Summary
Subretinal injektion har tillämpats allmänt i prekliniska studier av stamceller substitutionsterapi för åldersrelaterad makuladegeneration. I denna visualiserade artikel beskriver vi ett mindre riskfyllt, reproducerbar och just modifierade subretinal injektionsteknik via trans-skleral strategi att leverera celler in råtta ögon.
Abstract
Degenerativa retinala sjukdomar såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är den vanligaste orsaken till irreversibel synnedsättning i hela världen. AMD kännetecknas av degeneration av retinal pigment epitel (RPE) celler, som är en enskiktslager av celler funktionellt stöd och anatomiskt omslag runt neurala näthinnan. Aktuella farmakologiska behandlingar för icke-neovaskulär AMD (torr AMD) bara sakta ner sjukdomsförloppet men kan inte återställa vision, vilket nödvändiggör studier syftar till att identifiera nya terapeutiska strategier. Ersätta de degenerativa RPE-cellerna med friska celler håller löfte att behandla torr AMD i framtiden. Omfattande prekliniska studier av stamceller ersätter behandlingar för AMD innebär transplantation av stamceller-derived RPE-celler i subretinalområdet av djurmodeller, som den subretinal injektionstekniken används. Metoden används oftast i dessa prekliniska Djurstudier är genom trans-skleral rutten, som försvåras av bristen på direkt visualisering av nålen slutet och kan ofta resultera i skada på näthinnan. Ett alternativt tillvägagångssätt genom glaskroppen möjliggör direkt observation av nålen slutpositionen, men det innebär en hög risk för kirurgiska trauman som mer ögats vävnader störs. Vi har utvecklat en mindre riskabelt och reproducerbara modifierade trans-skleral injektion metod som använder definierade nål vinklar och djup att framgångsrikt och konsekvent leverera RPE-celler i subretinalområdet råtta och undvika överdriven skada på näthinnan. Celler som levereras på detta sätt har tidigare visat sig vara effektiva i Royal College of Surgeons (RCS) råtta i minst 2 månader. Denna teknik kan användas inte bara för stamcellstransplantation, men också för leverans av små molekyler eller genterapi.
Introduction
Den mänskliga näthinnan sitter bakpå funktionerna ögat som ett ljus sensoriska vävnad och spelar en avgörande roll i vision perception. Retinal cellfunktion eller celldöd därför orsakar synproblem eller permanent blindhet. Störningar som involverar degeneration eller dysfunktion av celler i olika lager av näthinnan som kallas degenerativa retinala sjukdomar, bland vilka AMD är den vanligaste typen och den vanligaste orsaken till irreversibel blindhet hos äldre i utvecklade länder 1,2. Den patologiska processen av AMD associeras med ”drusen” ackumulering mellan RPE lagret och den underliggande Bruchs membran, som i sin tur försämrar RPE stöd av ljusmätare fysiologi, leder till neurala retinal atrofi och vision förlust3, 4,5. Hittills finns det ingen bot för avancerade torr (icke-neovaskulär) AMD. Uppkomsten av stamcellsterapi som ett nytt paradigm inom regenerativ medicin ger hopp om att ersätta de dysfunktionella eller döda RPE-cellerna med stamceller-derived friska celler. Faktiskt, omfattande prekliniska studier att transplantera stamceller (t.ex., mänskliga embryostamceller)-härledda RPE-celler i RPE-degenerativa djurmodeller har varit utförda6,7, varav vissa har nått kliniska prövningar8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Nyligen, en alternativ källa av stamceller som är bosatta i det mänskliga RPE lagret, de mänskliga RPE stamcellerna (hRPESCs), identifierades av vårt labb och används för närvarande i prekliniska studier av hRPESC härrör-RPE (hRPESC-RPE) transplantation cellterapi för AMD 10 , 11 , 12 , 13.
