Summary
הזרקת subretinal הוחל נרחב במחקרים פרה של טיפול בתאי גזע חלופי עבור ניוון מקולרי הקשור לגיל. במאמר זה דמיינו, נתאר טכניקה הזרקת subretinal פחות מסוכן, הדירים בדיוק ששונתה באמצעות הגישה הטרנס-scleral להעביר תאים לתוך עיניו חולדה.
Abstract
מחלות רשתית ניווניות כגון הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD) הן הגורם המוביל של אובדן ראייה בלתי הפיך ברחבי העולם. AMD מאופיין על ידי ניוון תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית, אשר הם טפט של תאים פונקציונלית ותמיכה אנטומית לעטוף עצביים ברשתית. טיפולי תרופתי הנוכחי AMD שאינו neovascular (AMD יבש) רק להאט את התקדמות המחלה, אך לא ניתן לשחזר את החזון, המחייב מחקרים שמטרתם זיהוי אסטרטגיות טיפוליות מקוריות. החלפת תאי RPE ניוונית עם תאים בריאים מביאות הבטחה להתייחס AMD יבש בעתיד. מחקרים מקיפים פרה של תאי גזע החלפת טיפולים ל- AMD לערב את השתלת תאי RPE נגזר תאי גזע לתוך מרחב subretinal של דגמים בעלי חיים, שבו מוחל על טכניקת ההזרקה subretinal. הגישה תכוף במחקרים אלה בעלי חיים פרה היא דרך המסלול טרנס-scleral, אשר נעשית קשה על ידי חוסר של פריט חזותי ישיר של הסוף מחט יכול לעיתים קרובות לגרום נזקים ברשתית. גישה חלופית דרך הזגוגיות מאפשר התבוננות ישירה של העמדה קצה המחט, אבל זה סיכון גבוה של טראומות כירורגיים כמו רקמות העין יותר נגרמת הפרעה. פיתחנו פחות מסוכן לשחזור ששונה הזרקה טרנס-scleral שיטה המשתמשת המחט מוגדר זוויות ועומקי בהצלחה ובעקביות לספק תאי RPE לחלל subretinal חולדה, למנוע פגיעה ברשתית מוגזמת. תאים מועברים באופן זה הוכחו בעבר בתמימותה בחולדה המלכותי המנתחים (RCS) לפחות 2 חודשים. טכניקה זו יכולה לשמש לא רק עבור השתלת תא, אלא גם עבור משלוח של מולקולות קטנות או בטיפולים גנטיים.
Introduction
הרשתית האנושית ממוקם בירכתי הפונקציות העין כמו רקמה חושית אור, משחק תפקיד קריטי בתפיסה חזון. תפקוד לקוי של תאים ברשתית או מוות של תאים ולכן גורם בעיות ראייה או עיוורון תמידי. הפרעות ניוון או תפקוד לקוי של התאים בשכבות השונות של הרשתית ידועים כמו מחלות רשתית ניווניות, ביניהם AMD הוא הסוג הנפוץ ביותר הגורם המוביל לעיוורון בלתי הפיך אצל הקשישים במדינות המפותחות 1,2. תהליך פתולוגי של AMD מזוהה עם הצטברות "drusen" בין השכבה RPE הקרום של ברוך הבסיסית, אשר בתורו פוגע RPE תמיכה של פיזיולוגיה קולט אור, המוביל ניוון רשתית עצבי הראייה הפסד3, 4,5. עד כה, אין שום תרופה לקבלת מתקדם יבש AMD (שאינם neovascular). הופעתה של טיפול בתאי גזע כמו פרדיגמה חדשה ב רפואה רגנרטיבית מביא את התקווה של החלפת תאי RPE לקוי או מת עם תאי גזע-derived תאים בריאים. ואכן, מחקרים מקיפים פרה של משתילים גזע תאים (למשל, תאי גזע עובריים אנושיים)-תאי RPE נגזר לתוך מודלים RPE-ניוונית היית בביצוע6,7, אשר חלקם התקדמו אל ניסויים קליניים8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). לאחרונה, מקור חלופי של תאי גזע תושב בשכבה RPE האנושי, תאי הגזע האנושי RPE (hRPESCs), זוהה על ידי המעבדה שלנו ומשמש כיום במחקרים פרה של טיפול השתלת תאים (hRPESC-RPE) נגזר-RPE hRPESC ל- AMD 10 , 11 , 12 , 13.
