. Справа показывает клеточные линии, установленные методом градиентного разделения плотности с 2,5 мл образца крови. Шкала бар составляет 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Сравнение Жизнеспособность клеток для B-LCLS различными способами установлены. Каждый столбик представляет среднее ± стандартное отклонение. Результаты показывают, что существует значительная разница между этими двумя методами (р = 0,014). Пожалуйста , нажмите здесьдля просмотра увеличенной версии этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы сообщаем о разработке нового способа для иммортализации B-клеток человека из цельной крови путем растворения красных клеток крови, и его жизнеспособность клеток развившегося В-LCLS оценивали с помощью МТТ-анализе. Результаты показали, что жизнеспособность клеток В-LCLS устанавливается методом лизиса эритроцитов в крови значительно выше, чем у метода градиента плотности разделения. Основное преимущество метода лизиса красных кровяных телец, является то, что она проста и требует небольшого объема (всего лишь 0,5 мл) крови для создания постоянной линии клеток с высокой вероятностью успеха и высокой жизнеспособности клеток.
Только один простой шаг лизис необходим, прежде чем EBV инфекции. Без предварительной очистки лимфоцитов, гибель клеток и клеточного повреждения устраняются. Другим препятствием метода градиента плотности разделения является гемолиз. Обработка крови после длительного хранения при неправильной температуре и тряски при транспортировке может привести к гемолизу, ВГIch будет в значительной степени влиять на выделение лимфоцитов. Другие исследования показали , что использование красных кровяных телец (эритроцитов) лизиса привело к увеличению числа жизнеспособных PBMC , чем использование метода разделения градиента плотности 18 и лимфоцит подтипы не повлияли существенно 19. По сравнению с градиентным методом сепарации по плотности, что является дорогостоящим и громоздким, красный метод клеток крови лизис гораздо проще, особенно для лечения большого количества клинических образцов и более практичным для начинающих.
В исследовании мы увековечили 24 образцов с вероятностью успеха 100% с использованием метода лизиса клеток красных кровяных. По сравнению с 90-94% от скорости успеха , о которых сообщают криоконсервированных лимфоцитов и свежеизолированных лимфоцитов 20 с 2 - 2,5 мл крови, этот показатель является намного выше. В то же время, мы также трансформируются свежие (0,5 мл) или в замороженном виде (даже 1 мл) крови , как описано в ссылках 14,15 без разделения, и efficienсу трансформации значительно ниже , чем сообщалось 16 (данные не показаны).
Данная стратегия не только повышает эффективность Иммортализация значительно, но и уменьшает объем крови, необходимый для установления B-LCLS. Современные технологии трансформации EBV используют сравнительно большие объемы периферической крови, приблизительно 2 - 2,5 мл крови 20 , чтобы изолировать лимфоциты в то время как другие требуют 10 мл или более 10,21. Это контрастирует с 0,5 мл цельной крови, необходимых для получения иммортализированной клеточной линии с методом, описанным здесь. Этот метод может быть изменен , чтобы успешно увековечить кровь , собранную из пальца уколов 12, который может в значительной степени способствовать сохранению генетических ресурсов из педиатрических больных и пожилых людей.
Кроме того, жизнеспособность клеток В-LCLS установленных красной крови методом лизиса клеток выше, чем у метода градиента плотности разделения. Клетка л красной кровилиз метод позволяет избежать механического центробежной силы в процессе центрифугирования в градиенте плотности, что приводит к невосстанавливаемых повреждению клеток. Это позволяет предположить, что красный метод лизиса клеток крови является более подходящим для генетических и функциональных исследований, что требует большого количества клеток как можно быстрее. Наш метод позволит сократить время от начала культивирования к криоконсервации, что позволит сэкономить ресурсы и уменьшить рабочую силу.
Возможное ограничение красного метода лизиса клеток крови является наличие загрязняющих обломков, полученных из эритроцитов лизатов, которая будет блокировать четкое наблюдение трансформации в течение первых четырех недель EBV инфекции. Тем не менее, этот мусор будет постепенно удалены с изменениями среды. Другим ограничением является потеря растущих трансформированных клеток, но это может быть облегчены путем удаления половину надосадочной жидкости в течение первых четырех недель трансформации. Другая возможная модификация для удаления примесей большечастые средние изменения с большей объемами или мойку клеточных линий, в два раза по 10 мл 1x PBS, а затем центрифугировали при 168 х г в течение 5 мин для удаления примесей.
Таким образом, этот протокол обеспечивает простую стратегию создания B-LCLS с высокой эффективностью Иммортализация, снижая объем крови и экономии времени между инициировании и криоконсервации. Клеточные линии, разработанные в настоящем исследовании, обеспечивают ценным и экономически эффективным источником биоматериалов проводить различные исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
- Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
- Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118 (2006).
- Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
- Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
- Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
- Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
- Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
- Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
- Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
- Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
- Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
- Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
- Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
- Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
- Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
- Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
- Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
- Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22 (2007).