Den subretinal injektionstekniken används i de prekliniska studierna ovan av flera grupper, inklusive vår grupp. Det finns två generella metoder subretinal injektionsvätska i djur: trans-vitreal och trans-skleral. Den trans-vitreal metoden har fördelen att kirurgen att kunna direkt observera nål slutet som den tränger främre ögat, korsar hela vitreal hålrummet intill linsen och tränger på näthinnan baktill i ögat att nå subretinala utrymme14,15,16. Det kräver dock störa näthinnan på två platser (främre och bakre), bär risken för skador på linsen, och kan resultera i återflödet av celler i glaskroppen när nålen är indraget. Däremot metoden trans-sklera, i princip undviker inblandning av näthinnan och glaskroppen, och återflödet lämnar ögat. I pigmenterad gnagare, kirurgen kan initialt Observera genomträngningen av sklera, men efter passagen i pigmenterad åderhinnan, nål slutet är inte längre synlig. Utan direkt observation, bryter mot näthinnan är vanligt och kan resultera i näthinnans dissektion och leverans av celler eller blod i glaskroppen. Dessutom eftersom ögats yta är böjda, är det mycket svårt att veta vilka kanyl vinklar och djupet är mest effektiva för trans-skleral injektioner.
I denna visualiserade artikel introducerar vi en trans-skleral subretinal injektion metod informerade genom användning av postoperativa utvärderingar med optisk koherenstomografi (OCT), vilket gör att en detaljerad granskning av injektionsstället. Våra trans-skleral injektionsteknik använder tredjeparts definierade platser, vinklar och djup för injektionsnålar att producera mycket låg kirurgiskt trauma och hög tillförlitlighet. Här visar vi specifikt injektionen av hRPESC-RPE-celler i subretinalområdet RCS råttans, en preklinisk modell av mänskliga AMD. Med denna injektion metod levererat vi framgångsrikt och konsekvent hRPESC-RPE-celler i subretinalområdet av RCS råtta ögon med en väldigt hög framgång. Injektion av celler befanns tidigare resultera i bevarandet av RCS fotoreceptorer minst 2 månader efter injektion13. Denna procedur utförs under mikroskopet dissekera och är lätt att lära. Det krävs två personer (en kirurg och en assistent) för att utföra injektionen och den genomsnittliga tiden för injektion för varje djur är mindre än 5 minuter. De definierade vinklar och djup för injektionsnålar gör det möjligt för laboratorier, där OCT är tillgänglig, att uppnå framgångsrika subretinal injektion. Den möjliggör mycket reproducerbara subretinal tillgång och kan användas inte bara för stamcellstransplantation, men också för leverans och gen läkemedelsbehandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar djur har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid State University of New York at Albany.
1. före injektion förberedelse
-
Beredning av en hRPESC-RPE cellsuspension
Obs: Alla följande steg utförs i sterila vävnadsodling huva och förtrogenhet med grundläggande steril teknik krävs.- Isolera primära hRPE celler från mänskliga donator ögon i åldrarna 50-90 år och kultur celler i 24 brunnar12. Frysa cellerna på passage 1, blidvädret som behövs och kultur passage 2 (P2) celler för 4-5 veckor (figur 1A) injektionsvätska.
- Ta bort de odlingsmedium12 och försiktigt skölj brunnar två gånger med 500 µL före värmde 1 X Dulbeccos fosfat buffrad koksaltlösning utan kalcium & Magnesium (1 x DPBS-CMF) genom att lägga till 1 X DPBS-CMF i brunnar med 1000 µL pipett och ta bort det med en dammsugare.
- Tillsätt 300 µL trypsin/DNAS till varje brunn. Inkubera hRPESC-RPE-celler i trypsin/DNAS (4 kU DNAS per 1 mL 0,25% trypsin-EDTA) under 4 minuter vid 37 ° C att separera celler.
- Kontrollera cellerna i Mikroskop för att se om de har avrundat uppåt. Fortsätta att Inkubera cellerna i trypsin/DNAS för en ytterligare 2 min om de inte har rundade ännu.
- När cellerna är avrundat, använda 1000 µL pipett att pulverisera fristående cellerna från brunnen och överföra den trypsin/DNAS som innehåller fristående celler in i en 15 mL koniska rör med lika volym före värmde odlingsmedium, att inaktivera den trypsin/DNAS.