טכניקת הזרקת subretinal מוחל במחקרים פרה שהוזכרו לעיל על ידי קבוצות מרובות, כולל הקבוצה שלנו. ישנן שתי גישות כלליות להזרקה subretinal בבעלי חיים: טרנס-vitreal, טרנס-scleral. הגישה הטרנס-vitreal יש את היתרון של המנתח היכולת לצפות ישירות בקצה המחט כפי שזה חודר העין הקדמי, חוצה את החלל כולו vitreal סמוכים על העדשה, חודר הרשתית מאחור את העין כדי להגיע את subretinal מקום14,15,16. עם זאת, זה דורש שיבוש הרשתית בשני מיקומים (anterior ואת אחורי), נושאת את הסיכון של פגיעה העדשה והיא יכולה לגרום בתוך זרם אחורי של תאים לתוך הזגוגיות כאשר המחט "ניתק". לעומת זאת, הגישה הטרנס-בסקלרה, בעקרון, מונע מעורבות של הרשתית, הזגוגיות, ויוצא זרם אחורי העין. בחולדות פיגמנט, המנתח יכול לצפות בתחילה חדירה בסקלרה, אבל לאחר המעבר לתוך דמית פיגמנט, בקצה המחט אינה גלויה. ללא התבוננות ישירה, פורצים הרשתית נפוץ, עלול לגרום הקרע ברשתית ואספקה של תאים ו/או דם לתוך הזגוגיות. יתר על כן, כי השטח העין עקום, זה מאוד קשה לדעת איזה זוויות המחט ועומקי יעילים ביותר לזריקות טרנס-scleral.
במאמר זה דמיינו, אנחנו מציגים את שיטת הזרקת subretinal טרנס-scleral הודיע על ידי שימוש הערכות לאחר ניתוח עם אופטי טומוגרפיה קוהרנטיות (אוקטובר), אשר מאפשר בדיקה מקיפה של ההזרקה. הטכניקה שלנו הזרקה טרנס-scleral מנצל במיקומים מוגדרים, זוויות, בעומק של מחטים הזרקת לייצר טראומה כירורגי נמוך מאוד, אמינות גבוהה. כאן, במיוחד נדגים ההזרקה של תאי hRPESC-RPE לחלל subretinal של העכברוש RCS, דגם פרה-קליניים של AMD אנושי. בשיטה זו זריקה, בהצלחה ובעקביות נמסר לנו תאים hRPESC-RPE לחלל subretinal RCS עיניו חולדה עם שיעור הצלחה גבוה מאוד. הזרקה של תאי נמצאה בעבר את התוצאה שימור RCS photoreceptors לפחות 2 חודשים לאחר הזרקת13. הליך זה מבוצע תחת המיקרוסקופ ויבתר והוא קל ללמוד. זה דורש שני אנשים (מנתח ועוזר) כדי לבצע את הזריקה, הזמן הממוצע של הזרקת עבור כל בעל חיים הוא פחות מ-5 דקות. זוויות מוגדר ועומקי מחטים הזרקת מאפשרים עבור מעבדות, איפה OCT אינה זמינה להשיג הזרקת subretinal מוצלח. הוא מאפשר גישה subretinal מאוד לשחזור, יכול לשמש לא רק עבור השתלת תא, אלא גם עבור טיפולים תרופתיים משלוח וג'ין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC)-המדינה באוניברסיטת ניו יורק באולבני.
1. הזרקת טרום הכנה
-
הכנת השעיה תא hRPESC-RPE
הערה: כל השלבים הבאים מבוצעות בתרביות רקמה סטרילי הוד, היכרות עם סטרילי טכניקה בסיסית נדרשת.- בידוד תאי hRPE העיקרי של האדם תורם העיניים בגילאי 50-90 שנים ותאים תרבות. ובכן 24 צלחות12. Cryopreserve התאים-מעבר 1, הפשרה לפי הצורך ותרבות המעבר 2 תאים (P2) למשך 4-5 שבועות (איור 1 א') להזרקה.
