Iniezione subretinal è stato ampiamente applicato negli studi preclinici di terapia sostitutiva delle cellule staminali per degenerazione maculare senile. In questo articolo visualizzato in quel momento, descriviamo una tecnica di iniezione subretinal meno rischioso, riproducibile e precisamente modificati tramite l'approccio trans-sclerale per fornire cellule negli occhi del ratto.
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Articolo metodologico
Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malattie degenerative retiniche come la degenerazione maculare senile (AMD) sono la principale causa di perdita irreversibile di visione in tutto il mondo. AMD è caratterizzata dalla degenerazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE), che sono un monostrato di cellule funzionalmente sostenendo e anatomicamente avvolgendo intorno alla retina neurale. Gli attuali trattamenti farmacologici per non neovascular AMD (AMD secca) solo rallentano la progressione della malattia ma non possono ripristinare la visione, che necessitano di studi finalizzati ad individuare nuove strategie terapeutiche. Sostituendo le cellule RPE degenerative con cellule sane detiene promessa per il trattamento di AMD secca in futuro. Vasti studi preclinici di terapie di sostituzione della cellula staminale per AMD prevedono il trapianto di cellule staminali derivate cellule RPE nello spazio subretinal di modelli animali, in cui viene applicata la tecnica di iniezione subretinal. L'approccio più frequentemente utilizzato in questi studi sugli animali preclinici è attraverso la via trans-sclerale, che è reso difficile dalla mancanza di visualizzazione diretta dell'estremità dell'ago e spesso può provocare danni alla retina. Un approccio alternativo attraverso il vitroso consente per l'osservazione diretta della posizione di estremità dell'ago, ma trasporta un alto rischio di traumi chirurgici come altri tessuti dell'occhio sono disturbati. Abbiamo sviluppato un metodo di iniezione trans-sclerale modificate meno rischioso e riproducibile che utilizza aghi definito diverse angolazioni e profondità correttamente e costantemente fornire cellule RPE nello spazio subretinal ratto ed evitare eccessivi danni alla retina. Trasportati in questo modo le cellule sono state dimostrate in precedenza per essere efficace nel ratto Royal College of Surgeons (RCS) per almeno 2 mesi. Questa tecnica può essere utilizzata non solo per trapianto di cellule, ma anche per la consegna di piccole molecole o terapie geniche.
Introduzione
La retina umana situato sul retro le funzioni dell'occhio come un leggero tessuto sensoriale e svolge un ruolo critico nella percezione visiva. Disfunzione delle cellule retiniche o morte delle cellule di conseguenza causa problemi alla vista o cecità permanente. Disordini che coinvolgono la degenerazione o disfunzione delle cellule in diversi strati della retina sono conosciuti come malattie degenerative retiniche, tra cui AMD è il tipo più comune e la causa principale di cecità irreversibile negli anziani nei paesi sviluppati 1,2. Il processo patologico di AMD è associato con accumulazione "drusen" tra lo st....
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Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso la State University di New York Albany.
1. pre-iniezione preparazione
-
Preparazione di una sospensione di cellule hRPESC-RPE
Nota: Le seguenti operazioni vengono eseguite in cappuccio sterili per coltura ed è necessario avere familiarità con base tecnica sterile.- Isolare le cellule di hRPE primario da donatore umano occhi invecchiati 50-90 anni e cellule di coltura in piastre da 24 pozzetti12. Crioconservare le cellule al passaggio 1, disgelo secondo ne....
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Risultati
Utilizzando la tecnica descritta in questo articolo, abbiamo consegnato costantemente le cellule hRPESC-RPE nello spazio subretinal dei ratti RCS con precisione il controllo della posizione, angolo e profondità dell'inserimento dell'ago dell'iniettore nel tessuto (Figura 1B-D ). Immediatamente dopo trapianto, un esame OCT è stato effettuato per osservare il sito di iniezione e la vescichetta subretinal creato dalle cellule trapiantate. Valutazione post-ch.......
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Discussione
La tecnica di iniezione subretinal illustrata in questo articolo è via la via trans-sclerale, dove l'ago dell'iniettore penetra gli strati più esterni della parete dell'occhio (sclera-coroide-RPE complesso) senza danneggiare la retina neurale o disturbare la cavità vitrosa. Un approccio alternativo trans-vitreal ha un potenziale rischio di danno di lente che porta alla cataratta, dal momento che l'obiettivo dei roditori occupa la maggior parte della cavità vitrosa. Rispetto a questo metodo, la nostra tecnica è meno risch.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare Patty Lederman per la sua assistenza sulla chirurgia e Susan Borden per preparazione delle cellule RPE. Riconosciamo anche NYSTEM C028504 per il finanziamento per questo progetto. Justine d. Miller è supportato da NIH concedere F32EY025931.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAsi I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e Magnesio (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Soluzione salina bilanciata sterile (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Lavaocchi sterile | Moore Medical | 75519 | |
| Soluzione fisiologica sterile 0,9% | Hospira | 488810 | |
| Proparacaina cloridrato Soluzione oftalmica (0,5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Soluzione oftalmica Tropicamide, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Fenileferina Soluzione Oftalmica, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | Questo è usato per produrre 2,5% fenileferina |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| desametasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% etanolo | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% etanolo | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Gocce oculari sterili Systane Ultra Lubricant Alcon | 00065143105 | ||
| cellule hRPESC-RPE | Non disponibile in | Fare riferimento al "Riferimento #12" per l'isolamento e la manutenzione delle cellule. | |
| Piastre a 24 pozzetti | Corning | 3526 | |
| Provette coniche (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Tappo per microcentrifuga con o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Provette per microcentrifuga senza tappo (1,7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5804R | |
| Salvietta sterile imbevuta di alcol | McKesson | 58-204 | |
| Applicatori sterili per punte in cotone | McKesson | 24-106-2S | |
| lance sterili Weck-Cel | Beaver-Visitec International | ||
| Teli chirurgici sterili | McKesson | 25-515 | |
| Garza | McKesson | 16-4242 | |
| Siringa Nanofil (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Ago smussato calibro 33 | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Aghi per siringhe da insulina calibro 31 | Becton Dickinson | 328418 | |
| Pinze dentate per topi | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Forbici a molla per dissezione | Roboz | RS-5602 | |
| Pompa a T per circolazione dell'acqua | Stryker | TP700 | |
| Termoforo | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Sistema di anestesia animale | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Bilancia | Ohaus | PA1502 | |
| Stereomicroscopio | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Sorgente luminosa per microscopio | Schott | serie | |
| ACEBioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Pennarello nero sterile | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Scala di misurazione in miniatura | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Lampada spot a infrarossi per crogiolarsi | EXO-TERRA | PT2144 | Viene utilizzata come lampada riscaldante per gli animali durante la fase di recupero post-chirurgico |
Riferimenti
- De Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic revi....
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Ristampe e permessi