- Skölj brunnar med pre värmde 1 X DPBS-CMF genom pipettering försiktigt upp och ner, särskilt runt kanterna på väl; Lägg sedan till dessa celler tidigare koniska röret.
- Centrifugera koniska röret vid 286 x g i 5 minuter vid 4 ° C till pellet cellerna.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med 1 mL odlingsmedium.
- Räkna de celler som använder en hemocytometer.
- Centrifugera vid 286 x g i 5 minuter vid 4 ° C till pellet cellerna.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i sterila balanserad Salt lösning (BSS) på 50.000 celler/µL (att leverera 50.000 celler i 1 µL volym under subretinal injektion).
- Över den slutliga cellsuspensionen (CS) till en 1,7 mL mikrocentrifug rör och hålla i ett is-vatten blandningen tills injektionen användning.
-
Beredning av cell injektor
- Infoga en steril 33-gauge avfasade nål in i injektionssprutan och skruv hårt att montera injektorn.
- Spola injektorn med 100% etanol 5 - 6 gånger.
- Spola injektorn med 70% etanol 5 - 6 gånger.
- Spola injektorn med BSS 5 - 6 gånger.
- Markera den injektorn nål med en steril svart tuschpenna på en position 600 µm från spetsen på nålen under mikroskopet dissekera (figur 1B).
- Placera injektorn på en micromanipulator för injektion.
2. subretinal injektion
-
Kirurgiska området och djur förberedelse
- Väger en 4-5 vecka gammal RCS råtta (60-100 g) och söva den med isofluran vapor leveranssystemet.
Obs: Att inducera anestesi hålla av isofluran flöde på 5%. Bekräfta djup anestesi genom att trycka på tassarna och sedan minska flödet till 2-3% för anestesi underhåll under operation. - Placera en steril kirurgi drapera, med en värmedyna under, på scenen av mikroskopet dissekera att ställa in en sterila kirurgiska området.
- Överföra råtta till det kirurgiska området och placera råtta i en Kona ansluten till isofluran systemet att underhålla anestesi.
- Täcka råttans kropp med gasväv. Nypa råttans tå för att bekräfta narkos.
- Väger en 4-5 vecka gammal RCS råtta (60-100 g) och söva den med isofluran vapor leveranssystemet.
-
Trans-skleral subretinal injektion under lupp
- Applicera en droppe öga smörjmedel på råttans unoperated öga.
- Position på råtta på dess högra sida med sitt vänstra öga mot taket för injektion, dess huvud mot kirurgens högra hand och ryggen mot kirurgen.
- Trimma alla morrhår som täcker ögat med liten sax.
- Droppa en liten mängd ögondusch från temporal sida av vänster öga och samla in överskottet på näsans sida med en bomull applikator att skölja ögat.
- Vidgas pupillen med 1% Tropikamid och 2,5% fenylefrin (nygjorda från 10% fenylefrin genom att späda ut det i steril 0,9% koksaltlösning på operationsdagen) för en efter injektion OCT examen genom att applicera en droppe av varje.
- Dra försiktigt huden runt ögat 4 - 6 gånger öppna ögonlocket så att ögat är något proptosed för enklare tillgång till regioner posteriort om limbus.
- Applicera en droppe ögondusch och hålla ögat fuktigt.
- Försiktigt pulverisera CS (bereddes i steg 1.1.12) och läsa in injektorn med 1,2 µL CS. Den extra 0.2 µL används för att kompensera för injektion återflödet.
Obs: Baserade på våra mätningar, om 5.000-8.000 celler går förlorade i återflödet med en injektion av 50.000 celler/µL som motsvarar ca 10-16% av cellförlust och en extra 0.2 µL CS injicerades för att kompensera detta cellförlust. - Placera injektorn fylld med CS på en micromanipulator (eller ha en assistent som håller den) vertikalt som RPE celler tenderar att sjunka enkelt i suspension.