- להסיר את תרבות בינוני12 , ואז בעדינות וולס יש לשטוף פעמיים עם 500 µL מראש 1 X של Dulbecco פוספט Buffered מלוחים ללא סידן & מגנזיום (1 x DPBS-CMF) על-ידי הוספת 1 X DPBS-CMF לתוך בארות באמצעות פיפטה 1,000 µL והסרה של אותו באמצעות ואקום.
- להוסיף טריפסין µL 300/DNAse מכל קידוח. דגירה תאים hRPESC-RPE טריפסין/DNAse (4 kU DNase לכל 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA) במשך 4 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מביצועם התאים.
- בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לראות אם הם יש המעוגל כלפי מעלה. להמשיך דגירה התאים טריפסין/DNase למשך 2 דקות נוספות, אם הם לא יש מעוגל למעלה עדיין.
- לאחר התאים מעוגלים, להשתמש פיפטה 1,000 µL triturate התאים מנותקת מן הבאר ולהעביר את טריפסין/DNase המכיל תאים מנותקת לתוך צינור חרוטי 15-mL עם שווה נפח בינוני תרבות ומחוממת מראש, כדי להשבית את טריפסין/DNase.
- לשטוף את וולס עם מראש ומחוממת 1 X DPBS-CMF מאת בעדינות pipetting למעלה ולמטה, במיוחד מסביב לקצוות של הבאר; לאחר מכן להוסיף תאים אלה הצינור חרוט הקודם.
- Centrifuge צינור חרוטי ב 286 g x דקות 5-4 ° C עד הצניפה התאים.
- הסר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים בינונית 1 מ"ל-תרבות.
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- צנטריפוגה-286 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה התאים.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend תאים ב סטרילי מאוזנת מלח פתרון (BSS) ב- 50,000 תאים/µL (להעביר 50,000 תאים בנפח µL 1 במהלך ההזרקה subretinal).
- העברת התליה תא הסופי (CS) לתוך צינור 1.7-mL microcentrifuge זכור כי תערובת קרח-מים עד שימוש בהזרקה.
-
הכנת מזרק תא
- מכניס מחט סטרילית של משופע 33-מד הזרקת מזרק, בורג בחוזקה כדי להרכיב את מזרק.
- לרוקן את מזרק עם אתנול 100% 5 - 6 פעמים.
- לרוקן את מזרק עם אתנול 70% 5 - 6 פעמים.
- לרוקן את מזרק עם BSS 5 - 6 פעמים.
- סמן את המחט מזרק עם עט סטרילי הסמן השחור במיקום של מיקרומטר 600 מן קצה המחט תחת המיקרוסקופ ויבתר (איור 1B).
- מניחים את מזרק על micromanipulator להזרקה.
2. הזרקת subretinal
-
האזור הכירורגי והכנת בעלי חיים
- שוקל חולדה RCS שבוע 4-5 (60-100 גרם), עזים ומתנגד זה באמצעות מערכת משלוח של אדי איזופלוריין.
הערה: כדי לגרום הרדמה לשמור על קצב הזרימה איזופלוריין ב-5%. לאשר את העומק של הרדמה על ידי לחיצה על הכפות ולאחר מכן להקטין את קצב הזרימה ל 2-3% לתחזוקה הרדמה במהלך הניתוח. - במקום תלוי ניתוח סטרילי, עם כרית חימום מתחת, על הבמה של המיקרוסקופ ויבתר כדי להגדיר את אזור כירורגי סטרילי.
- להעביר את העכברוש האזור הכירורגי ולמקם את החולדה בגביע האף מחובר למערכת איזופלוריין לשמור על הרדמה.
- לכסות את הגופה של החולדה עם גזה. קמצוץ הבוהן של החולדה כדי לאשר הרדמה מלאה.
- שוקל חולדה RCS שבוע 4-5 (60-100 גרם), עזים ומתנגד זה באמצעות מערכת משלוח של אדי איזופלוריין.
-
הזרקת subretinal טרנס-scleral תחת המיקרוסקופ
- יש לטפטף לעין טיפת למרוח את העין unoperated של החולדה.