- Applicera en droppe 0,5% proparacaine (lokala aktuell bedövningsmedel) på ögat och ta bort överskottet med en bomull applikator.
Obs: Detta steg bör undertrycka den hornhinna reflexen och förhindrar att ögat blinkar under efterföljande steg. - Använd tången för att greppa bindhinnan posteriort om limbus, rotera ögat nasalt, och lyfta bindhinnan för att göra ett ”tält”.
- Använd sax avskurna toppen av ”tältet” att göra en liten öppning i bindhinnan och exponera underliggande sklera.
- Använd tången att greppa kanten av återstående bindhinnan marginalen bredvid limbus och rotera ögat nasalt så att pupilldeformitet axel är i en vinkel på ca 30 grader i förhållande till bordsskivan (figur 1 c). Fortsatt gripande av bindhinnan marginalen behövs att ge en bekämpa kraft under nålen infogningar och upprätthålla ögat i en optimal vinkel.
- För att göra ett pilothål cell injektionsvätska, placera i slutet av en steril avfasade 31-gauge insulin nål 1.200-1.500 µm posteriort om limbus med öppnandet av spetsen uppåt.
- Justera vinkeln på insulin nålen så att det är 10-15 grader över sklera (tangerar ett imaginärt plan vid det planerade injektionsstället). Långsamt tränga sklera-åderhinnan anläggningen till en nål djup av ca 500 µm. I pigmenterad råtta försvinner nål slutet' ' under pigmenterade åderhinnan. För varumärket av insulin nål används här, är avståndet från kanylspetsen till avfasningen 500 µm.
- Dra försiktigt ut insulin injektionsnålen (en mycket liten utgjutning av blod kan ses).
- Kraftig blödning noteras, kan ett öga spjut tillämpas för att rensa hålet, om nödvändigt. Fortsatt blödning efter programmet spjut indikerar ett fartyg kan ha skadats.
- Guide RPE cell-loaded injektionsnålen i pilot hål, med öppningen vänd nedåt och med en vinkel på ca 10-15 grader i förhållande till den lokala ytan av sklera.
- Försiktigt in injektorn nålen i den pilot hål till ett djup av ca 500 µm tillgång till subretinalområdet. Det bör finnas om en 100 µm marginal mellan kanten av märket svart penna och den punkt där nålen täcks av pigmenterade åderhinnan (figur 1 c och 1 D).
- Be assistenten till tryck försiktigt in kolven av injektor sprutan för att injicera lämplig volym av celler (ca 1,2 µL). Vara redo att tillhandahålla vissa Counter kraft som assistent pressar på kolven.
Obs: Tidigare håna praxis med assistenten kan ge både kirurg och assistent med nödvändig erfarenhet med detta steg. - Samtidigt som visuellt fokus på pennan markerar kanten, hålla injektorn på plats för 25-30 s och sedan långsamt dra tillbaka injektorn. En liten mängd återflödet är vanligt förekommande.
Obs: Om ingen återflödet observeras, kan det ha varit en intravitreal injektion. Om du ser backflöde genom tätning eller celler fyllning under sklera, var injektionen för grunt. - Skölj av cell utflödet från injektionsstället med den sterila ögondusch 3 gånger och samla överskottet med en bomull applikator.
- Applicera en droppe öga smörjmedel på det opererade ögat och överföra råtta till OCT stationen för att undersöka platsen för transplanterade celler och storleken på den subretinal blåsa.
3. efter injektionen behandling
-
Antiinflammatoriska och smärta smärtstillande behandling
- Injicera buprenorfin 0,1 mg/kg kroppsvikt i saltlösning subkutant för att minska smärta.
- Injicera dexametason på 1,6 mg/kg kroppsvikt i saltlösning av intraperitoneal injektion (I.P.) för inflammation kontroll.
-
Djur återhämtning
- Returnera råtta till återhämtning buren under en värmelampa att upprätthålla kroppstemperaturen.
- Observera det opererade ögat för tecken på blödning.
- Iaktta råttan att säkerställa det kommer ut ur anestesi.
- Tillbaka återvunna djuret till en fräsch bur och flagga buren med kirurgi kort och övervaka dagligen för tecken på ångest, okulär blödning eller grumling av hornhinnan. Veterinären är omedelbart meddela om det finns farhågor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med den teknik som beskrivs i denna artikel, levererat vi konsekvent hRPESC-RPE-celler i subretinalområdet RCS råttor genom att exakt Kontrollera läge, vinkel och djup av de injektorn nål isättning i vävnaden (figur 1B-D ). Följande transplantation, OCT undersökning utfördes omedelbart för att iaktta injektionsstället och den subretinal blåsa skapad av de transplanterade cellerna. Postoperativa OCT utvärdering fungerar som en screeningmetod för att utvärdera kvaliteten på injektioner och övervakning för skada på näthinnan eller blödning. Båda de subretinal blåsa (figur 2A, C och D) och injektionsstället (figur 2A och B) kunde ses tydligt under ULT skanning. Den subretinal blåsa löser vanligtvis i 24 timmar efter injektionen. Även om mätningen av storleken på blebs är svårt med OCT, kan vi uppskatta området blåsa antar att det är lika med området ljusmätare bevarandet av stamcellstransplantation. Vi har tidigare visat att en 1 μl-injektion av 50.000 celler kan leda till sparar ca 6-7% område av RCS näthinnan runt injektion plats13. Som visas i figur 2A, C och D, retinal skikt var intakt vid injektionsstället, inget blod upptäcktes i blåsa, och inga celler observerades i glaskroppen, visar minimala skador orsakade av injektionen. Dessutom ingick också representativa OCT bilder av misslyckade injektioner för referens (figur 2E och F).
Med användning av OCT som en feedback-verktyget optimerat vi vinkel och djup av injektorn nål införande i vävnaden. När optimerad, misslyckas denna metod som tillät oss att uppnå en framgång på 90,8% subretinal tillgång med endast 5,7% kirurgiska, baserat på resultaten av mer än 300 tidigare subretinal injektioner utförs i våra andra studier13 (tabell 1). I de återstående 3,5% utfördes ULT inte av flera skäl, inklusive ögon inte i en lämplig position på grund av isofluran anestesi-associerade öga rullande17.
7 dagar efter transplantation, var manövrerade råtta ögon enucleated, fasta och sektionerad för immunohistological analys. En mänsklig cell nuclear markör (Hunu)18 och en RPE cell markör (OTX2)19 användes för att upptäcka de transplanterade cellerna. Figur 3 visade ett tjockt lager av transplanterade RPE-celler i subretinalområdet som, en vecka efter injektionen var positivt färgas med båda markörer, bekräftar identiteten och framgångsrik leverans av transplantationer. En vecka efter injektionen, kan det stora antalet celler, som visas i figur 3 c, snabbt sjunka till ett litet antal senare på grund av värd immunsvar även i immunsupprimerade RCS råttor20. Som nämnts ovan, hittar dock urartat ljusmätare lagret av RCS råtta ögon räddas i minst 2 månader efter transplantation med hRPESC-RPE13.