- מקם את החולדה על הצד השמאלי שלו בעין השמאלית שלו מול התקרה עבור הזרקה, ראשו לכיוון היד הימנית של המנתח, גבו לכיוון המנתח.
- חתוך כל שפם לכסות את העין עם מספריים קטנות.
- לטפטף כמות קטנה של שטיפת עיניים מהצד הטמפורלי של העין השמאלית ולאסוף את עודף בצד האף עם המוליך כותנה לשטוף את העין.
- אני התלמיד עם 1% tropicamide ו- 2.5% phenylephrine (טרי מתוצרת מ 10% phenylephrine לדלל אותה ב- saline 0.9% סטרילי ביום של הניתוח) עבור בדיקת OCT שלאחר הזרקת על-ידי החלת טיפה אחת...
- משוך בעדינות את העור סביב העין 4 - 6 פעמים כדי לפתוח העפעף כך העין היא מעט proptosed לצורך גישה קלה יותר באזורים האחוריים לימבוס.
- החל טיפה של שטיפת עיניים, לשמור על לחות העין.
- בעדינות triturate CS (להכין בשלב 1.1.12) ולטעון את מזרק עם 1.2 µL CS. µL 0.2 נוסף משמש כדי לפצות על הזרקת זרם אחורי.
הערה: בהתבסס על המידות שלנו, על 5000-8000 תאים אבודים בתוך זרם אחורי עם זריקה של 50,000 תאים/µL השווה לכ-10-16% של איבוד תאים, תוספת של 0.2 µL CS הוזרק לפיצוי על אובדן תא זה. - מקם את מזרק מלא עם CS-micromanipulator (או עוזר להחזיק את זה) אנכית בתור RPE התאים נוטים לשקוע בקלות ההשעיה.
- החל ירידה של 0.5% proparacaine (מקומיים הרדמה מקומית) על העין, להסיר את עודף עם המוליך כותנה.
הערה: שלב זה צריך לדכא את רפלקס המצמוץ ולמנוע לעין למצמץ במהלך והשלבים. - להשתמש מלקחיים כדי לאחוז לחמית האחורי לימבוס, לסובב את העין אפילו, והרם לחמית לעשות "אוהל".
- להשתמש במספריים לחתוך את החלק העליון של "האוהל" לעשות חור קטן בלחמית ולחשוף את sclera הבסיסית.
- להשתמש מלקחיים כדי לאחוז בקצה של השוליים לחמית הנותרים לצד לימבוס וסובב לעין אפילו כך שהציר האישון הוא בזווית של 30 מעלות ביחס השולחן (איור 1C). המשך מרתק השוליים לחמית נדרש לספק כוח נגד במהלך המחט הוספות וכדי לשמור על העין בזווית אופטימלית.
- לעשות חור פיילוט להזרקה תא, מיקום סוף מחט סטרילית משופע אינסולין 31-מד ב 1200-1500 מיקרומטר האחורי לימבוס עם פתיחתו של קצה פונה כלפי מעלה.
- להתאים את הזווית של המחט אינסולין כך. זה 10-15 מעלות מעל sclera (וצורניים עד מטוס דמיוני באתר הזרקת המיועד). אט-אט לחדור המתחם בסקלרה-choroid המחט לעומק של-500 מיקרומטר. בחולדה פיגמנט, בקצה המחט "ייעלמו" מתחת דמית פיגמנט. עבור המותג של אינסולין מחט בשימוש כאן, המרחק בין קצה המחט אל שפוע הוא 500 מיקרומטר.
- תיסוג בקפידה את המחט אינסולין (תפליט קטן מאוד של דם, ניתן לראות).
- אם דימום יתר הוא ציין, ניתן להחיל על חנית העין כדי לנקות את החור, במידת הצורך. דימום מתמשך לאחר היישום חנית מציין כלי קיבול נפגמה.
- מדריך מחט מזרק שנטענו תא RPE לתוך החור פיילוט, עם פתיחת פונה למטה, בזווית של כ- 10-15 מעלות ביחס השטח המקומי של sclera.
- הכנס בעדינות את המחט מזרק לתוך החור פיילוט עד לעומק של-500 מיקרומטר, כדי לגשת אל החלל subretinal. צריך להיות על שוליים 100 מיקרומטר בין הקצה של הסימן עט שחור לנקודה בה המחט מכוסה על ידי דמית פיגמנט (איור 1C וד' 1).