Figur 1 : En bild av 4 - veckor gamla P2 hRPESC-RPE-celler och en demonstration av vinkel och djup som injektionsnålen använder under injektionen. (A) en faskontrast bilden av 4 - veckor gamla P2 hRPESC-RPE-celler används för injektion. Skalstapeln = 100 µm. (B) en schematisk visar 600 µm avståndet mellan kanten av markören och spetsen av injektionsnålen mäts av en hur provtagningsutrustningen skall. Minsta graderingen av de hur provtagningsutrustningen skall är 100 µm. (C) en tecknad visar ett tvärsnitt av en råtta öga anatomiska struktur och en sidovy av vinkel och djup som injektionsnålen infogar i ögat väggen. Rat ögat pupilldeformitet axel är 30 grader i förhållande till bordsskivan och injektionsnålen är 15 grader i förhållande till den lokala ytan på ögongloben. (D) en tecknad visar startpunkten av markören på injektorn nål och översta vyn av injektionsstället där 500 µm av injektionsnålen sätts in i vävnaden och en 100 µm utrymme lämnas mellan öppnandet av injektion hålet och kanten av marke r. placeringen av hålet är 1 200-1 500 µm posteriort om limbus. Nålens spets visas på dess sida, men bör vara nedåt under injektionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : OCT bilder av opererade råtta ögat omedelbart efter injektion. (A) en OCT B-scan bild av ett opererade öga som visar en subretinal blåsa och injektion webbplats, utan intravitreala blödningar. (B) en OCT volym intensitet projektion (VIP) bild av en B-scan-serien representerar enface fundus bilden av det injicerade området. Liten injektionsstället är synlig i VIP bilden visar det minimala trauman. (C) en förstorad OCT bild av (A) visar de transplanterade cellerna i subretinalområdet med alla retinala lager markerade. Denna bild visade att det fanns de transplanterade cellerna i subretinalområdet. (D) en OCT B-scan-bild som visar en genomsnittlig storlek subretinal blåsa. (E) en OCT B-scan bild visar en misslyckad subretinal injektion med CS ligger i intravitreala utrymmet. (F) en OCT B-scan-bild som visar en misslyckad subretinal injektion med den hela näthinnan narr genom vid injektionsstället. Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Immunohistological färgning av retinal fryst sektioner efter transplantation av hRPESC-RPE-cellerna. (A) mänsklig cell nuclear markör (Hunu) färgning som anger detektion av transplanterade mänskliga RPE-celler. (B, E) Cell nuclear counter färgning (4', 6-diamidin-2-fenylindol; DAPI) visar de retinala lagrarna, transplantation och RPE lager. (C) A sammanslagna bilden av Hunu och DAPI indikerar att transplanterade hRPE cellerna ligger i subretinalområdet. Separationen mellan transplantation och RPE lager är en bearbetning artefakt är associerad med kryo-skydda RCS ögon för frusna snitt. (D) RPE cell markör (OTX2) färgning av transplanterade mänskliga RPE-cellerna. (F) en sammanslagen bild av OTX2 och DAPI. Skalstapeln = 20 mikroM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Totala injicerade RCS råtta ögon | Bra subretinal blebs under OCT | Liten subretinal blebs under OCT | Totala icke-komplicerade subretinal blebs under OCT | Complicatd subretinal blebs under OCT (dvs luftbubbla eller retinal blödning) | Ingen OCT utförs | Kirurgiska misslyckas (ingen subretinal blåsa under OCT) | |
| Greve | 314 | 260 | 25 | 285 | 5 | 6 | 18 |
| % av totala injicerade ögon | ------ | 82.80% | 7.96% | 90.76% | 1,59% | 1.91% | 5,73% |
| (Dessa uppgifter sammanfattas från tio kohorter av subretinal injektioner i RCS råttor) | |||||||
Tabell 1: En sammanfattning av subretinal injektioner från tio experimentella kohorter i RCS råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den subretinal injektionsteknik som skildras i denna artikel är via trans-skleral vägen, där injektionsnålen penetrerar de yttre skikten (sklera-åderhinnan-RPE complex) av ögat väggen utan att skada neurala näthinnan eller störande glaskroppsrummet. Alternativa trans-vitreal tillvägagångssätt har en potentiell risk för objektiv skador leder till katarakt, eftersom gnagare lins upptar huvuddelen av glaskroppsrummet. Jämfört med denna metod, vår teknik är mindre riskabelt och orsakar minimal trauma som injektionsnålen inte behöver gå över hela glaskroppsrummet att nå subretinalområdet. Faktiskt, OCT undersökningar i våra studier visade mycket sällsynta retinal penetration evenemang och i uppföljande prov i djur, finns det ingen ihållande retinala avskildhetar. Dessutom injektionsstället är mycket liten (< 200 µm i diameter) när använder en 33-gauge injektorn nål så strukturell störning av sklera-åderhinnan-RPE anläggningen är mycket begränsad. Efter nålen returgående fas, injektion hålet själv tätar automatiskt så inga stygn eller vävnad lim behövs.
Komplikationer med operationen är kraftig blödning runt injektionsstället eller inifrån pilothålet. När du använder pincett för att greppa bindhinnan marginalen limbus, behövs endast mild kraft att undvika klämmande blodkärlen och minska eventuella blödningar. Innan du skapar pilothålet, undersöka avsedda injektionsstället för att undvika inträngning av ytliga blodkärl. Genom att använda ett spjut, kan pilothålet rensas av blod före insättning av cell injektionsnålen. Om blödning från pilothålet kvarstår efter några tillämpningar av spjutet, kan ett fartyg ha brutits. En annan komplikation som vi observerat är en liten andel av RCS råttor utveckla hornhinneopacitet postoperativt. I vissa fall opaciteter var kronisk och andra var övergående. Djur med ihållande opaciteter togs bort från study group. Hornhinnan kan utvecklas på grund av torra ögon, fysisk skada, inflammation, droger eller kemisk irritation21. För att minska deras bildning, ögat bör hållas fuktig genom att upprätthålla gott öga smörjning, och undvika att röra hornhinnan med en bomull applikator eller andra verktyg under operationen.
Injektion protokollet beskrivs här använder definierade strategi vinklar och nål djup i förhållande till okulär sevärdheter, och ögat vinklar i förhållande till tabellen kirurgiska i vår uppställning. Användning av efter injektion OCT skanningar var viktig i raffinering parametrarna injektion för att få reproducerbara kontroll av RPE stamcellstransplantation i råttornas subretinalområdet med hög noggrannhet. När behärskar genom upprepad praxis, är metoden enkel att utföra. Rekommenderas, särskilt i utbildning, att postoperativa okulär tentor utförs för att fastställa resultatet. Vinkel och djup injektion nål kommer sannolikt behov justeringen med detta på denna feedback beroende på kirurgisk set-up, ålder av djur, eller om andra djurarter används (t.ex., mus).
För att utvärdera injektion och bestämma inbegripandet eller uteslutandet från en studie, är förekomsten av subretinal blödde från OCT observation kritisk. I laboratorier, där OCT är tillgänglig, de kriterier som beskrivs nedan kan användas för en snabb screening av kirurger för att utesluta misstänkt injektionen misslyckas: (1) före injektion: (a) Pilot hål görs för djupt (dvs, betydande djup > 500 µm; för den märke av insulin nål används här, avståndet från kanylspetsen till mitten av avfasningen är 500 µm). (b) pilothål blöder överdrivet (dvsblödning inte kan stoppas tillämpar kraft på hålet med ögat spjut). (c) injektionsnål går för djupt (dvs, betydande djup > 500 µm eller markören på injektionsnålen går in i sklera/åderhinnan/RPE komplex vävnad). (2) under injektion: (a) Det går inte att upprätthålla injektionsnålen i pilothålet under injektionen. (b) läckage omedelbart runt injektionsnålen under injektionen. (c) injektionsnål skjuts för djupt (dvs, markören på injektionsnålen går in i sklera/åderhinnan/RPE komplex vävnad) som märkt av kirurgen under injektionen. (d) Det går inte att upprätthålla injektionsnålen i position för mer än 5 sekunder efter injektionen. (e) överdriven blod när Upprullningskraften injektionsnålen. f inga återflödet/efflux sett efter indragning av injektionsnålen när de kombineras med steg 2.
Tillsammans med noggrann hantering av nålen plats, vinklar och djup, den trans-skleral subretinal injektionstekniken är mycket tillförlitlig, korrekt och kan bära minimala kirurgiskt trauma. Med alla dessa fördelar, kan denna teknik användas inte bara för leverans av RPE-celler, men också för andra celltyper, föreningar eller genterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Patty Lederman för hennes hjälp på kirurgi och Susan Borden för RPE cell beredning. Vi erkänner också NYSTEM C028504 för finansieringen av detta projekt. Justine D. Miller stöds av NIH bevilja F32EY025931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P.