- לשאול את העוזרת בעדינות את הבוכנה של המזרק מזרק להחדיר את אמצעי האחסון המתאים של תאים (בערך 1.2 µL). תהיו מוכנים לספק כוח כלשהו נגד כעוזר לוחץ על הבוכנה.
הערה: תרגול מעושה מוקדמת עם המסייע יכול לספק של המנתח וגם עוזר עם ניסיון הכרחי עם שלב זה. - תוך התמקדות באופן חזותי העט מארק קצה, להחזיק את מזרק במקום עבור 25-30 s, ואז לאט לאט. משכי את מזרק. כמות קטנה של זרם אחורי בדרך כלל נצפית.
הערה: אם אין זרם אחורי נצפית, אולי היו זריקה intravitreal. אם אתה רואה זרם אחורי דרך חותם או תאים מילוי מתחת בסקלרה, הזרקת היה רדוד מדי. - לשטוף את בזרימת תא מן האתר הזרקת לשטוף את העין סטרילית 3 פעמים ולאסוף את העודפים עם המוליך כותנה.
- להחיל יש לטפטף לעין טיפת על העין המופעלים ולהעביר את החולדה לתחנת OCT כדי לבחון את המיקום של התאים המושתלים ואת גודל bleb subretinal.
3. הזרקת שלאחר הטיפול
-
אנטי דלקתיות וטיפול משכך כאבים
- להזריק הבופרנורפין-0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף בתוך תמיסת מלח subcutaneously להפחתת הכאב.
- להזריק דקסמתזון ב 1.6 מ"ג/ק"ג משקל גוף בתוך תמיסת מלח בזריקה בקרום הבטן (I.P.) עבור פקד דלקת.
-
שחזור בעלי חיים
- להחזיר את החולדה לכלוב. שחזור תחת מנורת חימום לשמירה על טמפרטורת הגוף.
- להתבונן העין המופעלים סימנים של דימום.
- להתבונן העכברוש כדי להבטיח שמגיע מההרדמה.
- לחזור החיה התאושש כלוב טריים בדגל את הכלוב עם כרטיס ניתוח ו לפקח מדי יום על סימנים של מצוקה, דימום עינית או אטימות הקרנית. הודע הוטרינר באופן מיידי אם יש חששות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש בטכניקה המתוארת במאמר זה, אנחנו בעקביות נמסר hRPESC-RPE תאים לחלל subretinal של חולדות RCS על ידי שליטה בדיוק את מיקום, זווית ועומק של החדרת מחט מזרק לתוך הרקמה (איור 1B-D ). מיד בוצעה ההשתלה הבאים, בדיקת OCT להתבונן ההזרקה, את bleb subretinal שנוצרו על-ידי התאים המושתלים. לאחר ניתוח ההערכה OCT משמש ככלי מיון להערכת האיכות של זריקות ומעקב ברשתית או דימום. שניהם bleb subretinal (איור 2 א, C ו- D), ההזרקה (איור 2 א ו- B) ניתן היה לראות בבירור תחת OCT סריקה. Bleb subretinal פותר בדרך כלל בתוך 24 שעות לאחר ההזרקה. מדידה של הגודל של מגדלים פורחים אמנם קשה באמצעות OCT, אנו יכולים להעריך את האזור bleb בהנחה שזה שווה להאזור לשימור קולט אור על ידי השתלת תא. אנחנו הפגינו בעבר כי זריקה µL 1 של 50,000 תאים עלולה לחסוך כ- 6-7% שטח של הרשתית RCS סביב האתר הזרקת13. כפי שמוצג באיור 2A, C ו- D, הרשתית שכבות היו ללא פגע במקום ההזרקה, הדם לא זוהה על bleb, התאים לא נצפתה את הזגוגיות, הוכחת מינימלי הטראומה הנגרמת על ידי ההזרקה. בנוסף, להחליפן בתמונות OCT של זריקות שנכשלו נכללו גם לעיון (איור 2E ו- F).
עם השימוש של OCT ככלי משוב, אנחנו אופטימיזציה את הזווית ואת עומק החדירה מחט מזרק לתוך הרקמה. ברגע אופטימיזציה, שיטה זו מאפשרת לנו להשיג שיעור הצלחה של גישה subretinal 90.8% 5.7% בלבד כירורגית נכשל, בהתבסס על התוצאות של יותר מ-300 זריקות subretinal קודמות שבוצעו שלנו אחרים מחקרים13 (טבלה 1). ב- 3.5% הנותרים, לא בוצעו מכמה סיבות, כולל העיניים לא במצב הולם עקב עין הרדמה-הקשורים איזופלוריין מתגלגל17OCTs.
ב 7 ימים לאחר ההשתלה, העיניים עכברוש המופעלים היו enucleated, תועקשה משרטוטי לניתוח immunohistological. סמן גרעיניים (Hunu) של התא האנושי18 של סמן (OTX2) תאי RPE19 שימשו כדי לזהות את התאים המושתלים. איור 3 הראה בשכבה עבה של תאי RPE המושתלים בחלל subretinal זה, שבוע לאחר הזריקה, היתה מוכתמת באופן חיובי עם שני הסמנים, המאשרת את הזהות ועל אספקת השתלות מוצלחות. -שבוע לאחר ההזרקה, מספר גדול של תאים, כפי שמוצג באיור 3C, ייתכן במהירות מסרב מספר קטן מאוחר יותר עקב מארח התגובה החיסונית אפילו immunosuppressed RCS חולדות20. למרות זאת, כפי שהוזכר לעיל, ניתן למצוא השכבה קולט אור מנוונת של עיני עכברוש RCS להינצל לפחות 2 חודשים לאחר ההשתלה עם hRPESC-RPE13.
איור 1 : תמונה של תאים hRPESC-RPE P2 4 - בן שבועיים, הפגנה של הזווית ואת עומק המשתמשת מחט מזרק במהלך ההזרקה. (א) תמונת שלב-ניגודיות של תאים 4 - בן שבועיים של hRPESC-RPE P2 להשתמש להזרקה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) שרטוט המציג את המרחק מיקרומטר 600 בין הקצה של דה מרקר על הקצה של מחט מזרק נמדדת microscale. בטקס סיום מינימום microscale הוא 100 מיקרומטר. (ג) קריקטורה מראה חתך הרוחב של המבנה האנטומי של העין עכברוש ונוף בצד הזווית ואת עומק מחט מזרק מוסיף לתוך הקיר העין. הציר האישון של העין החולדה היא 30 מעלות ביחס השולחן והיא מחט מזרק 15 מעלות ביחס השטח המקומי של גלגל העין. (ד) קריקטורה מראה את נקודת ההתחלה של דה מרקר על מחט מזרק, מהנוף העליון של ההזרקה איפה מיקרומטר 500 של המחט מזרק מוכנס לתוך הרקמה ורווח 100 מיקרומטר שנשאר בין הפתח של החור הזרקת קצה מארק ר. המיקום של החור הוא 1200-1500 מיקרומטר האחורי לימבוס. קצה המחט מוצג בצד שלה, אבל צריך להיות פנים למטה במהלך ההזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : OCT תמונות של העין עכברוש המופעלים מיד לאחר ההזרקה. (א) תמונה OCT B-סריקה של עין המופעלים מציג subretinal bleb, הזרקת אתר, ללא דימום intravitreal. (ב) OCT נפח עוצמת הקרנה (VIP) תמונה של סדרה B-scan המייצג את התמונה הפונדוס enface של אזור מוזרק. ההזרקה קטן מוצגת בתמונה VIP מציג את הטראומה מינימלי. (ג לסמן תמונת OCT מוגדלת) (א) מראה התאים המושתלים בחלל subretinal עם כל שכבות הרשתית. תמונה זו הוכיחה כי התאים המושתלים היו ממוקמים במרחב subretinal. (ד) OCT B-סריקת תמונה המציגה bleb subretinal של גודל ממוצע. (ה) OCT B-סריקת תמונה המציגה את זריקת subretinal נכשלה כאשר CS ממוקם בחלל intravitreal. (ו) OCT B-סריקת תמונה מראה זריקת subretinal כושל עם הרשתית כולו מציץ דרך באתר הזרקת. גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : Immunohistological מכתים של רשתית קפוא מקטעים לאחר השתלת תאי hRPESC-RPE. (א) התא האנושי גרעיני סמן (Hunu) צביעת המציין את הגילוי של תאי RPE אדם המושתלים. (B, E) תא הגרעין מונה מכתים (4', 6-diamidino-2-phenylindole; דאפי) מציג את שכבות הרשתית, השתלת ו RPE שכבה. (ג) התמונה הממוזגת של Hunu, דאפי המציין כי התאים המושתלים hRPE ממוקמים במרחב subretinal. ההפרדה בין השתלת השכבה RPE הוא חפץ עיבוד הקשורים עם הגנה על הקפאה העיניים RCS למקטעי קפוא. (ד) RPE תא סמן (OTX2) צביעת תאי RPE האנושי המושתלים. (ו) התמונה הממוזגת של OTX2, דאפי. סרגל קנה מידה = 20µm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| סה כ מוזרקים RCS העיניים עכברוש | מגדלים פורחים subretinal טוב תחת OCT | מגדלים פורחים subretinal קטן תחת OCT | סה כ שאינו מורכב subretinal מגדלים פורחים תחת OCT | Complicatd subretinal מגדלים פורחים תחת OCT (קרי בועת האוויר בפנים או דימום ברשתית) | אין OCT שבוצעה | הניתוח נכשל (אין bleb subretinal תחת OCT) | |
| ספירה | 314 | 260 | 25 | 285 | 5 | 6 | 18 |
| % סה כ העיניים מוזרק | ------ | 82.80% | 7.96% | 90.76% | 1.59% | 1.91% | 5.73% |
| (נתונים אלו מסוכמים של עשר גדודים של זריקות subretinal בחולדות RCS) | |||||||
טבלה 1: סיכום של זריקות subretinal מ 10 גדודים ניסויים בחולדות RCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקת הזרקת subretinal המתואר במאמר זה היא באמצעות מסלול טרנס-scleral, שבו מחט מזרק חודר השכבות החיצוניות (sclera-שכבה דמית-RPE קומפלקס) של הקיר העין ללא פגיעה עצבית ברשתית או מטריד את חלל בזגוגית. גישה טרנס-vitreal חלופי יש סיכון פוטנציאלי של העדשה נזק המוביל קטרקט, מאז עדשה של מכרסמים שוכן הרוב של חלל בזגוגית. בהשוואה לשיטה זו, הטכניקה שלנו פחות מסוכן וגורם טראומה מינימלית כמו מחט מזרק אינו צריך לחצות כל חלל בזגוגית להגיע לשטח subretinal. אכן, OCT בדיקות במחקרים שלנו הראה אירועים חדירה רשתית נדירים מאוד ויש, בבחינות להמשך טיפול בבעלי חיים, אין detachments ברשתית מתמיד. בנוסף, ההזרקה הוא קטן מאוד (< 200 מיקרומטר בקוטר) כאשר באמצעות מזרק 33-מד מחט אז הפרעה מבנית של המתחם בסקלרה-שכבה דמית-RPE מצומצמת מאוד. לאחר התנצלות מחט, החור הזרקה עצמית חותמות באופן אוטומטי אז בלי תפר או רקמות דבק יש צורך.
סיבוכים עם הניתוח כוללים דימום יתר באזור הזרקת או מתוך החור פיילוט. בעת שימוש מלקחיים כדי לאחוז את שולי לחמית לימבוס, כוח רק עדין נחוץ כדי למנוע התכווצות כלי הדם או להקטין את הדימום אפשרי. לפני יצירת החור פיילוט, לבחון ההזרקה נועד כדי למנוע חדירה של כלי דם שטחיים. באמצעות חנית, ניתן לפנות את החור פיילוט של דם. לפני החדרת המחט הזרקת תאים. אם הדימום מ החור פיילוט נמשכת לאחר מספר יישומים של החנית, קיבול ייתכן היה שבור. סיבוך נוסף הבחנו הוא אחוז קטן של חולדות RCS לפתח אטימות הקרנית וכאב לאחר הניתוח. במקרים מסוימים, האטימות היו כרונית, אחרים היו ארעית. בעלי אטימות מתמיד הוסרו מקבוצת המחקר. לאטימות קרניות יכולה להתפתח עקב יובש בעין, נזק פיזי, דלקת, תרופות או גירוי כימי21. כדי להפחית את היווצרות שלהם, העין צריכה להישמר לח על ידי שמירה על סיכוך עין בשפע, והימנע מלגעת הקרנית של המוליך כותנה או כלים אחרים במהלך המבצע.
פרוטוקול הזרקת המתוארים כאן שימושים הגישה מוגדרת הזוויות ואת המחט המעמקים יחסי ציוני דרך עינית וזוויות עין יחסית הטבלה כירורגי ב הגדרת שלנו. השימוש שלאחר הזרקת OCT סריקות היה חשוב בבית זיקוק פרמטרים הזרקה אלה כדי לספק שליטה לשחזור של השתלת תאי RPE לחלל subretinal של החולדות עם רמת דיוק גבוהה. ברגע שולט על ידי תרגול חוזר ונשנה, השיטה היא פשוטה לביצוע. מומלץ, במיוחד באימון, כי לאחר ניתוח בחינות עינית מבוצעות לקביעת תוצאות. הזווית ואת עומק ההזרקה המחט יהיה צורך סביר ההתאמה בהתאם למשוב זה בהתאם הסידור כירורגי, הגיל של בעלי חיים, ו/או אם נעשה שימוש מיני בעלי חיים אחרים (למשל, עכבר).
כדי להעריך את איכות הזרקת ולקבוע הכללה או אי הכללה של מחקר, הנוכחות של subretinal בלד OCT תוך התבוננות היא קריטית. במעבדות, איפה OCT אינה זמינה, הקריטריונים המתוארים להלן יכול לשמש עבור הקרנה מהירה על ידי מנתחים כדי לא לכלול הזרקת חשד נכשל: (1) לפני הזרקת: (א) חור טייס עשוי עמוק מדי (כלומר, עומק משמעותי > 500 מיקרומטר; עבור המותג של אינסולין מחט בשימוש, המרחק בין קצה המחט עד לאמצע השיקוע הוא 500 מיקרומטר). (ב) טייס חור מדמם בצורה מוגזמת (קרי, דימום לא יכול להיעצר על ידי הפעלת כוח על החור עם חניתות העין). (ג) הזרקת מחטני עמוק מדי (כלומר, עומק משמעותי > 500 מיקרומטר או דה מרקר על הזרקת מחטני נכנסת לתוך הרקמה מורכבים בסקלרה/דמית העין/RPE). (2) במהלך ההזרקה: (א) אין אפשרות לשמור את המחט הזרקה לתוך החור הטייס במהלך ההזרקה. (ב) זליגת מיד סביב המחט הזרקת במהלך ההזרקה. (ג) הזרקת מחטני דחף עמוק מדי (כלומר, דה מרקר על המחט הזרקת הולך לתוך הרקמה מורכבים בסקלרה/דמית העין/RPE) כמו לב על ידי המנתח במהלך ההזרקה. (ד) אין אפשרות לשמור את המחט הזרקת בעמדה במשך יותר מ 5 שניות לאחר הזריקה. (ה) יתר דם כאשר פותחים את המחט הזרקה. (ו) אין זרם אחורי/בזרימת ראיתי לאחר נסיגה של המחט הזרקת בשילוב עם שלב 2.
יחדיו, עם ניהול זהיר של מיקום המחט, זוויות, בעומק, טכניקת הזרקה טרנס-scleral subretinal הוא מאוד אמין, מדויק, והוא מסוגל לשאת טראומה כירורגית מינימלית. עם כל היתרונות האלה, ניתן להשתמש בטכניקה זו לא רק עבור משלוח של תאי RPE, אלא גם עבור סוגי תאים אחרים, תרכובות או בטיפולים גנטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנחנו רוצים להודות לפטי לדרמן על הסיוע על הניתוח, סוזן בורדן להכנה תאי RPE. אנו גם להכיר NYSTEM C028504 לצורך מימון לפרויקט זה. ג'סטין ד מילר נתמך על-ידי NIH הענק F32EY025931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P.
